楊新榮，竇 霞，李國峰，宋沁潔，李咸慰，吳紅偉，李東輝，辛二旦，孫宇靖，張育貴，邊甜甜，李越峰*

基于多成分質(zhì)量控制的柴芍疏肝調(diào)神膠囊制備工藝研究

楊新榮1, 2, 3，竇 霞3，李國峰1, 2，宋沁潔1, 2，李咸慰1, 2，吳紅偉1, 2，李東輝1, 2，辛二旦3，孫宇靖1, 2，張育貴1, 2，邊甜甜1, 2，李越峰1, 2*

1. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000 2. 甘肅省中藥制藥工藝工程研究中心，甘肅 蘭州 730000 3. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000

以經(jīng)典名方四逆散為基礎(chǔ)加減得柴芍疏肝調(diào)神方，將其制備為柴芍疏肝調(diào)神膠囊（Chaishao Shugan Tiaoshen Capsules，CSTC），對其進(jìn)行制備工藝優(yōu)化和多成分質(zhì)量控制研究。采用水提醇沉、濕法制粒、填充制備成CSTC。選取6種指標(biāo)成分辛弗林、梔子苷、芍藥苷、甘草苷、柚皮苷和甘草酸銨的含量，以其綜合評分為指標(biāo)，嚴(yán)格考察料液比、提取次數(shù)、提取時間、藥液相對密度、醇沉濃度、醇沉?xí)r間對水提醇沉精制工藝的影響。另以休止角、堆密度、成型率、吸濕率的綜合得分為條件，篩選輔料種類、輔料比、藥輔比、95%乙醇用量對成型工藝的影響。得到CSTC劑的最佳制備工藝為料液比1∶12，提取次數(shù)2次，提取時間69 min，藥液相對密度1.15（50 ℃），醇沉乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，醇沉?xí)r間36 h，輔料為糊精＋微晶纖維素（3∶2），藥輔比（1∶1），95%乙醇用量占藥輔量的23%。優(yōu)選的制備工藝，科學(xué)合理，可行性高，可以為CSTC及相關(guān)中藥制劑的開發(fā)提供參考，為其質(zhì)量控制評價提供依據(jù)。

四逆散；柴芍疏肝調(diào)神膠囊；標(biāo)準(zhǔn)膠囊；Box-Behnken響應(yīng)面法；正交試驗；制備工藝；質(zhì)量控制；辛弗林；梔子苷；芍藥苷；甘草苷；柚皮苷；甘草酸銨；休止角；堆密度；成型率；吸濕率

四逆散為“醫(yī)圣”張仲景的經(jīng)典名方，始記載于《傷寒論》少陰篇，由柴胡、枳實、芍藥、炙甘草4味組成，具有透邪解郁、疏肝理脾之功效，適用于肝失疏泄引發(fā)的肝脾不和之癥[1]。其組方精簡、配伍嚴(yán)謹(jǐn)，是疏肝解郁首方[2]。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，其在失眠[3]、焦慮[4]和抑郁[5]等精神障礙類疾病的治療中有顯著優(yōu)勢，且還具有一定的“安神”功效[6]。而本課題組前期大量研究和連續(xù)6年臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)，由四逆散加味而成的柴芍疏肝調(diào)神方在防治失眠、焦慮和抑郁方面的效果要優(yōu)于四逆散。全方由柴胡、白芍、枳實、梔子、炙甘草、制遠(yuǎn)志、酸棗仁、枸杞子、石決明9味藥組成。方中柴胡疏肝解郁，白芍養(yǎng)血柔肝，二藥相伍，補肝體而助肝用，共為君藥；枸杞子，補肝陰而益肝體，增強白芍養(yǎng)血之作用，酸棗仁滋陰安神，既可助白芍以養(yǎng)肝血補肝體，又可寧心安神，遠(yuǎn)志寧心安神，一則與酸棗仁相伍以養(yǎng)心安神，一則防諸藥滋膩之性共為臣藥；枳實助柴胡理氣解郁，一升一降，斡旋氣機，梔子清熱涼肝，一鎮(zhèn)一清，使陽潛氣平，肝得以正常疏泄，石決明重鎮(zhèn)平肝，共為佐藥；甘草調(diào)和諸藥，補養(yǎng)中州，脾氣健忘則肝木不得橫逆，為使藥；諸藥相伍，共奏疏肝理氣，寧心調(diào)神，清熱除煩之功。全方具有疏肝理氣，寧心調(diào)神，清熱除煩的功效，用于胸脅脹滿疼痛，心煩易怒，失眠多夢、頭痛、失眠、焦慮、抑郁等癥的治療。

經(jīng)典名方是我國中醫(yī)藥領(lǐng)域的寶藏，自國家《古代經(jīng)典名方目錄》頒布以來，有關(guān)其物質(zhì)基準(zhǔn)和制劑開發(fā)的研究備受青睞[7]。因此，結(jié)合6種指標(biāo)成分辛弗林、梔子苷、芍藥苷、甘草苷、柚皮苷和甘草酸銨含量的綜合得分變化，考察料液比、提取次數(shù)、提取時間、藥液相對密度、醇沉濃度、醇沉?xí)r間、休止角、堆密度、成型率、吸濕率對柴芍疏肝調(diào)神膠囊（Chaishao Shugan Tiaoshen Capsules，CSTC）的影響，進(jìn)一步篩選出CSTC最佳制備工藝，以期為今后CSTC劑及其相關(guān)制劑的研究提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀，美國安捷倫公司公司；BT125D型十萬分之一天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；PL-S60型超聲波清洗器，東莞康士潔超聲波科技有限公司；L2-5K型臺式低俗離心機，湖南可成儀器設(shè)備有限公司；DHG-9123A型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀有限公司；FLP- 500A高速多功能搖擺粉碎機，上海菲力博實業(yè)公司；標(biāo)準(zhǔn)檢驗篩，10、18、20、80、100目，浙江上虞市金鼎標(biāo)準(zhǔn)篩具廠；0#100孔膠囊板膠囊灌裝板，浙江誠摯精密機械有限公司。

1.2 材料

1.2.1 對照品 辛弗林（批號PS000966）、梔子苷（批號PS001144）、芍藥苷（批號PS000826）、甘草苷（批號PS012028）、柚皮苷（批號PS001114）、甘草酸銨（批號PS011584）均購自成都普思生物科技股份有限公司，所有對照品質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%。

1.2.2 試劑 甲醇（色譜純，批號20210515，體積分?jǐn)?shù)≥99.9%）、乙腈（色譜純，批號20210515，體積分?jǐn)?shù)≥99.9%）、異丙醇（色譜純，批號20200815，體積分?jǐn)?shù)≥99.8%）、無水乙醇（分析純，批號20210301，體積分?jǐn)?shù)≥99.7%）均購自天津市大茂化學(xué)試劑廠；磷酸水（分析純，批號20150707，體積分?jǐn)?shù)≥85%），天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；水為娃哈哈飲用純凈水。糊精（批號20190301）和可溶性淀粉（分析純，批號20200901）均為天津市大茂化學(xué)試劑廠；微晶纖維素（批號20210916）廠家為湖南新綠方藥業(yè)有限公司；磷酸氫鈣（批號20180601，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）廠家為天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；0號膠囊，浙江省浦江縣恩爾康膠囊有限公司。

1.2.3 藥材 實驗用CSTC的9味飲片如下：柴胡為傘形科柴胡屬植物柴胡DC.的干燥根、白芍為毛茛科芍藥屬植物芍藥Pall.的干燥根、枸杞子為茄科枸杞屬植物寧夏枸杞L.的干燥成熟果實、酸棗仁為鼠李科棗屬植物酸棗Mill. var.(Bunge) Hu ex H. F. Chou的干燥成熟種子、遠(yuǎn)志為遠(yuǎn)志科遠(yuǎn)志屬植物遠(yuǎn)志W(wǎng)illd.的干燥根、枳實為蕓香科柑橘屬植物酸橙L.及其栽培變種的干燥未成熟果實、梔子為茜草科梔子屬植物梔子Ellis的干燥成熟果實、石決明為鮑科鮑屬動物雜色鮑Reeve的貝殼、炙甘草為豆科甘草屬植物甘草Fisch.的干燥根和根莖，均為市售飲片，購自蘭州惠仁堂藥房，具體信息見表1，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院王明偉副教授鑒定，均符合《中國藥典》2020年版要求。

表1 CSTC所用飲片來源信息

2 方法與結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)膠囊劑的制備

分別按處方取白芍、枸杞子、酸棗仁、遠(yuǎn)志、枳實、梔子、石決明、炙甘草適量開展預(yù)實驗。以料液比（1∶10）、提取次數(shù)（1次）、提取時間（60 min）、藥液相對密度（1.15）、醇沉乙醇體積分?jǐn)?shù)（50%）、醇沉?xí)r間（12 h），獲得干浸膏。將所得干浸膏與適量柴胡一起混合粉碎，過100目篩（6號篩），根據(jù)輔料種類為糊精＋微晶纖維素（1∶1）、藥物與輔料比（1∶1）、95%乙醇用量占藥輔量20%的預(yù)實驗條件制粒，低溫干燥（50 ℃），18目整粒，填充0號膠囊得到CSTC標(biāo)準(zhǔn)膠囊劑（0.25 g/粒）。

2.2 多指標(biāo)含量測定方法學(xué)考察

2.2.1 對照品溶液的制備 取辛弗林、梔子苷、芍藥苷、甘草苷、柚皮苷和甘草酸銨對照品適量，精密稱定，置于10 mL量瓶中，加入甲醇定容，制成質(zhì)量濃度分別為30.75、69.00、97.75、19.50、163.25、49.00 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備 根據(jù)膠囊載藥量及預(yù)實驗結(jié)果，取“2.1”項下制備的CSTC內(nèi)容物2 g，將其置于50 mL量瓶內(nèi)，加甲醇定容，超聲溶解30 min（功率200 W，頻率40 kHz），混勻，4000 r/min離心15 min（離心半徑140 mm），取上清液，即為CSTC供試品溶液。

2.2.3 色譜條件 色譜柱為Agilent Technologies 1260 Infinity C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為甲醇-0.05%磷酸水溶液，最佳梯度洗脫：0～5 min，2%～8%甲醇；5～12 min，8%～22%甲醇；12～40 min，22%～50%甲醇；40～50 min，50%～65%甲醇；50～62 min，65%～85%甲醇；62～72 min，85%～95%甲醇；72～86 min，95%～100%甲醇；體積流量0.8 mL/min；檢測波長228 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。在此條件下供試品溶液中的辛弗林、梔子苷、芍藥苷、甘草苷、柚皮苷和甘草酸銨與其他成分分離良好，色譜圖見圖1。

1-辛弗林 2-梔子苷 3-芍藥苷 4-甘草苷 5-柚皮苷 6-甘草酸銨

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取混合對照品溶液，制成6個不同質(zhì)量濃度的系列對照品溶液，按照“2.2.3”項下色譜條件進(jìn)行測定，并記錄色譜峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)（），對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸，得6個指標(biāo)成分的線性回歸方程分別為辛弗林＝3.978 4－1.251 7，＝0.999 8，線性范圍3.84～123.0 μg/mL；梔子苷＝12.86＋60.759，＝0.999 8，線性范圍8.63～276.0 μg/mL；芍藥苷＝16.251＋40.269，＝0.999 9，線性范圍12.23～211.7 μg/mL；甘草苷＝34.703＋46.504，＝0.999 8，線性范圍2.44～78.0 μg/mL；柚皮苷＝23.451＋265.18，＝ 0.999 9，線性范圍20.41～653.00 μg/mL；甘草酸銨＝7.209 2＋87.834，＝0.999 8，線性范圍6.13～196.0 μg/mL。

2.2.5 精密度試驗 取同一批CSTC樣品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.3”項色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，測得辛弗林、梔子苷、芍藥苷、甘草苷、柚皮苷和甘草酸銨峰面積的RSD分別為2.92%、1.96%、2.63%、1.30%、0.96%、1.60%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗 取同一批CSTC供試品溶液，按“2.2.3”項下色譜條件，分別于制備后0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣測定，記錄峰面積，測得辛弗林、梔子苷、芍藥苷、甘草苷、柚皮苷和甘草酸銨峰面積的RSD分別為2.75%、0.89%、2.03%、1.56%、0.67%、2.37%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗 取同一批CSTC樣品，按照“2.2.2”項下方法平行制備供試品溶液6份，在“2.2.3”項色譜條件下進(jìn)樣分析，記錄峰面積并計算各成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)，測得辛弗林、梔子苷、芍藥苷、甘草苷、柚皮苷和甘草酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD分別為2.13%、1.44%、2.08%、1.99%、1.55%、1.80%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗 取同一批CSTC樣品（S1）內(nèi)容物1 g，平行6份，分別加入“2.2.1”項下的混合對照品溶液5 mL，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.3”項色譜條件下進(jìn)樣分析，記錄峰面積并計算各成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)及其加樣回收率，測得辛弗林、梔子苷、芍藥苷、甘草苷、柚皮苷和甘草酸銨的平均加樣回收率分別為99.50%、100.29%、100.56%、99.78%、99.55%、99.69%，RSD分別為1.71%、1.37%、1.67%、2.85%、1.15%、2.47%，表明所建立含量測定方法準(zhǔn)確度良好。

2.2.9 樣品測定 取同一批CSTC樣品，按照“2.2.2”項下方法平行制備供試品溶液，在“2.2.3”項下色譜條件進(jìn)樣測定，計算辛弗林、梔子苷、芍藥苷、甘草苷、柚皮苷和甘草酸銨的質(zhì)量分?jǐn)?shù)依次為0.51、9.24、5.24、0.92、8.97、4.13 mg/g。

2.3 水提工藝研究

2.3.1 綜合評分計算 熵權(quán)法是根據(jù)各項指標(biāo)值的變異程度來確定指標(biāo)權(quán)數(shù)的客觀賦權(quán)法，其熵值越小，提供的信息量就越大，其在綜合評價中所起的作用也越大，即所占權(quán)重就越大。其具體算法如下所示。

①用公式（1）對數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

X′＝(X－min)/(max－min) （1）

X′為各個指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)，X為第個指標(biāo)下第組的含量，min為每個指標(biāo)下測得的含量最小值，max為每個指標(biāo)下測得的含量最大值

②再用公式（2）、（3）、（4）計算各指標(biāo)的信息熵（E）。

＝1/ln（3）

E＝?PlnP（4）

P為第個指標(biāo)下第組的概率，且0≤P≤1，為樣本數(shù)對數(shù)的倒數(shù)，為實驗中的樣本數(shù)

③最后用公式（5）計算權(quán)重系數(shù)（W）。

本實驗結(jié)合熵權(quán)法最終測得辛弗林、梔子苷、芍藥苷、甘草苷、柚皮苷和甘草酸銨的權(quán)重系數(shù)分別為0.227、0.108、0.170、0.128、0.184、0.182。

綜合評分（）＝辛弗林質(zhì)量分?jǐn)?shù)×0.227＋梔子苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)×0.108＋芍藥苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)×0.170＋甘草苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)×0.128＋柚皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)×0.184＋甘草酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)×0.182

2.3.2 料液比考察 按處方配比取所需飲片適量，以提取次數(shù)（1次）、提取時間（60 min）為固定量，考察不同料液比對辛弗林、梔子苷、芍藥苷、甘草苷、柚皮苷和甘草酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響，結(jié)果見表2。結(jié)合綜合評分法優(yōu)選得最佳料液比為1∶10。

2.3.3 提取次數(shù)考察 按處方配比取所需飲片適量，以提取時間（60 min）、料液比（1∶10）為固定量，考察不同提取次數(shù)對辛弗林、梔子苷、芍藥苷、甘草苷、柚皮苷和甘草酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響結(jié)果見表3。結(jié)合綜合評分法優(yōu)選得最佳提取次數(shù)為2次。

2.3.4 提取時間考察 按處方配比取所需飲片適量，以料液比（1∶10）、提取次數(shù)（2次）為固定量，考察不同提取時間下，辛弗林、梔子苷、芍藥苷、甘草苷、柚皮苷和甘草酸銨的質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化，結(jié)果見表4。結(jié)合綜合評分法優(yōu)選得最佳提取時間為60 min。

2.3.5 Box-Behnken設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化最佳水提工藝 在以上考察試驗的基礎(chǔ)上，分別選取料液比（1）、提取次數(shù)（2）、提取時間（3）作為自變量，采用Design Expert 8.0.6軟件中的Box-Behnken響應(yīng)面試驗設(shè)計方法，以辛弗林、梔子苷、芍藥苷、甘草苷、柚皮苷和甘草酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為因變量，依據(jù)其綜合評分優(yōu)選最佳水提取工藝參數(shù)[10]，因素水平及試驗設(shè)計與結(jié)果見表5。

表2 不同料液比對6種指標(biāo)成分及Y的影響

表3 不同提取次數(shù)對6種指標(biāo)成分及Y的影響

表4 不同提取時間對6種指標(biāo)成分及Y的影響

對表中實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行多元線性和非線性回歸分析，得到綜合評分（）對料液比（1）、提取次數(shù)（2）和提取時間（3）的2次回歸模型方程：＝10.04＋0.281 31＋0.555 02＋0.586 33＋0.5512－0.077 513＋0.4123－1.0712－0.691 322－0.893 732。模型＝54.21，＜0.000 1，失擬項＞0.05不顯著，表明該模型具有較高的可靠性，相關(guān)系數(shù)（）＝0.992 9，校正系數(shù)（adj）＝0.983 7，變異系數(shù)（CV）＝2.25%，模型信噪比＝19.167 1＞4，表明該模型擬合度良好，試驗誤差小，可用此模型對綜合評分進(jìn)行分析和預(yù)測[11]。

表5 Box-Behnken設(shè)計-響應(yīng)面法試驗設(shè)計與結(jié)果

方差分析結(jié)果見表6，自變量1次項2、3，2次項12、32極顯著（＜0.001），1次項1、2次項22、交互項12、23顯著（＜0.01）；表明1和2、2和3之間有交互作用、模型具有統(tǒng)計學(xué)意義，各因素對值的影響順序為提取時間（3）＞提取次數(shù)（2）＞料液比（1）。

此外，結(jié)合回歸方程所繪制所得各因素交互作用的響應(yīng)面及等高線圖發(fā)現(xiàn)，等高線圖呈橢圓型表示2因素交互作用較強，圓形則表示交互作用較弱；響應(yīng)面圖越陡峭則2因素交互作用越強，反之，則越弱，具體見圖2。由Design Expert 8.0.6軟件預(yù)測最佳水提取工藝為料液比11.30、提取次數(shù)2.47次、提取時間68.44 min，綜合評分為10.39分。

2.3.6 模型驗證試驗 結(jié)合實際生產(chǎn)情況，可將最佳水提取優(yōu)選工藝參數(shù)調(diào)整為料液比（1∶12）、提取次數(shù)2次、提取時間69 min，并按照此工藝進(jìn)行3批次驗證實驗，結(jié)果見表7，得其綜合評分平均值為10.20，RSD為0.54%，與預(yù)測值（10.39）較接近，表明該優(yōu)化水提取工藝穩(wěn)定、重復(fù)性好、可操作性強。

表6 方差分析結(jié)果

圖2 各因素交互作用對CSTC水提取工藝綜合評分的響應(yīng)面和等高線

2.4 醇沉淀精制工藝研究

因中藥水提液雜質(zhì)較多，為減少患者服用量，提高制劑穩(wěn)定性，則進(jìn)行醇沉精制工藝優(yōu)化。根據(jù)以上所得的最佳水提取工藝參數(shù)，連續(xù)提取3次，合并藥液，4000 r/min離心15 min，取上清液。分別以藥液相對密度、醇沉乙醇體積分?jǐn)?shù)和醇沉?xí)r間作為考察因素、同時以各指標(biāo)成分綜合評分（，權(quán)重系數(shù)0.85）及干膏得率（權(quán)重系數(shù)0.15）作評價指標(biāo)對醇沉精制工藝作綜合評分（），＝/max× 85＋干膏得率min/干膏得率×15[12]。的具體算法同“2.3.1”項。

表7 驗證試驗結(jié)果(n = 3)

2.4.1 藥液相對密度考察 取“2.3.6”項下所得藥液100 mL，以醇沉乙醇體積分?jǐn)?shù)（50%）、醇沉?xí)r間（12 h）為固定量，考察不同藥液相對密度條件下辛弗林、梔子苷、芍藥苷、甘草苷、柚皮苷和甘草酸銨的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表8。結(jié)合綜合評分法優(yōu)選得最佳藥液相對密度為1.15。

表8 不同藥液相對密度對各考察指標(biāo)的影響

2.4.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)考察 取“2.3.6”項下所得藥液100 mL，以醇沉?xí)r間（12 h）、藥液相對密度（1.15）為固定量，考察不同乙醇體積分?jǐn)?shù)條件下辛弗林、梔子苷、芍藥苷、甘草苷、柚皮苷和甘草酸銨的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表9。結(jié)合綜合評分法優(yōu)選得最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%。

2.4.3 醇沉?xí)r間考察 取“2.3.6”項下所得藥液100 mL，以藥液相對密度（1.15）、乙醇體積分（60%）為固定量，考察不同醇沉?xí)r間條件下辛弗林、梔子苷、芍藥苷、甘草苷、柚皮苷和甘草酸銨的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表10。并結(jié)合綜合評分法優(yōu)選得最佳醇沉?xí)r間是24 h。

表9 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對各考察指標(biāo)的影響

表10 不同醇沉?xí)r間對各考察指標(biāo)的影響

2.4.4 醇沉精制正交試驗設(shè)計 在以上醇沉單因素考察試驗的基礎(chǔ)上，分別選取藥液相對密度（A）、醇沉乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）、醇沉靜置時間（C）作為自變量，采用SPSS 25正交試驗設(shè)計方法，以辛弗林、梔子苷、芍藥苷、甘草苷、柚皮苷和甘草酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為評價指標(biāo)，依據(jù)其綜合得分（），采用L9(34)表進(jìn)行正交試驗，優(yōu)選出最佳的醇沉精制工藝[13]。因素水平及試驗設(shè)計與結(jié)果見表11。

由正交試驗直觀分析表明，3個主要因素對CSTC醇沉精制工藝的影響程度依次是C（醇沉靜置時間）＞A（藥液相對密度）＞B（乙醇體積分?jǐn)?shù)），各因素不同水平程度依次是A3＞A2＞A1、B2＞B3＞B1、C3＞C2＞C1，再通過方差分析（表12）進(jìn)一步分析，C（醇沉靜置時間）對醇沉精制環(huán)節(jié)的影響有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05）。而A（藥液相對密度）和B（乙醇體積分?jǐn)?shù)）對醇沉精制環(huán)節(jié)的影響沒有統(tǒng)計學(xué)意義（＞0.05）。綜合評分表明最佳水提工藝為A2B2C3，即藥液相對密度1.15，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，醇沉靜置時間36 h。

2.4.5 驗證試驗 結(jié)合實際操作，根據(jù)擬合的最優(yōu)條件，可將最佳醇沉工藝參數(shù)調(diào)整為藥液相對密度1.15、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、醇沉靜置時間36 h。并據(jù)此條件進(jìn)行3次驗證實驗，結(jié)果見表13。得其綜合評分平均值為98.69，RSD為1.11%，與預(yù)測值（98.88）較接近，表明該醇沉精制工藝質(zhì)量穩(wěn)定、重現(xiàn)性好、可操作性強。

表11 醇沉精制工藝L9(34)正交試驗設(shè)計與結(jié)果

表12 醇沉精制工藝方差分析結(jié)果

0.05(2, 2) = 19.000.01(2, 2) = 99.00

2.5 CSTC中顆粒劑成型工藝考察

2.5.1 CSTC中顆粒劑的制備 取柴胡飲片適量，低溫干燥（50 ℃），與“2.4.5”項下所得干浸膏一起粉碎，過100目篩（6號篩）。取適量細(xì)粉進(jìn)行粉體學(xué)考察，采用固定漏斗法[14]，平行測定3次，得其平均休止角為42.30°。表明其流動性較差，不適合直接裝膠囊，故應(yīng)加入輔料制成相應(yīng)顆粒以增加其流動性。

表13 L9(34)正交實驗優(yōu)化法的驗證(n = 3)

2.5.2 潤濕劑的考察 取“2.5.1”項下細(xì)粉適量，以不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇做潤濕劑，考察其制軟材的情況，結(jié)果見表14，由結(jié)果知選擇95%乙醇作潤濕劑、制軟材較好。

2.5.3 輔料種類的考察 輔料決定了膠囊內(nèi)容物顆粒的吸濕性、流動性和成型性。據(jù)文獻(xiàn)報道中藥制劑中常用的輔料有：可溶性淀粉、微晶纖維素、糊精、微粉硅膠、磷酸鈣、磷酸氫鈣、磷酸二氫鈣等[15]，而膠囊劑常用輔料以微晶纖維素、糊精、磷酸氫鈣和可溶性淀粉居多[16]。

因此，結(jié)合前期預(yù)實驗結(jié)果，取“2.5.1”項下細(xì)粉適量，先以藥輔比1∶1、95%乙醇用量占藥輔量的20%作基本條件，進(jìn)行輔料種類的篩選。并以休止角[14]、堆密度[17]、成型率[18]、吸濕率[19]為考察指標(biāo)，進(jìn)行膠囊內(nèi)容物顆粒的綜合評價，得到最佳輔料種類為糊精＋微晶纖維素（1∶1）。綜合評分（）＝最小休止角×20/休止角＋20/最大堆密度×堆密度＋25/最大成型率×成型率＋最小吸濕率×35/吸濕率[18]。結(jié)果見表15。

表14 潤濕劑(乙醇)體積分?jǐn)?shù)的考察

2.5.4 95%乙醇用量優(yōu)化 取“2.5.1”項下細(xì)粉適量，依據(jù)“2.5.3”項下所得最佳輔料種類條件，按藥輔比為1∶1，考察不同95%乙醇用量條件下休止角、堆密度、成型率、吸濕率的變化，結(jié)果見表16。結(jié)合綜合評分法優(yōu)選得最佳95%乙醇用量占藥輔料總量的23%。

2.5.5 輔料配比優(yōu)化 取“2.5.1”項下細(xì)粉適量，依據(jù)“2.5.3”項和“2.5.4”項下所得最佳條件，按藥輔比為1∶1，考察不同輔料配比條件下休止角、堆密度、成型率、吸濕率的變化，結(jié)果見表17。結(jié)合綜合評分法優(yōu)選得最佳輔料配比為“糊精-微晶纖維素（3∶2）”。

2.5.6 藥物與輔料配比優(yōu)化 取“2.5.1”項下細(xì)粉適量，依據(jù)“2.5.3”“2.5.4”項和“2.5.5”項下所得最佳條件，以休止角、堆密度、成型率、吸濕率的變化為指標(biāo)，考察藥物與輔料配比對顆粒劑成型的影響，結(jié)果見表18。結(jié)合綜合評分法優(yōu)選得最佳藥輔配比為1∶1。

表15 輔料種類篩選結(jié)果顯示

表16 95%乙醇用量優(yōu)化結(jié)果顯示

表17 輔料配比優(yōu)化結(jié)果顯示

2.5.7 成型工藝驗證 結(jié)合實際操作，為進(jìn)一步驗證所選成型最佳工藝，根據(jù)擬合的最優(yōu)條件，得到最佳成形工藝參數(shù)為95%乙醇用量占藥輔總量的23%、糊精與微晶纖維素比例為3∶2、藥物與輔料比例為1∶1。據(jù)此條件進(jìn)行3次驗證實驗，結(jié)果見表19，得其綜合評分分別為98.53、98.40和99.83，平均值為98.20，RSD為0.79%，表明該成型工藝穩(wěn)定、可靠，符合大生產(chǎn)要求。

表18 藥輔配比優(yōu)化結(jié)果顯示

表19 成型工藝驗證優(yōu)化法的實驗驗證(n = 3)

3 討論

本方由四逆散基礎(chǔ)方加味而來，由9味中藥組成、方中化學(xué)成分復(fù)雜、且各個成分的最大吸收波長不一，為了盡可能使各成分的色譜峰基本分離，前期預(yù)實驗分別考察了在水-甲醇、水-乙腈、0.05%磷酸水溶液-乙腈以及0.05%磷酸水溶液-甲醇4種流動相體系下各成分的色譜峰分離情況，最終優(yōu)化得0.05%磷酸水溶液-甲醇為最佳流動相。并結(jié)合預(yù)實驗所得色譜峰的基線、峰形、峰數(shù)、指標(biāo)成分分離度及響應(yīng)值等因素，最終選擇228 nm為該方各成分的最佳吸收波長。

由于復(fù)方制劑的藥效取決于方中多種成分的配伍增效作用。因此，在水提取工藝的優(yōu)化中，采用熵權(quán)法客觀賦予6中指標(biāo)成分權(quán)重系數(shù)，分別為辛弗林（0.227）、梔子苷（0.108）、芍藥苷（0.170）、甘草苷（0.128）、柚皮苷（0.184）和甘草酸銨（0.182）。在醇沉精制工藝篩選中，為盡可能保留藥效成分，除去無效成分，則希望干膏率越小越好，所以結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[12]，本環(huán)節(jié)干膏率評分的權(quán)重系數(shù)占0.15，6種指標(biāo)成分綜合評分的權(quán)重系數(shù)占0.85。在成型工藝中，為了控制膠囊內(nèi)容物吸濕性、流動性和成型性，保證膠囊確質(zhì)量，希望所得顆粒得休止角、吸濕性越小越好，而堆密度和成型率則是越大越好。因此結(jié)合實際實驗情況，分別設(shè)休止角、堆密度二者的權(quán)重系數(shù)各占0.20、成型率權(quán)重系數(shù)占0.25、吸濕率權(quán)重系數(shù)占0.35。

在整個制備工藝環(huán)節(jié)中，就單因素提取次數(shù)考察環(huán)節(jié)中，雖結(jié)合綜合評分法優(yōu)選得最佳提取次數(shù)是2次，但在企業(yè)的實際生產(chǎn)中，結(jié)合成本等因素，選擇1次是可以的。另外就實驗優(yōu)化選擇95%乙醇作潤濕劑、制軟材的結(jié)果，在實際生產(chǎn)應(yīng)用中，結(jié)合藥品質(zhì)量與用藥安全問題，可以做出調(diào)整，具體數(shù)據(jù)應(yīng)該以實際操作中的質(zhì)量檢驗為準(zhǔn)則。此外，為了有效監(jiān)測CSTC在整個制備環(huán)節(jié)中各成分的穩(wěn)定性、重復(fù)性，明確含量變化，確保膠囊質(zhì)量，以6種指標(biāo)成分辛弗林、梔子苷、芍藥苷、甘草苷、柚皮苷和甘草酸銨的出峰情況作為質(zhì)量控制條件。發(fā)現(xiàn)提取環(huán)節(jié)6種指標(biāo)成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)綜合評分的RSD為0.43%。醇沉精制除雜環(huán)節(jié)6種指標(biāo)成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)綜合評分的RSD為0.27%。成型環(huán)節(jié)4種考察指標(biāo)（休止角、堆密度、成型率、吸濕率）指標(biāo)成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)綜合評分的RSD為0.79%。表明實驗涉及制備工藝考察科學(xué)合理、工藝參數(shù)穩(wěn)定、重復(fù)性好、可操作性強，膠囊質(zhì)量有一定保證。綜上，本實驗基于多指標(biāo)定量的制備工藝及質(zhì)量控制研究，能夠比較全面地對該膠囊劑進(jìn)行質(zhì)量控制與評價，可以為CSTC質(zhì)量控制評價提供參考依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 孫志明, 李小娜. 四逆散復(fù)方的研究進(jìn)展 [J]. 現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2011, 20(25): 3244-3246.

[2] 張福華. 四逆散及其類方的研究 [D].濟南: 山東中醫(yī)藥大學(xué), 2005.

[3] 李越峰, 徐富菊, 張澤國, 等. 四逆散對大鼠睡眠時相影響的實驗研究 [J]. 中國臨床藥理學(xué)雜志, 2014, 30(10): 936-938.

[4] 侯磊, 李曉宇, 黃娜娜, 等. 四逆散干預(yù)焦慮癥作用機制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析 [J]. 中草藥, 2019, 50(21): 5154-5161.

[5] 宗陽, 陳婷, 董宏利, 等. 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)四逆散治療抑郁癥的作用機制探討 [J]. 中草藥, 2019, 50(20): 4995-5002.

[6] 張育貴, 張淑娟, 牛江濤, 等. 四逆散鎮(zhèn)靜催眠作用研究進(jìn)展及其新藥開發(fā)的策略分析 [J]. 中草藥, 2020, 51(13): 3575-3584.

[7] 國家藥品監(jiān)督管理局. 古代經(jīng)典名方中藥復(fù)方制劑簡化注冊審批管理規(guī)定 [S]. 2018.

[8] 陳健, 張越, 崔小兵, 等. 基于多成分質(zhì)量控制的溫經(jīng)湯制備工藝研究 [J]. 中草藥, 2021, 52(2): 404-412.

[9] 任偉光, 吳玉林, 林蘭, 等. 糖心平方水提醇沉的工藝研究 [J]. 時珍國醫(yī)國藥, 2019, 30(8): 1876-1878.

[10] 吳紅偉, 李東輝, 邊甜甜, 等. 基于響應(yīng)面法結(jié)合熵權(quán)法多指標(biāo)優(yōu)選黃芪藥材產(chǎn)地加工炮制一體化工藝 [J]. 中草藥, 2021, 52(19): 5854-5861.

[11] 柳蘭, 李雅, 郭志華, 等. Box-Behnken響應(yīng)面法結(jié)合G1-熵權(quán)法的理氣活血復(fù)方浸膏噴霧干燥工藝研究 [J]. 中草藥, 2019, 50(11): 2560-2566.

[12] 杜正彩, 齊彪, 張明哲, 等. 正交設(shè)計結(jié)合藥效學(xué)實驗優(yōu)選桂梔助眠膠囊提取工藝研究 [J]. 中草藥, 2019, 50(3): 618-625.

[13] 尚芳紅, 陽勇, 宋旭紅, 等. 正交設(shè)計結(jié)合藥效學(xué)實驗優(yōu)選四君子湯顆粒水提及精制工藝 [J]. 中草藥, 2020, 51(16): 4191-4200.

[14] 秦貞苗, 李海龍, 譚銀豐, 等. 高良姜膠囊成型工藝研究 [J]. 中國現(xiàn)代中藥, 2015, 17(8): 847-850.

[15] 王宏順, 熊學(xué)敏. 中藥顆粒劑輔料篩選的研究 [J]. 江西中醫(yī)藥, 2010, 41(7): 65-67.

[16] 李旸. 復(fù)方連萸膠囊的制備工藝及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究 [D].武漢: 華中科技大學(xué), 2011.

[17] 潘艷琳, 肖欽, 程心玲, 等. 腎康靈膠囊成型輔料的選擇與工藝研究 [J]. 海峽藥學(xué), 2017, 29(10): 5-7.

[18] 馬馨桐, 肖鳳琴, 邱明陽, 等. 多指標(biāo)綜合評分法優(yōu)選復(fù)方降脂緩釋片的水提醇沉工藝及活性研究 [J]. 中國醫(yī)院藥學(xué)雜志, 2019, 39(17): 1759-1765.

[19] 曹青云. 舒潤膠囊的制備工藝及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究 [D].北京: 北京中醫(yī)藥大學(xué), 2018.

Preparation technology and quality control of Chaishao Shugan Tiaoshen Capsules based on multi-index quantification

YANG Xin-rong1, 2, 3, DOU Xia3, LI Guo-feng1, 2, SONG Qin-jie1, 2, LI Xian-wei1, 2, WU Hong-wei1, 2, LI Dong-hui1, 2, XIN Er-dan3, SUN Yu-jing1, 2, ZHANG Yu-gui1, 2, BIAN Tian-tian1, 2, LI Yue-feng1, 2

1. Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China 2. Gansu Province Chinese Medicine Pharmaceutical Process Engineering Research Center, Lanzhou 730000, China 3. Affiliated Hospital of Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China

To prepare Chaishao Shugan Tiaoshen Capsules (柴芍疏肝調(diào)神膠囊, CSTC) from Chaishao Shugan Tiaoshen prescription based on the classic famous prescription Sini Powder (四逆散), and carry out the quality control analysis by optimizing the preparation process and evaluating the multi-component.The CSTC were prepared by water extraction and alcohol precipitation, wet granulation and filling. According to the fingerprints of six index components synephrine, geniposide, paeoniflorin, liquiritin, naringin and ammonium glycyrrhizinate, and the comprehensive scores were analyzed to investigate the effects of the ratio of solid to liquid, extraction times, and extraction time, the relative density of liquid medicine, alcohol precipitation concentration and alcohol precipitation time on the refining process of water extraction and alcohol precipitation. In addition, based on the comprehensive score of angle of repose, bulk density, molding rate, moisture absorption rate to screen the effect of excipient types, excipient ratio, drug adjuvant ratio, and 95% ethanol dosage on the molding process.The optimal preparation process of CSTC was the ratio of solid to liquid of 1:12, extraction times of two times, extraction time of 69 min, relative density of medicinal liquid of 1.15 g/mL (50 ℃), alcohol precipitation concentration of 60%, alcohol precipitation time of 36 h, the excipient of dextrin + microcrystalline cellulose (3:2), the ratio of drug adjuvant of 1:1, and the amount of 95% ethanol accounting for 23% of the amount of drug adjuvant.The optimal preparation process is scientific, reasonable and highly feasible in this experiment, and can provide a reference for the development of CSTC and related traditional Chinese medicine preparations, which can provide the theoretical guidance for the quality evaluation of CSTC.

Sini Powder; Chaishao Shugan Tiaoshen Capsules; standard capsule; Box-Behnken response surface method; orthogonal test; preparation process; quality control; synephrine; geniposide; paeoniflorin, liquiritin; naringenin; ammonium glycyrrhizinate; angle of repose; bulk density; molding rate; hygroscopic rate

R283.6

A

0253 - 2670(2022)23 - 7393 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.23.009

2022-06-08

國家自然科學(xué)基金資助項目（81960713）；國家自然科學(xué)基金資助項目（82160750）；甘肅省教育廳產(chǎn)業(yè)支撐計劃項目（2021CYZC-21）；甘肅省中藥制藥工藝工程研究中心開放課題（ZYGY202003）；甘肅省科技計劃（創(chuàng)新基地與人才計劃）基礎(chǔ)研究創(chuàng)新群體項目（21JR7RA569）

楊新榮（1990—），男，碩士研究生，主要從事中藥及復(fù)方加工炮制機制及活性成分研究。Tel: 18419612305 E-mail: 1678365753@qq.com

通信作者：李越峰，教授，博士生導(dǎo)師，博士后，主要從事中藥及復(fù)方加工炮制機制及活性成分研究。E-mail: lyfyxk@126.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]