■ 王凱 阮鵬飛（ 江門市澳保生物科技有限公司 ； 江門市動物疫病預(yù)防控制中心 ）

圖1 患病大口黑鱸體表病癥

圖2 患病大口黑鱸內(nèi)臟解剖圖（a、頭腎；b、后腎；c、心臟；d、肝臟；e、脾臟；f、果凍狀黃色腹水）

大口黑鱸（Micropterus salmoide），俗稱加州鱸。屬于鱸形目、鱸亞目、太陽魚科，是一種純淡水的廣溫性肉食性魚類。原產(chǎn)于北美洲的淡水水域，后引入英國、法國、西非、巴西、菲律賓等國及我國香港、臺灣等地區(qū)養(yǎng)殖，其養(yǎng)殖水域幾乎遍布全球。20世紀(jì)80年代初引入我國內(nèi)地，現(xiàn)已推廣到全國許多省市，成為我國特種水產(chǎn)品之一。近年來，由于養(yǎng)殖密度的不斷擴(kuò)大，病害問題不斷增多，其中，作為引起人類感染的重要人畜共患病原微生物，愛德華氏菌是魚類中最重要的細(xì)菌性疾病之一，困擾著全球水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，在淡水魚類養(yǎng)殖中引起敗血癥和巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

愛德華氏菌屬腸桿菌科，2012年以前，世界公認(rèn)的愛德華氏菌屬分為三個種，包括遲緩愛德華氏菌（Edwardsiella tarda, E.tarda）、?？茞鄣氯A氏菌（EdwardsiellaHoshinae, E.hoshinae）和鮰愛德華氏菌（Edwardsiella ictalurid, E.ictaluri），其中，分布和宿主范圍較廣的是遲緩愛德華氏菌，由于遲緩愛德華氏菌的不同來源的分離株在表型和遺傳特征方面存在著很多的差異，自2013年Abayneh等人的研究將異于遲緩愛德華氏菌的分離株重新命名為殺魚愛德華氏菌（Edwardsiella piscicida），殺魚愛德華氏菌呈全球性地理分布，宿主范圍也十分廣泛，多為海水和咸淡水魚類，包括加州鱸、尖吻鱸、白鮭魚、歐洲鰻鱺、真鯛、斑點叉尾鮰、大菱鲆和黑斑刺魟等，給相關(guān)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，通過對該屬細(xì)菌的研究，優(yōu)化診斷方法，提升防控效率，對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)有著十分重要的意義。

本研究以廣東省佛山市杏壇鎮(zhèn)區(qū)域養(yǎng)殖塘發(fā)病大口黑鱸的細(xì)菌性病原體為研究對象。通過對菌株進(jìn)行分離純化，觀察形態(tài)；將分離純化的菌株進(jìn)行菌種鑒定；以及制作組織印片，觀察各組織中細(xì)菌的形態(tài)及分布情況；通過組織切片，觀察各組織的病變；結(jié)合藥敏實驗結(jié)果，記錄病原菌對各種抗生素的敏感性。文中描述了大口黑鱸感染愛德華氏菌后引起的癥狀，為大口黑鱸養(yǎng)殖業(yè)提供更多的病害預(yù)防及診斷思路；通過分析藥敏實驗結(jié)果，初步判斷愛德華氏菌的敏感抗生素藥物，為大口黑鱸養(yǎng)殖業(yè)提供更多的病害防控策略，本文中的藥敏實驗結(jié)果僅對本次采樣的大口黑鱸病魚，針對不同的塘養(yǎng)殖的大口黑鱸感染愛德華氏菌后，應(yīng)再次進(jìn)行藥敏實驗，分析敏感藥物。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

腦心浸出液培養(yǎng)基（BHI）和革蘭氏染色液購自環(huán)凱微生物，藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司，超白吸附載玻片和蓋玻片購自江蘇世泰實驗器材有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品采集和病原分離及鑒定

2021年11～12月，對廣東省佛山市杏壇鎮(zhèn)區(qū)域養(yǎng)殖塘大口黑鱸自然發(fā)病病樣進(jìn)行多次采樣，對發(fā)病情況、病理特征等進(jìn)行檢測。采用平板劃線法，在BHI 固體培養(yǎng)基上對瀕死的患病大口黑鱸的后腎、脾臟和皮下膿腫等進(jìn)行接種培養(yǎng)，置于28℃生化培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。選擇呈優(yōu)勢生長的單菌落，在BHI 固體培養(yǎng)基上進(jìn)行純化分離，從而得到單菌落，挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色。將純化分離的含有單菌落的平板送至鑒定公司進(jìn)行菌種鑒定。

將菌株的16s rDNA基因擴(kuò)增序列通過NCBI（National Center for Biotechnology Information）進(jìn)行同源性分析，選取相關(guān)性較高的16s rDNA序列使用Clustal W進(jìn)行多序列比對分析，使用MEGA5.0軟件中的鄰接法（Neighbor Joining method）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.2 組織印片

對采集樣品的肝臟、脾臟、腎臟和血液進(jìn)行涂片，干燥后進(jìn)行瑞氏-吉姆薩染色，在載玻片上均勻滴加瑞氏染液1mL，染色1min，然后在瑞氏染色液中均勻滴加吉姆薩染色液3mL，染色20min。染色完成后，用蒸餾水將染色液沖洗干凈，繼續(xù)沖洗至染色區(qū)域為淡紫色，注意不要直接沖洗染色部分，干燥后在100倍油鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.2.3 組織切片

將病魚的心臟、肝臟、脾臟和腎臟組織切塊使用4%多聚甲醛溶液進(jìn)行固定，固定1h后更換一次4%多聚甲醛溶液，寄出進(jìn)行組織切片制作。

1.2.4 藥敏實驗

挑選分離純化的單菌落置于BHI液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)培，28℃下?lián)u床培養(yǎng)24h，吸取100μl菌液滴加在BHI固體培養(yǎng)基上，均勻涂布，將藥敏片貼于培養(yǎng)基上，放入28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，觀察測量抑菌圈大小并判定結(jié)果。

1.2.5 人工回感實驗

隨機(jī)采取 3尾購自廣東佛山某水產(chǎn)養(yǎng)殖場的健康大口黑鱸，取其內(nèi)臟組織進(jìn)行研磨，在BHI平板上進(jìn)行涂布，培養(yǎng)24h后無優(yōu)勢菌生長。再購12尾大口黑鱸暫養(yǎng)3d后進(jìn)行人工感染實驗，人工感染實驗分為兩組，實驗組：取已確定健康無病的加州鱸6尾，使用無菌水將本文分離的菌種濃度調(diào)整成106，每尾魚注射0.5mL的菌液。對照組：取同樣的6尾魚，每尾魚注射等量的無菌水，感染期間每天記錄各組魚的癥狀及死亡情況，并對瀕死的魚進(jìn)行解剖觀察和分離細(xì)菌。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)病病例臨床癥狀

發(fā)病大口黑鱸主要為1齡大口黑鱸，觀察病魚體表，發(fā)現(xiàn)體表血點，爛鰓，眼球突出，黃身，解剖后可見果凍狀或血樣腹水，心臟糜爛，心膜炎，尾柄皮下膿腫，頭腎、后腎腫大，空胃，脾臟腫大充血，脾臟大量白點，肝臟腫大，豆腐肝的癥狀。

2.2 細(xì)菌分離及鑒定

通過平板劃線對病魚組織中的細(xì)菌進(jìn)行粗分，28℃培養(yǎng)24h后，平板上長出優(yōu)勢菌，將優(yōu)勢菌劃線，進(jìn)行純化分離，置于28℃培養(yǎng)24h后，獲得單一菌種，菌種在BHI培養(yǎng)基上形成的菌落特征為圓形不透明、淡黃色、表面濕潤光滑、邊緣整齊（圖3，b），革蘭氏染色結(jié)果系顯示該菌為革蘭氏陰性菌（圖3，c）。將單一菌種平板寄出進(jìn)行鑒定，進(jìn)行16s rDNA測序，將測序所得序列在NCBI數(shù)據(jù)庫上進(jìn)行比對，比對結(jié)果該菌與殺魚愛德華氏菌一致性達(dá)99.19%，并將該菌株命名為PB-025。

圖3 菌株的生長情況和染色形態(tài)（a、后腎及脾臟菌種粗分離；b、純化后菌落的生長形態(tài)；c、菌種革蘭氏染色呈陰性[紅色]）

利用MEGA5.0軟件采用鄰接法（Neighbor Joining method）構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示（圖4），菌株P(guān)B-025與殺魚愛德華氏菌（Edwardella piscicida）聚為一支。

圖4 基于菌株P(guān)B-025 16s rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖5 愛德華氏菌在各組織中的分布(a、肝臟中的愛德華氏菌；b、脾臟中的愛德華氏菌；c、腎臟中的愛德華氏菌；d、血液中的愛德華氏菌；標(biāo)尺為20μm)

2.3 組織印片

對患病大口黑鱸的肝臟、脾臟、腎臟和血液進(jìn)行瑞氏-吉姆薩染色，染色后能夠很好的觀察到各組織中的殺魚愛德華氏菌的分布情況，可見在肝臟、脾臟、腎臟和血液中均有游離或吞噬的愛德華氏菌，細(xì)菌長約3～5μm。

2.4 組織切片

從組織切片結(jié)果中可得，在心膜的致密層中明顯可見大量的愛德華氏菌（圖6，a），且愛德華氏菌感染會引起心膜炎，導(dǎo)致心臟外膜變厚，以及心臟海綿層中會形成肉芽腫結(jié)構(gòu)（圖6，b）；脾臟造血區(qū)域一直是受影響最嚴(yán)重的組織，脾臟中可見大量的肉芽腫結(jié)構(gòu)（圖6，c）；腎臟中包含多灶性到合并的肉芽腫（圖6，d）；病變在肝臟中不算嚴(yán)重，但也可見少量的凝固性壞死灶（圖6，e）。肉芽腫性炎癥、壞死灶和細(xì)菌的可變組合是感染愛德華氏菌病樣組織中常見的組織病理癥狀。

圖6 自然感染的大口黑鱸中愛德華氏菌相關(guān)病變的顯微照片(a、b：心臟的病變，a：標(biāo)尺為20μm，b：標(biāo)尺為200μm；c：脾臟的病變，標(biāo)尺為500μm；d：腎臟的病變，標(biāo)尺為100μm；e：肝臟的病變，標(biāo)尺為200μm)

2.5 藥敏實驗

將擴(kuò)培的愛德華氏菌進(jìn)行藥敏實驗，結(jié)果如表1所示：PB-025菌株對鹽酸多西環(huán)素、硫酸新霉素、氟苯尼考、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、氧氟沙星、丁胺卡那、諾氟沙星、卡那霉素和四環(huán)素呈現(xiàn)高度敏感，對恩諾沙星、頭孢拉定、阿奇霉素、鏈霉素和慶大霉素呈現(xiàn)中度敏感，對阿莫西林和紅霉素呈現(xiàn)低度敏感，對復(fù)方新諾明和青霉素具有耐藥性。該結(jié)果與加州鱸遲緩愛德華氏菌的敏感性藥物存在一定的一致性。

表1 各藥物的抑菌圈信息

2.6 人工回感實驗

健康無病的大口黑鱸在感染第5d后開始出現(xiàn)死亡，發(fā)病病癥與自然發(fā)病的魚存在相似性，18d內(nèi)累計死亡率為100%，而對照組在實驗期間未出現(xiàn)死亡情況（圖7），實驗結(jié)果說明本文分離的菌株P(guān)B-025具有較強的致病力。且從人工感染的大口黑鱸組織中再次分離致病菌，菌落形態(tài)及革蘭氏染色與自然發(fā)病的病原菌的一致，結(jié)果表明本文從自然發(fā)病的大口黑鱸所分離的細(xì)菌為此次發(fā)病的致病菌。

圖7 菌株P(guān)B-025的人工感染實驗

3 討論

目前，對于魚類愛德華氏菌的理化特性、致病機(jī)制以及防控手段都有相關(guān)研究，其中，防控手段尤為重要，有研究表明可通過免疫預(yù)防手段防控愛德華氏菌，抗E.tarda的單抗可以顯著提高牙鲆抵抗愛德華氏菌的能力，延長存活時間；有研究研制出遲緩愛德華氏菌的滅活疫苗，能夠?qū)Υ罅怫覑鄣氯A氏菌病起到重要的保護(hù)作用，能夠有效抵御遲緩愛德華氏菌的強毒株；也有研究研制出針對感染遲緩愛德華氏菌的羅非魚的菌蛻疫苗，實驗結(jié)果表明該疫苗有較高的免疫保護(hù)率。

由于殺魚愛德華氏菌是自2013年遲緩愛德華氏菌區(qū)別開來，因此對殺魚愛德華氏菌的相關(guān)研究還相對較少，其中，有研究報道了在患病烏鱧中檢測到了殺魚愛德華氏菌，并對該菌株進(jìn)行了藥敏實驗，有研究為構(gòu)建養(yǎng)殖大菱鲆殺魚愛德華氏菌快速檢測模型提供了思路，也有研究報道了斑馬魚和草魚組蛋白核苷酸的多態(tài)性在殺魚愛德華氏菌感染中的作用，篩選出了能增強魚類免疫力及對殺魚愛德華氏菌的抗病力的抗菌組蛋白，同時也有研究構(gòu)建了殺魚愛德華氏菌的 Δcrp 疫苗候選株，但僅有這些研究是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，為了防控殺魚愛德華氏菌給魚類帶來的危害，減少魚類養(yǎng)殖過程中的經(jīng)濟(jì)損失，應(yīng)當(dāng)重視在養(yǎng)殖過程中遇到的殺魚愛德華氏菌感染。本研究采用的瑞氏-吉姆薩染色法能夠快速簡便的對殺魚愛德華氏菌進(jìn)行初步鑒定，并通過藥敏實驗進(jìn)行精準(zhǔn)用藥獲得了成功，本次研究也驗證了使用吉姆薩染色劑可以更好地觀察細(xì)菌的研究。

首先養(yǎng)殖環(huán)境的好壞與養(yǎng)殖魚類的健康息息相關(guān)，也是防控愛德華氏菌病的關(guān)鍵因素。關(guān)于保持良好的養(yǎng)殖環(huán)境有幾點建議：1、保持良好的水質(zhì)，定期使用環(huán)境友好的益生菌制劑產(chǎn)品，達(dá)到藻相平衡、穩(wěn)水肥水的效果；2、定期改底凈水，達(dá)到分解底部殘餌糞便及有機(jī)污染物，降解毒素，抑制病原菌、寄生蟲的滋生，降低養(yǎng)殖環(huán)境進(jìn)一步惡化的風(fēng)險；3、定期消毒與內(nèi)服保健，抑制有害菌生長，提高養(yǎng)殖動物自身免疫力的同時促進(jìn)魚體傷口恢復(fù)；4、根據(jù)養(yǎng)殖病害“三環(huán)”理論做好全面防御。

同時養(yǎng)殖密度也十分關(guān)鍵，適當(dāng)?shù)酿B(yǎng)殖密度、科學(xué)飼喂，能明顯降低細(xì)菌性疾病的發(fā)生率。定期拌喂中草藥類、維生素類、保肝護(hù)肝類、提高免疫力類的產(chǎn)品，可增強體質(zhì)，提高養(yǎng)殖動物自身免疫力，減少應(yīng)激；另外要加強管理，在投放魚苗前做好魚塘的清塘和消毒工作，并避免混養(yǎng)不同生長階段的魚，其次對病原菌的出現(xiàn)進(jìn)行密切監(jiān)控也是防控的有效方法。

最后，在魚類發(fā)生細(xì)菌性病害時，應(yīng)針對病癥尋找真正原因，做到有效、精準(zhǔn)用藥。在預(yù)防與治療的同時，避免濫用藥物導(dǎo)致環(huán)境惡化、病原菌耐藥性產(chǎn)生，而給養(yǎng)殖埋下更大的隱患。 （參考文獻(xiàn)略）