吳中艷，覃 杰

（1.第二師三十七團(tuán)農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，新疆 且末縣 841900；2.第二師畜牧獸醫(yī)站）

犢牛大腸桿菌病是由大腸桿菌引起的以犢牛腹瀉和敗血癥為主要癥狀的一種細(xì)菌性疾病，是牛的一種常見疫病[1]。沙門氏菌病又名副傷寒，臨床上多表現(xiàn)為敗血癥和腸炎，也可使懷孕母畜發(fā)生流產(chǎn)。這兩種病均可致使?fàn)倥５纳L(zhǎng)發(fā)育受阻甚至死亡，給養(yǎng)牛業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前，主要采用抗生素防治牛大腸桿菌病和沙門氏菌病，然而抗生素的大量使用會(huì)產(chǎn)生耐藥性和藥物殘留。疫苗防控有著很好的安全性，但大腸桿菌和沙門氏菌血清型眾多，不同地區(qū)血清型差異較大，本試驗(yàn)從腹瀉牛中分離鑒定出當(dāng)?shù)氐膬?yōu)勢(shì)血清型，制備成二聯(lián)四價(jià)氫氧化鋁佐劑滅活疫苗，經(jīng)臨床試驗(yàn)免疫原性和安全性均良好。

1 試驗(yàn)材料

1.1 病料

腹瀉犢牛中分離鑒定出O78、O111血清型大腸桿菌、都柏林沙門氏菌、鼠傷寒沙門菌沙門氏菌。

1.2 主要試劑

營(yíng)養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂、LB肉湯，均購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

昆明系小白鼠來自石河子大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)牛來自鐵門關(guān)市三〇團(tuán)和三十一團(tuán)牛場(chǎng)。

2 試驗(yàn)方法

2.1 大腸桿菌和沙門氏菌懸液的制備與滅活[2-3]

將4種菌株分別接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，挑取培養(yǎng)物接種于LB肉湯培養(yǎng)，制取種子液。將種子液增菌并稀釋細(xì)菌濃度為1014個(gè)/mL，將4種菌液按照1∶1∶1∶1比例等體積混合，向菌液中加入終濃度為0.2%甲醛溶液，滅活24 h。將菌液接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂和麥康凱瓊脂培養(yǎng)基檢測(cè)細(xì)菌活力。將收集的滅活菌液置于離心管中，以12 000 r/min離心5 min，棄去上清液。在超凈工作臺(tái)將菌體用少量的生理鹽水邊稀釋邊倒入80目銅篩并過濾到滅菌瓶中，直至所有菌體都過濾到滅菌瓶中，然后加入生理鹽水，最終配制成含菌量3×1010個(gè)/mL濃度的菌液。

2.2 滅活疫苗的制備

用硫酸鋁和氫氧化鈉配置成氫氧化鋁佐劑原液，按1∶4與生理鹽水混合，配置成佐劑。按菌液量的1/3加入佐劑，充分混合，制成二聯(lián)四價(jià)滅活疫苗。成年牛注射劑量為6 mL/頭份，犢牛減半。

2.3 滅活疫苗的質(zhì)量檢驗(yàn)

無菌檢驗(yàn)：將滅活疫苗0.2 mL分別接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂和麥康凱瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)48 h觀察有無細(xì)菌生長(zhǎng)。

安全性試驗(yàn)：取10只昆明系小白鼠（公母各半），分別頸部皮下注射滅活疫苗0.1 mL，觀察采食、精神、注射部位狀況及死亡情況。選取15日齡、60日齡、200日齡和2歲健康牛各10只，分別頸部皮下注射疫苗6 mL（2歲牛12 mL），連續(xù)15 d觀察試驗(yàn)牛注射部位、精神、采食和發(fā)病狀況。

2.4 疫苗效力檢驗(yàn)

取20只成年小白鼠隨機(jī)分成2組，試驗(yàn)組（首免后14 d加強(qiáng)免疫1次）皮下注射疫苗0.1 mL/只，對(duì)照組注射生理鹽水，42 d后試驗(yàn)組和對(duì)照組分別用分離培養(yǎng)的O78大腸桿菌、O111大腸桿菌、都柏林沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌混合菌液0.5 mL/只皮下注射攻毒，7 d后觀察小白鼠采食、精神、存活和死亡情況，如出現(xiàn)死亡，對(duì)其進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)鑒定。

2.5 滅活疫苗免疫效果觀察和攻毒試驗(yàn)

試驗(yàn)犢牛65頭，分為4組，采用皮下注射方法，其中：A組15頭，1日齡首免，14日齡加強(qiáng)免疫1次；B組15頭，1日齡首免，21日齡加強(qiáng)免疫1次；C組15頭，60日齡首免，81日齡加強(qiáng)免疫1次；D組為對(duì)照，20頭，1日和60日齡牛各10頭，注射生理鹽水。

血清抗體效價(jià)檢測(cè)。抗原制備：O78大腸桿菌、O111大腸桿菌、都柏林沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌各3×1010個(gè)/mL的菌液50 mL，經(jīng)高壓滅菌破壞其菌毛抗原后作為抗原診斷液。采用玻片凝集試驗(yàn)方法，取100 μL血清用生理鹽水從1∶2開始做倍比稀釋到1∶256，用稀釋血清50 μL和50 μL抗原等體積混合，攪拌均勻，觀察其凝集現(xiàn)象。分別于首免后7 d、14 d、21 d、42 d、180 d檢測(cè)。

攻毒保護(hù)試驗(yàn)。將濃度為3×1010個(gè)/mL的O78大腸桿菌、O111大腸桿菌、都柏林沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌等體積混合，取6 mL分別在首免42 d后皮下注射A、B、C、D組試驗(yàn)牛，連續(xù)20 d觀察試驗(yàn)牛采食、精神及發(fā)病情況。

3 結(jié)果與分析

3.1 滅活疫苗的質(zhì)量檢驗(yàn)

無菌檢查結(jié)果：經(jīng)甲醛滅活后，4種細(xì)菌混合懸液在營(yíng)養(yǎng)瓊脂和麥康凱瓊脂平板培養(yǎng)均無菌落生長(zhǎng)，說明滅活效果良好。將疫苗接種在營(yíng)養(yǎng)瓊脂和麥康凱瓊脂平板上均無菌落生長(zhǎng)，滅活效果良好。

安全性試驗(yàn)結(jié)果：小白鼠注射疫苗后，除2只出現(xiàn)一過性精神萎靡和食欲下降外，其它小白鼠注射部位、采食及精神狀況均未見不良反應(yīng)。所有試驗(yàn)牛注射部位未見紅腫、化膿等異常表現(xiàn)，采食及精神狀況正常。表明疫苗具有較高的安全性。

3.2 疫苗效力檢驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)組小白鼠精神、食欲正常，無死亡情況。對(duì)照組所有的小白鼠無精神、食欲不振，死亡8只，死亡率80%。

3.3 滅活疫苗的免疫保護(hù)效果

由表1可知，疫苗首免后7 d，免疫組（A、B、C組）O78大腸桿菌血清凝集抗體效價(jià)在1∶2～1∶32，首免后14 d抗體合格率在40.0%～60.0%之間，首免后21 d抗體合格率為66.6%～80.0%，二次免疫后抗體效價(jià)提高，首免后42 d抗體水平達(dá)到最高，抗體合格率100%。免疫后180 d抗體合格率86.6%～100%。而對(duì)照組血清抗體效價(jià)始終處于1∶2以下。免疫組（A、B、C組）之間抗體效價(jià)無明顯差異。

表1 O78大腸桿菌凝集抗體水平測(cè)定結(jié)果

由表2可知，疫苗首免后7 d，免疫組（A、B、C組）O111大腸桿菌血清凝集抗體效價(jià)為1∶2～1∶32，首免后14 d抗體合格率在33.3%～46.6%之間，首免后21 d抗體合格率為53.3%～73.3%，二次免疫后抗體效價(jià)提高，首免后42 d抗體水平達(dá)到最高，抗體合格率100%。首免后180 d抗體合格率86.6%～100%。而對(duì)照組血清抗體效價(jià)始終處于1∶2以下。免疫組之間抗體效價(jià)無明顯差異。

表2 O111大腸桿菌凝集抗體水平測(cè)定結(jié)果

由表3可知，疫苗首免后7 d，免疫組（A、B、C組）都柏林沙門氏菌血清凝集抗體效價(jià)為1∶2～1∶32，首免后14 d抗體合格率在33.3%～53.3%之間，首免后21 d抗體合格率為53.3%～80.0%，二次免疫后抗體效價(jià)提高，首免后42 d抗體水平達(dá)到最高，抗體合格率93.3%～100%。首免后180 d抗體合格率80.0%～100%。而對(duì)照組血清抗體效價(jià)始終處于1∶2以下。免疫組之間抗體效價(jià)無明顯差異。

表3 都柏林沙門氏菌凝集抗體水平測(cè)定結(jié)果

由表4可見，疫苗首免后7 d，免疫組（A、B、C組）鼠傷寒沙門菌血清凝集抗體水平在1∶2～1∶32之間，首免后14 d抗體合格率為40.0%～66.6%，首免后21 d抗體合格率60.0%～80.0%，二次免疫后抗體效價(jià)提高，首免后42 d抗體水平達(dá)到最高，抗體合格率93.3%～100%。首免后180 d抗體合格率80.0%～93.3%。而對(duì)照組血清抗體效價(jià)始終處于1∶2以下。免疫組之間抗體效價(jià)無明顯差異。

表4 鼠傷寒沙門菌凝集抗體水平測(cè)定結(jié)果

3.4 攻毒保護(hù)試驗(yàn)

免疫組牛采食和精神狀況良好，存活率達(dá)到100%；對(duì)照組牛從攻毒后第2天起，陸續(xù)發(fā)病，表現(xiàn)為精神沉郁、無食欲和腹瀉癥狀，從糞便中分離得到相應(yīng)細(xì)菌。使用頭孢哌酮與氧氟沙星治療后痊愈。

4 討論

大腸桿菌和沙門氏菌的血清型眾多，且有明顯的地域差異，使用本地區(qū)血清型菌株制備自家滅活疫苗，是預(yù)防本地該病的有效途徑[2，4]。研究結(jié)果表明，以氫氧化鋁為佐劑的滅活苗具有良好的安全性，對(duì)免疫牛無或較小副反應(yīng)，皮下注射后能被機(jī)體很好地吸收；從免疫結(jié)果來看，本研究制備的滅活疫苗具有良好的免疫效果，免疫后42 d，93.3%以上的免疫?？贵w效價(jià)達(dá)到1∶32以上，免疫后180 d，80.0%以上的免疫?？贵w效價(jià)仍在1∶32以上；以3×1010個(gè)/mL的致病菌攻毒，免疫牛全部存活，無不良反應(yīng)，表明該疫苗免疫保護(hù)性良好。

通過試驗(yàn)表明，應(yīng)用滅活疫苗進(jìn)行免疫，首免日齡為1日齡、14日齡進(jìn)行二免與21日齡二免，免疫效果無差異。首免日齡為1日齡，與首免日齡為60日齡，隔14日進(jìn)行二免，免疫效果無差異。采用不同免疫時(shí)間、不同免疫間隔進(jìn)行免疫，犢牛都能產(chǎn)生良好的免疫效果。養(yǎng)殖戶可以根據(jù)自身實(shí)際情況選擇免疫時(shí)間。