李 醒，鄭文笛，鄒宏密，武明星

0引言

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤[1-2](retinoblastoma，RB)是嬰幼兒常見(jiàn)的眼內(nèi)惡性腫瘤，其中多數(shù)患者(85%)來(lái)自于低收入和中等收入國(guó)家。在這些地區(qū)，患者最常見(jiàn)的臨床表現(xiàn)包括白瞳癥、斜視和眼球突出，發(fā)現(xiàn)時(shí)已有近半數(shù)患者有眼外腫瘤，甚至發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[3]，發(fā)展到晚期患者不得不面臨眼球摘除的風(fēng)險(xiǎn)，這為患者及其家庭的心理健康和生活質(zhì)量帶來(lái)了嚴(yán)重負(fù)擔(dān)[4-5]。因此，早期診斷和治療是控制RB的關(guān)鍵。分子影像技術(shù)的發(fā)展為早期診斷RB提供了新的方向，為了更好地滿足醫(yī)學(xué)多樣化和個(gè)性化需求，靶向多模態(tài)顯像的分子探針成為了研究熱點(diǎn)[6-7]。

以Fe3O4為核心的超順磁性氧化鐵納米粒子(SPION)，能夠在外加磁場(chǎng)下向靶組織聚集[8]，結(jié)合配體修飾型主動(dòng)靶向探針，有望進(jìn)一步提升探針的靶向性能[9]。研究發(fā)現(xiàn)，SPION能夠吸收近紅外光進(jìn)行光成像，并且能夠作為磁共振成像(MRI)的陰性對(duì)比劑使用[10-11]。將SPION與液態(tài)氟碳(perfluorohexane，PFH)共同組裝成相變型納米分子探針，在激光作用下會(huì)發(fā)生液氣相變，從而增強(qiáng)超聲顯像[12]。葉酸是一種水溶性維生素，將其修飾納米粒上，可以和RB細(xì)胞上的受體通過(guò)受體-配體介導(dǎo)作用特異性結(jié)合。阿霉素[13](adriamycin，ADM)作為廣譜化療藥物，通過(guò)藥物遞送系統(tǒng)，在光觸發(fā)下治療眼內(nèi)疾病很有潛力。本研究擬制備一種新型的、高靶向性的納米級(jí)多模態(tài)造影劑，以葉酸(folic acid，F(xiàn)A)、Fe3O4為雙重靶向，載PFH、ADM的相變型多功能脂質(zhì)體納米粒(FA-PFH-Fe3O4@ADM)，研究其靶向視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤Y79細(xì)胞及體外超聲/光聲/MRI三模態(tài)成像能力，通過(guò)分子影像技術(shù)，為早期、高效、精準(zhǔn)診斷RB提供新的思路。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1主要材料二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC，瑞禧生物、LP-R4-057)，葉酸修飾磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG2000-FA，瑞禧生物、R-0043)，膽固醇(瑞禧生物、117298)，全氟己烷(PFH，STREM、09-6072)，葉酸(Sigma、R010338)，鹽酸阿霉素(ADM，阿拉丁、D107159)，超順磁性氧化鐵(SPION，瑞禧生物、R-C1002)，三氯甲烷(上海生化)，DAPI染色液(碧云天、AR1176)，CCK-8試劑盒(同仁化學(xué)、CK04)，人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞(Y79，上海斯信生物科技有限公司)，RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco、C11875500BT)。

1.1.2主要儀器旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(亞榮)，超聲波聲振儀(Sonics)，低溫離心機(jī)(Eppendorf)，馬爾文粒徑分析儀(Malvern)，紫外分光光度計(jì)(島津UV2600)，電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP-OES)(Agilent 720ES)；紅外成像儀(Fotric 226)，808nm激光儀(FC808-2W-MM，西安中川光電科技有限公司)，振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)(VSM)(LakeShore 7404型)，多功能酶標(biāo)儀(BioTek)，Vevo Laser光聲成像系統(tǒng)(Visual Sonics)，磁共振成像系統(tǒng)(SIEMENS)，激光共聚焦顯微鏡(Andor2000)。

1.2方法

1.2.1FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒的制備納米粒采用雙乳化法制備，按照5∶2∶2比例稱取DPPC、DSPE-PEG2000-FA、膽固醇共5mg，溶于6mL三氯甲烷中。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)2h，得到白色薄膜，使用2mL PBS充分水化脂膜備用。稱取ADM 1mg于100μL PBS中溶解，加入200μL SPION，100μL PFH，冰浴下進(jìn)行第1次超聲乳化(功率：35%；時(shí)間：1min，5s，5s)，再加入水化液進(jìn)行第2次超聲乳化(功率：40%；時(shí)間：3min，5s，5s)。低溫離心3次(8000r/min，5min)，即可得到FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒乳液。制備過(guò)程中，使用DSPE-PEG2000替代DSPE-PEG2000-FA即可得到PFH-Fe3O4@ADM納米粒，不加入SPION即可得到FA-PFH@ADM納米粒。

1.2.2FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒的基本特征檢測(cè)觀察納米粒乳液的性狀，稀釋后分別于光鏡、透射電鏡下觀察納米粒的形態(tài)，使用馬爾文粒徑分析儀分析其粒徑、電位分布情況。分別使用紫外分光光度計(jì)及ICP-OES檢測(cè)納米粒，根據(jù)以下公式：包封率(%)=[(m加入試劑-m上清液中試劑)/m加入試劑] ×100%；載藥量(%)=[(m加入試劑-m上清液中試劑)/m納米粒] ×100%，計(jì)算納米粒中ADM及Fe的包封率和載藥量。VSM檢測(cè)納米粒的磁性能，并給納米粒施加磁場(chǎng)，觀察其順磁性能。

1.2.3細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞毒性檢測(cè)使用含20%胎牛血清、1%青/鏈霉素雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基，在5%CO2，37℃的恒溫孵箱中培養(yǎng)Y79細(xì)胞。傳代4次后，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于96孔板(1×104細(xì)胞/孔)，加入不同濃度的FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒共同孵育24h。離心除去培養(yǎng)基，每孔加入10% CCK-8試劑100μL，繼續(xù)孵育1h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在450nm處的吸光度，各組細(xì)胞存活率根據(jù)以下公式計(jì)算：細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白組OD值)×100%。

1.2.4FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒的光熱效應(yīng)及光致相變能力檢測(cè)將納米粒分為PBS組、FA-PFH@ADM組、不同濃度(0.156、0.313、0.625、1.25mg/mL)FA-PFH-Fe3O4@ADM組，置于96孔板中，使用808nm激光(2W/cm2)輻照5min，并記錄其升溫情況。取0.625mg/mL的納米粒于96孔板中，使用不同功率(1.0、1.5、2.0、2.5W/cm2)808nm激光輻照5min，并記錄其升溫情況。在升溫過(guò)程中，使用光學(xué)顯微鏡觀察納米粒微氣泡產(chǎn)生情況，探索納米粒發(fā)生相變條件。

1.2.5FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒體外靶向性取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Y79細(xì)胞接種于6孔板，分為對(duì)照組、非靶向組、單葉酸靶組、單磁靶組、葉酸-磁雙靶組。對(duì)照組不加入納米粒，非靶向組及單磁靶組加入PFH-Fe3O4@ADM納米粒(0.625mg/mL)，單葉酸靶組及葉酸-磁雙靶組加入FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒(0.625mg/mL)，并于單磁靶組和葉酸-磁雙靶組的孔板側(cè)放約4T磁鐵1枚，靠近磁鐵側(cè)的細(xì)胞視為磁靶區(qū)域內(nèi)的細(xì)胞。細(xì)胞與納米粒共同孵育1h，離心除去未吞噬的納米粒，使用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，DAPI染色液染色細(xì)胞核，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察各組細(xì)胞吞噬情況，并進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)進(jìn)行定量分析。

1.2.6FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒體外超聲/光聲/MRI三模態(tài)成像將1.25mg/mL FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒置于4%的凝膠孔洞模型中，使用808nm激光儀(2W/cm2)分別作用0、1、2、3、5min，再使用光聲成像儀的B模式和造影模式分別記錄其超聲圖像并讀取相應(yīng)聲強(qiáng)值。將FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒配制為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL五個(gè)不同濃度，取200μL于3%的凝膠孔洞模型中，于光聲成像儀上檢測(cè)各濃度的光聲圖像并讀取相應(yīng)光聲信號(hào)值。將H2O和不同濃度(0.025、0.05、0.1、0.2、0.4mg/mL)FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒置于2mL圓底離心管中，使用磁共振成像系統(tǒng)檢測(cè)其T2像的磁共振圖像，并讀取計(jì)算相應(yīng)T2信號(hào)值。

2結(jié)果

2.1FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒的基本特征FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒制備成功，呈棕紅色乳液，鏡下可見(jiàn)其為大小均勻、分散性好的球形結(jié)構(gòu)(圖1A)，馬爾文粒徑分析儀檢測(cè)其分布為單峰，粒徑為338.6±2.20nm(圖1B)，電位為-26.6±0.62mV。紫外分光光度法檢測(cè)ADM的回歸方程為：y=0.01474x+0.04893(x表示ADM溶液濃度，y表示吸光度)，R2=0.9975(圖1C)，ADM的包封率為(41.76±4.12)%，載藥量為(6.96±0.69)%。ICP-OES檢測(cè)Fe的回歸方程為：y=17183.6480x-46.8579(x表示標(biāo)準(zhǔn)Fe溶液濃度，y表示響應(yīng)強(qiáng)度)，R2=1.0000(圖1C)，F(xiàn)e的包封率為(59.06±13.63)%，載藥量為(7.13±1.65)%。VSM檢測(cè)納米粒具有超順磁性，并觀察到納米粒能夠在磁場(chǎng)下定向聚集(圖1D)。

圖1 FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒的基本特征 A：納米粒乳液及光鏡和透射電鏡下觀察情況；B：納米粒粒徑分布圖；C：ADM及Fe檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線；D：納米粒的磁滯曲線及磁性能觀察圖。

2.2FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒的細(xì)胞毒性CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度(0、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6mg/mL FA-PFH-Fe3O4@ADM)組細(xì)胞存活率分別為(1.00±0.00)%、(0.96±0.12)%、(0.94±0.06)%、(0.95±0.16)%、(0.88±0.06)%、(0.87±0.11)%，各組細(xì)胞存活率均較高，即使在高濃度下，細(xì)胞存活率也能達(dá)到85%以上，且各組細(xì)胞存活率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.80，P>0.05)，證明納米粒的生物安全性良好。

2.3FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒的光熱效應(yīng)及光致相變能力體外光熱實(shí)驗(yàn)顯示，F(xiàn)A-PFH-Fe3O4@ADM納米?？梢栽?08nm激光輻照下產(chǎn)生光熱效應(yīng)，且升溫速度和最高溫度與納米粒的濃度及激光功率呈正相關(guān)(圖2A～D)。激光輻照后，顯微鏡下觀察納米粒可以發(fā)生液氣相變，生成微氣泡(圖2E)。

圖2 FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒的光熱效應(yīng)及光致相變能力 A：不同濃度納米粒在808nm激光輻照(2W/cm2)下的升溫曲線；B：不同濃度納米粒在808nm激光輻照(2W/cm2)下的升溫圖；C：納米粒(0.625mg/mL)在不同功率808nm激光輻照下的升溫曲線；D：納米粒(0.625mg/mL)在不同功率808nm激光輻照下的升溫圖；E：相變前后納米粒光鏡下觀察結(jié)果。

2.4FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒體外靶向性激光共聚焦顯微鏡下，ADM呈紅色熒光，Y79細(xì)胞核DAPI染色呈藍(lán)色熒光。對(duì)照組和非靶向組細(xì)胞中幾乎不可見(jiàn)納米粒，單葉酸靶組和單磁靶組細(xì)胞中可見(jiàn)部分納米粒，葉酸-磁雙靶組細(xì)胞中可見(jiàn)大量納米粒(圖3A)。流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，非靶向組、單葉酸靶組、單磁靶組、葉酸-磁雙靶組吞噬率分別為(6.99±0.16)%、(43.36±5.91)%、(28.58±3.23)%、(86.19±0.55)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=196.3，P<0.05，圖3B)，與激光共聚焦顯微鏡所示結(jié)果一致。

圖3 FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒體外靶向性 A：激光共聚焦顯微鏡觀察各組細(xì)胞吞噬納米粒情況；B：流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)各組細(xì)胞吞噬納米粒情況，bP<0.01 vs 非靶向組。

2.5FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒體外超聲/光聲/MRI三模態(tài)成像體外超聲成像結(jié)果顯示，F(xiàn)A-PFH-Fe3O4@ADM納米粒在808nm激光輻射后，超聲信號(hào)明顯增強(qiáng)，且在B模式和造影模式下，平均聲強(qiáng)值與激光輻照時(shí)間均呈明顯正相關(guān)(R2=0.9812、0.9426，圖4A)。體外光聲成像結(jié)果顯示，F(xiàn)A-PFH-Fe3O4@ADM納米粒有明顯的光聲成像能力，其平均光聲信號(hào)值與納米粒濃度呈明顯正相關(guān)(R2=0.9721，圖4B)。體外MRI結(jié)果顯示，隨著納米粒濃度的增加，其平均信號(hào)值逐漸降低，呈明顯負(fù)相關(guān)(R2=0.9905，圖4C)，F(xiàn)A-PFH-Fe3O4@ADM納米粒r2值為43.73mM-1S-1。

圖4 FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒體外超聲/光聲/MRI三模態(tài)成像 A：納米粒在B模式和造影模式下經(jīng)808nm激光激發(fā)不同時(shí)間后體外超聲成像圖及聲強(qiáng)分析；B：不同濃度納米粒體外光聲成像圖及光聲信號(hào)分析；C：不同濃度納米粒體外MRI圖及信號(hào)分析。

3討論

臨床上通常使用眼底檢查、眼部B超、MRI檢查、熒光素眼底血管造影等手段確診RB，但這些檢查往往難以查明早期病變，從而延誤治療[14]。因此，目前仍然急需能夠在出現(xiàn)明顯可見(jiàn)的形態(tài)學(xué)改變之前，及早發(fā)現(xiàn)RB的診斷方法。近年來(lái)，分子成像技術(shù)逐漸被運(yùn)用到各類惡性腫瘤的研究中[15-16]，其可視化、靶向、無(wú)創(chuàng)等優(yōu)點(diǎn)在RB的早期診療上很有發(fā)展前景?；谂R床上的迫切需求，本研究結(jié)合分子影像學(xué)技術(shù)構(gòu)建了一種新型多功能納米分子探針FA-PFH-Fe3O4@ADM，其作為載體可以將藥物遞送至靶部位，進(jìn)行無(wú)創(chuàng)、實(shí)時(shí)、精細(xì)顯像。本研究成功使用雙乳化法，以生物相容性好、易載藥、易修飾的脂質(zhì)體[17]作為載體，制備了雙靶向多模態(tài)成像分子探針。

高效的靶向性是分子探針發(fā)揮效用的基礎(chǔ)，本研究制備的FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒平均粒徑僅338.6±2.20nm，可以穿過(guò)血管內(nèi)皮細(xì)胞到達(dá)腫瘤部位，通過(guò)實(shí)體瘤的高通透性和滯留效應(yīng)被動(dòng)聚集于腫瘤組織，但其作用能力有限。主動(dòng)靶向作用能使納米粒更高效地聚集于目標(biāo)組織，其中配體-受體介導(dǎo)的主動(dòng)靶向及磁靶向是近年研究的熱點(diǎn)。葉酸受體在多種惡性腫瘤高表達(dá)[18]，具有葉酸靶向功能的納米粒已成功應(yīng)用于多種惡性腫瘤的診療，Wu等[19]制備的葉酸靶向納米分子探針可通過(guò)與RB細(xì)胞表面的葉酸受體結(jié)合，特異性地聚集于RB細(xì)胞周圍。但由于特異性受體具有飽和效應(yīng)及腫瘤微環(huán)境的阻礙，導(dǎo)致配體修飾型主動(dòng)靶向探針的靶向能力受到一定限制。磁靶向是一種新型主動(dòng)靶向模式，Suciu等[20]發(fā)現(xiàn)SPION作為磁靶，在外加磁場(chǎng)的作用下會(huì)聚集在作用部位，并且具有穩(wěn)定、高效、低毒的特點(diǎn)?；谝陨涎芯浚Y(jié)合本課題組前期對(duì)葉酸-磁雙靶向納米粒的探索[21]，本研究將配體-受體介導(dǎo)的分子靶向的特異性與磁靶向的高效性相結(jié)合，構(gòu)建了雙靶向分子探針。尋靶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒的雙重靶向性能，葉酸-磁雙靶組視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤Y79細(xì)胞吞噬納米粒的數(shù)量約為單葉酸靶組和單磁靶組的2～3倍，實(shí)現(xiàn)了探針在Y79細(xì)胞內(nèi)的高效聚集。

目前，分子成像技術(shù)包括超聲、電子計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT)、熒光、MRI、單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描儀/正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描(SPECT/PET)等，單一成像技術(shù)難以滿足臨床多樣化的需求，集其中多種成像優(yōu)勢(shì)于一體的多模態(tài)造影劑是研究的熱點(diǎn)。Xiao等[22]制備的以PFH為內(nèi)核的相變型納米超聲分子，能夠通過(guò)近紅外激光的激發(fā)，發(fā)生光致相變，將PFH由液態(tài)轉(zhuǎn)變成氣態(tài)，即液氣相變，從而增強(qiáng)超聲顯影，實(shí)現(xiàn)了腫瘤的早期診斷。光聲成像是一種新型的成像方式，通過(guò)物質(zhì)吸收光產(chǎn)生超聲信號(hào)，具有高對(duì)比度和分辨率。MRI是臨床常用的RB診斷方式，SPION作為美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)認(rèn)證用于腫瘤的磁共振顯像劑，可以準(zhǔn)確提供腫瘤及其周邊組織信息。Sivakumar等[23]設(shè)計(jì)的靶向納米復(fù)合材料中，SPION既可以通過(guò)吸收近紅外光進(jìn)行光聲成像，也可以通過(guò)對(duì)T2像的負(fù)性增強(qiáng)來(lái)進(jìn)行磁共振成像。結(jié)合以上研究，本研究制備的FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒在體外通過(guò)激光激發(fā)可增強(qiáng)超聲/光聲成像，且以SPION作為T(mén)2對(duì)比劑增強(qiáng)了磁共振成像，實(shí)現(xiàn)了實(shí)時(shí)全面精準(zhǔn)的成像。

此外，Dolatkhah等[24]制備了GO-SPION-MTX納米復(fù)合材料，其中SPION在近紅外光的作用下具有光熱轉(zhuǎn)換能力，可以對(duì)乳腺癌進(jìn)行光熱治療。本研究探究了在808nm激光作用下FA-PFH-Fe3O4@ADM的光熱性能，證明納米粒有進(jìn)行光熱治療的潛力。與此同時(shí)，隨著納米粒溫度升高，PFH發(fā)生液氣相變，有利于化療藥物的釋放。由此可見(jiàn)，F(xiàn)A-PFH-Fe3O4@ADM納米粒具有激光作用下治療RB的潛力，但其治療效果和作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究成功制備了葉酸靶向聯(lián)合磁靶向、包裹ADM的相變型納米粒(FA-PFH-Fe3O4@ADM)，在優(yōu)化的葉酸-磁雙靶作用下，納米粒在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤Y79細(xì)胞內(nèi)大量聚集，并進(jìn)行了體外超聲/光聲/MRI三模態(tài)顯像，實(shí)現(xiàn)了體外精準(zhǔn)靶向及顯像，為RB的早期診斷帶來(lái)了新的希望。與此同時(shí)，F(xiàn)A-PFH-Fe3O4@ADM納米粒具有光熱效應(yīng)并能在激光下發(fā)生光致相變，為進(jìn)一步的光熱聯(lián)合化療奠定了基礎(chǔ)。