張秀華，劉英梅，郭新艷，張小剛，張艷艷，張曉元，劉 飛

（山東省藥學(xué)科學(xué)院 山東省生物藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東省多糖類藥物工程實(shí)驗(yàn)室 多糖類藥物發(fā)酵與精制國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250101）

氧化還原反應(yīng)是酶法催化中的一類重要反應(yīng)，在手性醇、羥基酸、手性胺等制備過(guò)程中均有發(fā)生，氧化還原反應(yīng)中需要大量的輔酶NAD(P)H參與，而輔酶價(jià)格昂貴，限制了其工業(yè)應(yīng)用。因此利用酶法高效、低成本地再生還原態(tài)輔酶，實(shí)現(xiàn)輔酶循環(huán)是氧化還原反應(yīng)實(shí)現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用的關(guān)鍵[1-2]。

葡萄糖脫氫酶（EC 1.1.1.47，glucose 1-dehydrogenase，GDH）主要來(lái)自于芽孢桿菌屬，能特異性地催化D-葡萄糖生成葡萄糖酸，并伴隨輔酶NAD(P)+向還原型輔酶NAD(P)H的轉(zhuǎn)化，因此在輔酶循環(huán)系統(tǒng)中，GDH通常為生物催化氧化還原反應(yīng)提供還原氫[3-4]。GDH是一種細(xì)胞內(nèi)蛋白，在多種菌株種都有表達(dá)，但不同來(lái)源的GDH生化特性（活性、酶學(xué)特性）不同[5]，因此針對(duì)不同的催化反應(yīng)需篩選不同來(lái)源的酶。

3A-羥基-7-氧代-5B-膽烷酸是酶法催化生成熊去氧膽酸的底物，該底物不溶于水，易溶于有機(jī)溶劑，且在堿性條件下溶解性較好，而酶與緩沖液均溶解于水相體系，因此該反應(yīng)需在水相和有機(jī)相雙相體系中進(jìn)行。GDH是該反應(yīng)中輔酶再生的關(guān)鍵，篩選一種耐堿、耐有機(jī)溶劑的GDH是酶法工業(yè)化生產(chǎn)熊去氧膽酸的關(guān)鍵。

為解決酶法催化3A-羥基-7-氧代-5B-膽烷酸生成熊去氧膽酸反應(yīng)中輔酶再生問(wèn)題，本實(shí)驗(yàn)室前期從土壤中篩選得到一株產(chǎn)GDH的枯草芽孢桿菌，在大腸桿菌Escherichia coli BL21 (DE3)中進(jìn)行了重組表達(dá)。本文對(duì)重組葡萄糖脫氫酶（rGDH）最適反應(yīng)溫度、最適pH、輔酶依賴性、有機(jī)溶劑耐受性、金屬離子耐受性、動(dòng)力學(xué)常數(shù)等酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，以為其工業(yè)化應(yīng)用提供支持。

1 儀器與材料

1.1 儀器

1.2 試劑

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（簡(jiǎn)稱輔酶I，NAD+），還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（簡(jiǎn)稱還原型輔酶II，NADPH），煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（NADP+，上海源葉）；蛋白分子量標(biāo)記物（Thermo Fisher Scientific）；異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG，索萊寶生物科技有限公司），Ni NTA Beads（常州天地人和生物科技有限公司）；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.3 菌株與培養(yǎng)基

E. coli DH5α，E. coli BL21 (DE3)，重組大腸桿菌E. coli BL21-pET22b-GDH均為本實(shí)驗(yàn)室保存。液體LB培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10，酵母粉5，氯化鈉10；固體LB培養(yǎng)基含1.5 %～2 %瓊脂粉；TB培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨12，酵母粉24，甘油4，磷酸二氫鉀2.31，磷酸氫二鉀12.54。

2 方法

2.1 rGDH蛋白的表達(dá)及純化

將E. coli BL21-pET22b-GDH工程菌接種至含50 μg/ml氨芐霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。將其作為種子液以5 %接種量轉(zhuǎn)接入TB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至OD600為0.6時(shí)，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，降低溫度至16 ℃繼續(xù)培養(yǎng)20 h。收集菌體進(jìn)行超聲破碎（功率400 W，超聲5 s，間歇5 s，超聲時(shí)間20 min），12 000 r/min離心15 min，收集上清，0.22 μm濾膜過(guò)濾，得粗酶液。

粗酶液采用鎳離子親和層析柱進(jìn)行純化，平衡緩沖液為50 mmol/L NaH2PO4、300 mmol/L NaCl、10 mmol/L咪唑（pH 8.0），洗滌緩沖液為50 mmol/L NaH2PO4、300 mmol/L NaCl、25 mmol/L咪唑（pH 8.0），洗脫緩沖液為50 mmol/L NaH2PO4、300 mmol/L NaCl、250 mmol/L咪唑（pH 8.0）。分別收集穿透峰、洗滌峰和洗脫峰進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，收集rGDH蛋白峰，除鹽，得到純化后的rGDH蛋白。

2.2 rGDH酶活測(cè)定

rGDH酶活測(cè)定參考張波濤[6]方法并略有改進(jìn)?？偡磻?yīng)體系為200 μl，分別加入終濃度為75 mmol/L的Tris-HCl（pH 8.0）、2 mmol/L的NADP+、0.1 mol/L的D-葡萄糖，室溫放置2 min，加入適量酶液檢測(cè)2 min內(nèi)340 nm處吸光值的變化。配制濃度為0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mmol/L的系列NADPH標(biāo)準(zhǔn)溶液，在340 nm處測(cè)定吸光值，以NADPH標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，以吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算反應(yīng)產(chǎn)生NADPH的量。在上述條件下每分鐘生成1 μmol NADPH所需的酶量定義為一個(gè)酶活單位（U）。蛋白質(zhì)含量采用Bradford法測(cè)定，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品。按下式計(jì)算酶比活。

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算NADPH的量。

2.3 rGDH最適反應(yīng)溫度及溫度穩(wěn)定性測(cè)定

按2.2項(xiàng)下方法測(cè)定rGDH在不同溫度（25～65 ℃，溫度間隔為5 ℃）下的相對(duì)酶活力，以最高相對(duì)酶活力對(duì)應(yīng)的溫度定義為rGDH的最適反應(yīng)溫度。將酶液置于25～65 ℃下保溫1 h，按2.2項(xiàng)下方法測(cè)定殘留酶活力，以存放于4 ℃的樣品酶活作為最高酶活。

2.4 rGDH最適反應(yīng)pH及pH穩(wěn)定性測(cè)定

在最適溫度下，按2.2項(xiàng)下方法測(cè)定rGDH在不同pH緩沖液[100 mmol/L 檸檬酸-Na2HPO4緩沖液（pH 3.0～7.0），100 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.5～9.0），100 mmol/L Gly-NaOH 緩沖液（pH 9.5～13）]中的相對(duì)酶活力，將最高相對(duì)酶活對(duì)應(yīng)的pH定義為rGDH的最適反應(yīng)pH。將酶分別放置在不同pH的緩沖液中，4 ℃放置24 h，按2.2項(xiàng)下方法測(cè)定殘留酶活力，從而判斷rGDH在不同pH 值下的穩(wěn)定性。

蘇婷婷在前面，杰克跟在后面，杰克不解地：婷婷，你聽(tīng)我說(shuō)，我沒(méi)想到會(huì)是這樣。蘇婷婷面無(wú)表情：我說(shuō)過(guò)了，你這一套對(duì)付我可以，對(duì)付我爸不行！杰克聳聳肩：我搞不明白？難道你不是你爸生的？蘇婷婷停下來(lái)，轉(zhuǎn)過(guò)身無(wú)奈地：杰克，要不咱們分手吧？杰克愣了，嚴(yán)肅地?fù)u著頭：N O N O!婷婷，我愛(ài)你，真的愛(ài)你！用中國(guó)話說(shuō)，海枯石爛！天長(zhǎng)地久！在天愿作比翼鳥(niǎo)，在地還作比翼鳥(niǎo)。說(shuō)著，他伸開(kāi)胳膊，做出飛鳥(niǎo)狀。蘇婷婷上前摟住他的脖子，杰克順勢(shì)把她抱起來(lái)，向前跑去：咱們飛了！

2.5 金屬離子和EDTA對(duì)rGDH酶活的影響

將純化后的重組rGDH與終濃度為2 mmol/L的不同金屬離子（Cu2+、Mg2+、Na+、Co2+、Ba2+、Ni2+、Mn2+、Zn2+、Fe2+、Al3+）、EDTA溶液混合，40 ℃保溫1 h，按2.2項(xiàng)下方法測(cè)定殘余酶活力。同樣條件下不加金屬離子和EDTA處理的酶活定義為100 %，當(dāng)殘余酶活力為80 %以下即定義為有抑制作用[7]。

2.6 rGDH有機(jī)溶劑穩(wěn)定性測(cè)定

將純化后的重組rGDH與等體積的不同有機(jī)溶劑（乙醇、正丁醇、甲醇、正戊醇、正己烷、N,N’-二甲基甲酰胺、丙酮、環(huán)己酮、異丙醇、乙酸乙酯）混合，按2.2項(xiàng)下方法測(cè)定酶活力，將同樣條件下只加緩沖液處理的酶活定義為100 %。當(dāng)殘余酶活力為50 %以下即定義為該有機(jī)溶劑對(duì)酶有明顯的抑制作用。

2.7 rGDH底物譜分析及動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定

按2.2項(xiàng)下方法，分別以D-葡萄糖、D-木糖、D-半乳糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、D-甘露糖、D-果糖為底物，測(cè)定rGDH的相對(duì)酶活力。將最高相對(duì)酶活力所對(duì)應(yīng)的底物定義為最適底物。以不同濃度的D-葡萄糖（0.05～0.5 mol/L）為底物，按2.2項(xiàng)下方法，采用Origin 2018軟件進(jìn)行非線性擬合，計(jì)算rGDH對(duì)D-葡萄糖的Km值。

2.8 rGDH輔酶偏好性分析

按2.2項(xiàng)下方法，以D-葡糖糖為底物，分別以NAD+和NADP+為輔酶，分別測(cè)定純化后的rGDH酶活，確定rGDH輔酶偏好性。

3 結(jié)果

3.1 rGDH蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

重組菌經(jīng)超聲破碎、離心后得到粗酶液， 粗酶液經(jīng)鎳離子親和層析柱純化，經(jīng)SDS-PAGE分析檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示穿透峰和洗滌峰中均為雜蛋白，純化后的rGDH為單一條帶（泳道4），在最適反應(yīng)條件下測(cè)得其比活為12 U/mg。

圖1 rGDH 純化后SDS-PAGE結(jié)果

3.2 rGDH最適反應(yīng)溫度及溫度穩(wěn)定性

結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可見(jiàn)，rGDH最適反應(yīng)溫度為40 ℃，在35～50 ℃范圍內(nèi)酶催化活力較高。研究發(fā)現(xiàn)，rGDH溫度穩(wěn)定性較差，在40 ℃以下可保持較高酶活力，但當(dāng)溫度大于40 ℃時(shí)酶活力急劇下降，當(dāng)溫度達(dá)到55 ℃時(shí)酶活力幾乎完全喪失。

圖2 rGDH最適反應(yīng)溫度及溫度穩(wěn)定性

3.3 rGDH最適反應(yīng)pH及pH穩(wěn)定性測(cè)定

結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可見(jiàn)，rGDH最適反應(yīng)pH為10.5，在pH 9.5～11范圍內(nèi)酶催化活力較高，說(shuō)明該酶耐堿性較強(qiáng)。同樣，該酶的pH穩(wěn)定性也較差，僅在pH 9～11范圍內(nèi)保持較高酶活力，當(dāng)pH過(guò)高或過(guò)低時(shí)酶活力均急劇下降。

圖3 rGDH最適反應(yīng)pH及pH穩(wěn)定性

3.4 金屬離子和EDTA對(duì)rGDH酶活的影響

結(jié)果見(jiàn)圖4。結(jié)果表明，Zn2+、Ba2+、Mn2+、EDTA、Al3+、Fe2+均對(duì)rGDH酶活有促進(jìn)作用，其中以Zn2+的酶活促進(jìn)作用最強(qiáng)，相對(duì)酶活力可達(dá)140 %。Ni2+、Na+、Co2+對(duì)酶活影響不明顯，Mg2+、Cu2+對(duì)rGDH酶活有抑制作用，其中以Cu2+抑制作用最強(qiáng)，相對(duì)酶活僅50 %。

圖4 金屬離子和EDTA對(duì)rGDH酶活的影響

3.5 rGDH有機(jī)溶劑穩(wěn)定性

結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可見(jiàn)，幾乎所有有機(jī)溶劑會(huì)降低rGDH酶活，其中以正己烷影響作用最小，rGDH與正己烷混合后，酶活力仍保持在95 %以上，說(shuō)明該酶對(duì)正己烷具有較好的耐受性；而在異丙醇、丙酮、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、正戊醇、環(huán)己酮、正丁醇、N, N’-二甲基甲酰胺中rGDH殘留酶活不足30 %，說(shuō)明有機(jī)溶劑對(duì)rGDH酶活有很大影響。

圖5 rGDH有機(jī)溶劑穩(wěn)定性

3.6 rGDH底物譜分析及動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定

結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可見(jiàn)，rGDH底物特異性較強(qiáng)，當(dāng)以D-葡萄糖為底物時(shí)其催化活性最高，rGDH對(duì)乳糖的催化活性是對(duì)D-葡萄糖催化活性的48 %，而對(duì)D-木糖、D-半乳糖、麥芽糖、蔗糖、D-甘露糖、D-果糖幾乎無(wú)催化活性。通過(guò)Origin 2018進(jìn)行非線性擬合，計(jì)算得到rGDH對(duì)D-葡萄糖的Km值為0.3 mol/L。

3.7 rGDH輔酶偏好性分析

結(jié)果見(jiàn)圖7。由圖7可見(jiàn)，該酶在催化NAD+和NADP+兩種底物時(shí)均具有較高的酶活，說(shuō)明rGDH是一種NAD+、NADP+雙輔酶依賴型葡萄糖脫氫酶，可同時(shí)用于還原性輔酶NADH和NADPH的再生，但對(duì)NAD+的親和力更強(qiáng)。

圖7 rGDH輔酶偏好性分析

4 討論

GDH應(yīng)用非常廣泛，在臨床上可作為血糖測(cè)定的診斷用酶，在醫(yī)藥工業(yè)領(lǐng)域可為生物催化反應(yīng)提供還原氫，進(jìn)行輔酶再生[7]。近年，隨著合成生物學(xué)的發(fā)展，GDH的研究也較多。本研究從土壤中篩選得到一株產(chǎn)GDH的枯草芽孢桿菌，提取其基因組后利用PCR擴(kuò)增出GDH基因序列。將擴(kuò)增得到的基因序列與Genebank中已報(bào)道的序列進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該酶與已報(bào)道的MH192986葡萄糖脫氫酶氨基酸同源性達(dá)82 %，但后者未報(bào)道其酶學(xué)特性。

本課題中篩選得到的rGDH酶活高，比活達(dá)到12 U/mg，高于目前報(bào)道的水平[6,8-11]。酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定顯示該酶對(duì)有機(jī)溶劑正己烷有很高的耐受性，相對(duì)酶活達(dá)95 %，同時(shí)該酶耐堿性良好，在pH 9.0～11.0范圍內(nèi)有很高酶活，耐堿性優(yōu)于Ding等[12]報(bào)道的從球形芽孢桿菌G10中克隆的耐堿性GDH。良好的有機(jī)溶劑耐受性和耐堿性為熊去氧膽酸的轉(zhuǎn)化奠定了良好的基礎(chǔ)，具備了適合工業(yè)應(yīng)用的理想特性。在制備熊去氧膽酸轉(zhuǎn)化偶聯(lián)輔酶再生體系中，添加rGDH后熊去氧膽酸的產(chǎn)率達(dá)98 %，是未添加rGDH的40倍，表明rGDH可為生物催化反應(yīng)提供輔酶再生，解決了生物催化反應(yīng)中輔酶限制問(wèn)題。

為進(jìn)一步提升該酶的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值，后續(xù)研究將基于定向進(jìn)化[13]和理性設(shè)計(jì)[14]理念，提升rGDH催化穩(wěn)定性和對(duì)其他有機(jī)溶劑的耐受性。