侯秋苑，馮白茹，殷 蕾，申 茹

（惠州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東 惠州 516025）

菟絲子顆粒為菟絲子的單方顆粒劑。菟絲子味甘、辛，性平，是常用的補(bǔ)益中藥，具有補(bǔ)益肝腎，明目，固精縮尿，安胎及止瀉等功效[1-3]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，菟絲子提取物具有補(bǔ)腎、護(hù)肝、免疫調(diào)節(jié)、抗衰老、抗疲勞、安胎、改善卵巢早衰及生殖保護(hù)等作用，并提示其有效成分為黃酮類物質(zhì)[4-10]。為保證藥品質(zhì)量，保障人體用藥安全，本文對(duì)菟絲子顆粒的制備工藝和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了研究。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

JA3003電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；ZF-7型暗箱三用紫外分析儀（上海和勤分析儀器有限公司）；Agilent 1260高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；PS-40A超聲波清潔機(jī)（深圳市科潔超聲科技有限公司）；SHZD(III)型循環(huán)水真空泵（廣州市星爍儀器有限公司）；RE-3000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海越眾儀器設(shè)備有限公司）；YK-60小型顆粒機(jī)（吉首市中誠(chéng)制藥機(jī)械有限公司）；BPG-9240A鼓風(fēng)干燥箱（上海百典儀器設(shè)備有限公司）。

1.2 試藥

金絲桃苷對(duì)照品（含量≥98 %，批號(hào)：160201，北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司）；菟絲子顆粒（自制，批號(hào)：170701，170702，170703，170704，170705）；聚酰胺薄膜（浙江省臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠）；甲醇（色譜純，批號(hào)：20161020，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；乙腈（色譜純，批號(hào)：160918，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 金色桃苷含量測(cè)定

采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定[1,11-12]。色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1 %磷酸溶液（15:85）；檢測(cè)波長(zhǎng)：360 nm；柱溫：25 ℃；流速：1.0 ml/min；進(jìn)樣量：10 μl。理論塔板數(shù)按金絲桃苷峰計(jì)算應(yīng)不低于5000[1,11]。

2.2 制備工藝研究

2.2.1 提取工藝 取菟絲子，粉碎成中粉，加75 %乙醇浸泡50 min，加熱回流提取3次，每次1 h[13]，合并提取液，濾過。

2.2.2 濃縮工藝研究 取菟絲子提取液50 ml，分別在減壓70 ℃、80 ℃、90 ℃，常壓90 ℃、100 ℃條件下濃縮至10 ml，過濾，濾液按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，不同濃縮條件下濃縮液中金絲桃苷含量變化不大，考慮到濃縮效率及成本，最終選擇在減壓80 ℃環(huán)境下對(duì)提取液進(jìn)行濃縮。

表1 濃縮條件考察結(jié)果

取菟絲子提取液，減壓80 ℃濃縮，在濃縮過程中認(rèn)真觀察菟絲子濃縮液狀態(tài)，濃縮至濃縮液黏稠且掛壁后及時(shí)從燒瓶?jī)?nèi)轉(zhuǎn)移適量至100 ml量筒中，垂直放進(jìn)密度計(jì)測(cè)定該菟絲子稠膏的相對(duì)密度為1.15。

綜上，確定菟絲子提取液的濃縮工藝為減壓80 ℃濃縮，濃縮至濃縮液呈黏稠狀且掛壁后測(cè)定其相對(duì)密度，測(cè)得相對(duì)密度在1.15（80 ℃）以上即可。

2.2.3 制劑成型工藝研究 取菟絲子提取濃縮液5.0 g，共6份，分別以常用輔料淀粉、乳糖、微晶纖維素、糊精、蔗糖、可溶性淀粉和糖粉制備顆粒，以顆粒流動(dòng)性、引濕性及成型率[14]為主要考察指標(biāo)，結(jié)果見表2。

表2 輔料種類考察結(jié)果

由表2可見，只有乳糖與糖粉的成型性符合制粒要求，但用量大且流動(dòng)性不佳，其余4種輔料制得的顆粒細(xì)粉多或不成粒，均未達(dá)到制粒要求，綜合考慮下選用淀粉、乳糖、微晶纖維素和糊精這4種輔料進(jìn)行后續(xù)的復(fù)合配比研究，結(jié)果見表3。

由表3可見，微晶纖維素:乳糖為1:5時(shí)所得顆粒硬度適中，成型率高，流動(dòng)性及引濕性好，最終確定菟絲子顆粒輔料為微晶纖維素、乳糖，微晶纖維素:乳糖=1:5，經(jīng)驗(yàn)證，菟絲子濃縮液與混合輔料的比例確定為1:2.5。

表3 輔料配比考察結(jié)果

2.2.4 制備工藝 取菟絲子，粉碎成中粉，加75 %乙醇浸泡50 min，加熱回流提取3次，每次1 h，合并提取液，濾過，濾液80 ℃下減壓濃縮，得相對(duì)密對(duì)1.15的稠膏，加入輔料（微晶纖維素:乳糖=1:5），混合均勻，制成顆粒，干燥，即得。

2.3 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

2.3.1 薄層色譜（TLC）鑒別[1,11]

2.3.1.1 對(duì)照品溶液的制備 取金絲桃苷對(duì)照品2 mg，精密稱定，置入100 ml量瓶，加甲醇制成濃度為0.02 mg/ml的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.3.1.2 供試品溶液的制備 取本品0.5 g，加甲醇40 ml，加熱回流30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? ml使溶解，作為供試品溶液。

2.3.1.3 陰性樣品溶液的制備 取不含菟絲子稠膏的空白輔料顆粒0.5 g，按2.3.1.2項(xiàng)下方法制成菟絲子顆粒陰性樣品溶液。

2.3.1.4 TLC條件及結(jié)果 分別吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液和陰性樣品溶液各1～2 μl，分別點(diǎn)于同一聚酰胺薄膜上，以甲醇-冰醋酸-水（9:0.5:0.5）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以三氯化鋁試液，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性樣品在相應(yīng)位置上不顯示熒光斑點(diǎn)（見圖1），表明輔料對(duì)TLC鑒別無干擾。

圖1 菟絲子顆粒TLC圖譜

2.3.2 含量測(cè)定

2.3.2.1 色譜條件[1,11-12]同2.1項(xiàng)下色譜條件。

2.3.2.2 對(duì)照品溶液的制備 取金絲桃苷對(duì)照品5 mg，精密稱定，置入100 ml量瓶，加甲醇制成每1 ml含50 μg的溶液，即得。

2.3.2.3 供試品溶液的制備 取菟絲子顆粒適量，研細(xì)，取約1 g，精密稱定，置于50 ml量瓶中，加入75 %乙醇40 ml，超聲處理（功率240 W，頻率40 kHz）15 min，放冷，加75 %乙醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3.2.4 陰性樣品溶液的制備 取不含菟絲子稠膏的空白輔料顆粒適量，研細(xì)，取約0.5 g，精密稱定，置于50 ml量瓶中，加入75 %乙醇40 ml，超聲處理（功率240 W，頻率40 kHz）15 min，放冷，加75 %乙醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為菟絲子顆粒的陰性樣品溶液。

2.3.2.5 專屬性試驗(yàn) 分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液各10 μl，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果見圖2。供試品溶液的色譜圖中，在與對(duì)照品溶液的色譜圖相應(yīng)的位置上，有相同保留時(shí)間的色譜峰，而陰性樣品溶液在此保留時(shí)間處無色譜峰，表明輔料對(duì)金絲桃苷的HPLC檢測(cè)無干擾。

圖2 菟絲子顆粒中金絲桃苷含量測(cè)定的HPLC圖譜

2.3.2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密稱取金絲桃苷對(duì)照品10.00 mg，置10 ml量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備溶液0.10，0.20，0.50，1.00，5.00 ml，分別置入10 ml量瓶，加甲醇稀釋至刻度，配制成濃度為0.01，0.02，0.05，0.10，0.50 mg/ml的金絲桃苷對(duì)照品溶液。分別精密吸取上述溶液各10 μl，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以金絲桃苷對(duì)照品的質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程：Y=19 817X-14.351，r=1.0000。結(jié)果表明金絲桃苷進(jìn)樣濃度在0.01～0.50 mg/ml的范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.3.2.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取供試品（批號(hào)：170703）溶液10 μl，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得金絲桃苷峰面積的RSD為0.26 %（n=6），說明儀器精密度良好。

2.3.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批供試品（批號(hào)：170703）的細(xì)粉6份，各約1.0 g，精密稱定，按2.3.2.3項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，測(cè)得金絲桃苷的平均含量為3.54 mg/g，RSD為0.91 %（n=6），說明方法重復(fù)性良好。

2.3.2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取2.3.2.3 項(xiàng)下供試品（批號(hào)：20170703）溶液10 μl，按2.1項(xiàng)下色譜條件，分別于0，2，4，6，8，10，12 h進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得金絲桃苷峰面積的RSD為0.34 %（n=7），說明供試品溶液12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.2.10 加樣回收試驗(yàn) 取已知含量的同一顆粒樣品（批號(hào)：170703）的細(xì)粉9份，每份約0.2 g，精密稱定，置于10 ml量瓶中，按表4準(zhǔn)確加入金絲桃苷對(duì)照品溶液（1.03 mg/ml）后，加入75 %乙醇40 ml，超聲處理（功率240 W，頻率40 kHz）15 min，放冷，加75 %乙醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定金絲桃苷含量并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表4。

表4 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

2.3.2.11 樣品含量測(cè)定 取批號(hào)為170701，170702，170703，170704，170705的菟絲子顆粒各1袋，按2.3.2.3項(xiàng)下方法制得供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，按回歸方程計(jì)算金絲桃苷的含量，結(jié)果見表5。

表5 供試品含量測(cè)定結(jié)果（n=2）

3 討論

3.1 輔料確定

研究發(fā)現(xiàn)，以淀粉為輔料制備的顆粒細(xì)粉多，以糊精為輔料制備的顆粒黏性強(qiáng)；以糖粉為輔料，制得的顆粒符合要求，但輔料用量大。采用微晶纖維素與乳糖（1:5）為輔料，用量符合要求，制得的顆粒成型且硬度適中，流動(dòng)性較好，幾乎沒有引濕性，成型率最高，最終選擇微晶纖維素與乳糖的復(fù)合輔料作為菟絲子顆粒的輔料。

3.2 TLC鑒別展開系統(tǒng)確定

首先采用2020年版《中國(guó)藥典》一部菟絲子鑒別項(xiàng)下規(guī)定的展開系統(tǒng)甲醇-冰醋酸-水（4:1:5）對(duì)顆粒進(jìn)行TLC鑒別，結(jié)果發(fā)現(xiàn)樣品主斑點(diǎn)拖尾情況嚴(yán)重，考慮可能是樣品的點(diǎn)樣量過大，減少樣品點(diǎn)樣量后采用同樣的展開系統(tǒng)展開，發(fā)現(xiàn)除了斑點(diǎn)的熒光顏色變淡外，拖尾情況無改善，經(jīng)分析可能是展開系統(tǒng)的極性偏大。調(diào)整展開劑比例，對(duì)以下展開系統(tǒng)進(jìn)行篩選：甲醇-冰醋酸-水（5:1:4）、甲醇-冰醋酸-水（6:1:3）、甲醇-冰醋酸-水（7:1:2）、甲醇-冰醋酸-水（9:0.5:0.5）、甲醇-冰醋酸（9:1）、乙醇-水（3:1）及甲醇，最后發(fā)現(xiàn)甲醇-冰醋酸-水（9:0.5:0.5）的展開效果最佳。

3.3 色譜條件確定

首先參考2020年版《中國(guó)藥典》一部菟絲子含量測(cè)定項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果金絲桃苷的分離度不符合要求，考慮可能是流動(dòng)相極性因素影響，調(diào)整流動(dòng)相比例為乙腈:0.1 %磷酸=15:85，此條件下金絲桃苷的分離度大于1.5。

3.4 供試品的提取溶劑和提取時(shí)間確定

對(duì)供試品溶液的提取溶劑（75 %乙醇，80 %乙醇，甲醇）和提取時(shí)間（超聲處理15，30，45，60 min）進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)75 %乙醇的提取效果明顯優(yōu)于甲醇和80 %乙醇，超聲15 min金絲桃苷的提取率可達(dá)95 %以上，故確定提取條件為75 %乙醇超聲時(shí)間15 min。

3.5 含量標(biāo)準(zhǔn)確定

根據(jù)5批菟絲子顆粒的含量測(cè)定結(jié)果，平均每克顆粒含金絲桃苷3.40 mg。結(jié)合現(xiàn)行版《中國(guó)藥典》中菟絲子藥材中金絲桃苷的含量不得少于0.10 %，以及考慮制劑生產(chǎn)和貯存等因素，暫定菟絲子顆粒中每克含金絲桃苷不得少于1.0 mg。