杜艷姣，李艷，段智慧，商丹丹

癲癇是神經(jīng)內(nèi)科最常見(jiàn)的疾病之一，但約1/3的患者為難治性癲癇，對(duì)抗癲癇藥物反應(yīng)不佳[1]，癲癇發(fā)作不能充分控制、治療效果差，會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的共病[2]，如認(rèn)知障礙、精神障礙甚至猝死，給患者的生活和家庭、社會(huì)帶來(lái)極壞的影響。大量的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)表明，炎癥途徑的激活可能是不同病因、不同類(lèi)型的癲癇發(fā)作的共同因素[3-4]，細(xì)胞焦亡在炎癥過(guò)程中起著重要的作用[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，在癲癇發(fā)作時(shí)，NLRP3炎性小體參與了細(xì)胞焦亡的發(fā)生過(guò)程[5-6]，參與依賴(lài)Caspase-1的經(jīng)典細(xì)胞焦亡途徑，調(diào)節(jié)IL-1β和IL-18的表達(dá)。P2X7R是一種ATP門(mén)控陽(yáng)離子非選擇性通道受體[7]，在IL-1β的形成和釋放中起重要作用，其作為腦組織炎癥反應(yīng)的重要靶點(diǎn)受到廣泛的關(guān)注[8]。在多種癲癇模型中，如海馬、杏仁核、梨狀皮層及新皮層等邊緣葉癲癇模型，P2X7R在癲癇發(fā)作的不同階段均有表達(dá)的上調(diào)[9-13]，且P2X7R的激活可引起和加重炎癥反應(yīng)[14-15]。多項(xiàng)研究表明，在先天性髓樣細(xì)胞(單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及樹(shù)突狀細(xì)胞)中的炎癥過(guò)程，P2X7R是NLRP3炎性小體的最有效的激活劑[16]。但在癲癇發(fā)作中，是否有P2X7R/NLRP3/Caspase-1信號(hào)通路的參與尚未可知，本研究通過(guò)對(duì)癲癇患者發(fā)作期(ES)和發(fā)作間期(EI)外周血中炎性介質(zhì)的檢測(cè)，證實(shí)這一假說(shuō)，為難治性癲癇提供新的治療靶點(diǎn)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2021年7月至2022年4月在鄭州大學(xué)附屬洛陽(yáng)中心醫(yī)院就診的難治性癲癇患者40例作為正常癲癇組；納入同期的健康體檢者40例作為正常對(duì)照組。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)癲癇組患者均符合2010國(guó)際抗癲癇聯(lián)盟(ILAE)對(duì)于難治性癲癇的定義[17]，應(yīng)用2種或2種以上的抗癲癇藥物足量治療，無(wú)發(fā)作時(shí)間<1年或3倍最長(zhǎng)的發(fā)作間期；(2)年齡18～80歲；(3)就診時(shí)發(fā)作頻率至少每月發(fā)作≥4次；(4)癲癇病程≥2年；(5)配合完成研究者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并急性感染，或患有心、肺、肝、腎及血液等全身系統(tǒng)疾病者；(2)患惡性腫瘤或精神障礙疾病者；(3)嚴(yán)重的肝腎功能損害者；(4)瀕?；颊?。本研究獲鄭州大學(xué)附屬洛陽(yáng)中心醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有納入者本人或家屬均簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 診斷及數(shù)據(jù)收集

由神經(jīng)內(nèi)科專(zhuān)科醫(yī)生根據(jù)2017癲癇分類(lèi)進(jìn)行癲癇的診斷分類(lèi)[18]，包括癲癇發(fā)作類(lèi)型、病因分類(lèi)及癲癇綜合征等；對(duì)所有納入者進(jìn)行臨床基本資料(年齡、性別、病程、發(fā)作類(lèi)型、病因分類(lèi)及抗癲癇用藥等)的采集，留取血液標(biāo)本，收集整理實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)。

1.2.2 方法

(1)抽取納入者的空腹靜脈血(約6 mL)，置于肝素抗凝的真空采血管中；(2)用密度梯度離心法分離收集外周血單個(gè)核細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行P2X7R表達(dá)的分析(Anti-P2X7R-FITC，Sigma)；(3)將外周血離心，取血漿在-20°C 凍存，備測(cè)。應(yīng)用NLRP3 ELISA試劑盒(北京索萊寶公司)、Caspase-1 ELISA試劑盒(武漢華美公司)、IL-1β ELISA試劑盒(北京索萊寶公司)、IL-18 ELISA試劑盒(北京索萊寶公司)，檢測(cè)血漿中的NLRP3、Caspase-1、IL-1β及IL-18的表達(dá)水平，試驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作；(4)檢測(cè)外周血中的紅細(xì)胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate，ESR)和血清C-反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 臨床基本資料

癲癇組40例中男性27例(68%)、女性13例(32%)，平均病程(4.98±3.21)年，發(fā)作類(lèi)型中局灶性起源19例(47%)、全面性起源13例(33%)、未知起源8例(20%)，病因分類(lèi)中結(jié)構(gòu)異常14例(35%)、感染性5例(13%)、免疫性6例(15%)、代謝性2例(5%)、遺傳性1例(2%)、原因不明12例(30%)，40例癲癇患者抗癲癇藥物(ASM)聯(lián)合用藥中2種28例(70%)、3種8例(20%)、4種4例(10%)，其中丙戊酸鈉30例(75%)、拉莫三嗪23例(57%)、奧卡西平21例(52%)、左乙拉西坦14例(35%)、托吡酯3例(7%)、苯巴比妥2例(5%)、氯硝西泮2例(5%)、拉考沙胺1例(2%)；正常對(duì)照組40例中男性24例(60%)、女性16例(40%)，所有納入者年齡18～72歲，癲癇組平均(47.10±17.83)歲，正常對(duì)照組平均(50.58±13.92)歲，癲癇組與對(duì)照組在性別及年齡等方面比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 兩組患者在P2X7R、NLRP3 、Caspase-1及炎性因子表達(dá)水平之間的比較

癲癇組患者P2X7R、NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18、ESR及CRP的表達(dá)均高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，結(jié)果詳見(jiàn)表1。應(yīng)用ANVOA單因素方差分析顯示，ES患者的外周血中P2X7R、NLRP3、Caspase-1及炎性因子(IL-1β、IL-18、ESR及CRP)的表達(dá)均高于EI患者及正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，且EI時(shí)P2X7R、NLRP3、Caspase-1及炎性相關(guān)指標(biāo)(IL-1β、IL-18)在外周血中的表達(dá)仍高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見(jiàn)圖1。

表1 正常對(duì)照組和癲癇組在炎性相關(guān)指標(biāo)之間的比較

注：CON為正常對(duì)照組，EI為癲癇發(fā)作間期，ES為癲癇發(fā)作期，ESR為紅細(xì)胞沉降率，CRP為C-反應(yīng)蛋白；**P<0.01，***P<0.001。圖1 癲癇組與正常對(duì)照組的炎癥相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)情況圖

3 討論

本研究通過(guò)對(duì)真實(shí)世界中癲癇組患者EI、ES與正常對(duì)照組進(jìn)行外周血檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)癲癇組患者P2X7R、NLRP3、Caspase-1及其釋放的IL-1β、IL-18均較正常對(duì)照組有明顯升高，提示癲癇發(fā)作可能激活P2X7R/NLRP3/Caspase-1炎性信號(hào)通路，導(dǎo)致癲癇組患者炎性指標(biāo)較正常對(duì)照組明顯升高，且這一信號(hào)通路的激活可延續(xù)到癲癇發(fā)作間期，這可能與癲癇復(fù)發(fā)有關(guān)。

有研究表明，自身免疫障礙是癲癇發(fā)作和誘因的關(guān)鍵因素[19]，例如Rusmussen腦炎及邊緣葉腦炎等[20-21]，可引起癲癇持續(xù)狀態(tài)和反復(fù)性難治性癲癇發(fā)作，且對(duì)于此類(lèi)患者，免疫治療較抗癲癇藥物治療更為有效[22]，Rusmussen腦炎患者手術(shù)病理也發(fā)現(xiàn)腦組織中小膠質(zhì)細(xì)胞活化、反應(yīng)性星型細(xì)胞增多及促炎性介質(zhì)的生成[21]。與此同時(shí)，炎癥也是非自身免疫性過(guò)程引起癲癇發(fā)病和加重的重要因素[19]，例如發(fā)熱及感染往往會(huì)導(dǎo)致癲癇發(fā)作和病情加重。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也表明，癲癇發(fā)作后，腦內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞被激活，釋放炎性介質(zhì)如IL-1β及HMGB1等，引發(fā)神經(jīng)炎癥，引起神經(jīng)元細(xì)胞的過(guò)度興奮、丟失，導(dǎo)致癲癇閾值的降低，出現(xiàn)癲癇發(fā)作，從而形成惡性循環(huán)[3]。

P2X7R是一種ATP門(mén)控陽(yáng)離子非選擇性通道受體，可由先天性和適應(yīng)性免疫細(xì)胞表達(dá)，與胞外一定濃度的腺苷 5'-三磷酸 (Adenosine 5 ′-triphosphate,ATP)結(jié)合而被激活，誘發(fā)炎癥反應(yīng)[7,14,16]。ATP是所有活細(xì)胞的中心能量分子，也參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化及死亡等基本過(guò)程[16]，同時(shí)它還是一種損傷相關(guān)分子模式 (DAMP)，組織或器官損傷發(fā)生后，可導(dǎo)致ATP在局部的蓄積，激活P2X7R[15]。NLRP3炎性小體是由NOD樣受體NLRP3、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白及Pro-caspase-1在細(xì)胞內(nèi)組成的大分子多蛋白復(fù)合物[23]，作為炎癥反應(yīng)平臺(tái)參與依賴(lài)Caspase-1的經(jīng)典細(xì)胞焦亡途徑，一方面可誘導(dǎo)細(xì)胞膜穿孔，細(xì)胞破裂，釋放內(nèi)容物，引起細(xì)胞焦亡和炎癥反應(yīng)；另一方面，活化的Caspase-1對(duì)IL-1β和IL-18的前體進(jìn)行切割，形成有活性的IL-1β和IL-18，釋放到細(xì)胞外，募集炎癥細(xì)胞聚集，擴(kuò)大炎癥反應(yīng)[24]。

有研究顯示，P2X7R是NLRP3的強(qiáng)烈激活劑[16]，具體機(jī)制為DAMP激活P2X7R后，導(dǎo)致離子通道開(kāi)放，從而細(xì)胞內(nèi)K+減少、Ca2+增加、ROS產(chǎn)生、線粒體去極化和溶酶體失穩(wěn)；其中細(xì)胞內(nèi)K+的流出是NLRP3激活的關(guān)鍵基本步驟之一。NLRP3炎性小體的激活，觸發(fā)Caspase-1參與的細(xì)胞焦亡和炎性反應(yīng)發(fā)生，導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子釋放[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，癲癇患者ES時(shí)，P2X7R/ NLRP3/ Caspase-1信號(hào)通路被激活，發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，P2X7R/ NLRP3/ Caspase-1表達(dá)明顯升高，導(dǎo)致IL-1β及IL-18等炎癥細(xì)胞因子釋放，表達(dá)量明顯增加，募集炎癥細(xì)胞聚集，擴(kuò)大炎癥反應(yīng)，提高神經(jīng)的興奮性，降低癲癇發(fā)作的閾值。在癲癇患者EI時(shí)， P2X7R/ NLRP3/ Caspase-1通路的表達(dá)仍高于正常對(duì)照組，說(shuō)明該通路在EI時(shí)仍有一定的激活，這也就解釋了癲癇患者在易感因素刺激下出現(xiàn)癲癇復(fù)發(fā)的原因。

綜上所述，本研究顯示癲癇發(fā)生后，P2X7R/NLRP3/Caspase-1信號(hào)通路可能參與了癲癇發(fā)生發(fā)展過(guò)程中炎癥相關(guān)的神經(jīng)損傷，此可能為難治性癲癇的治療提供新的靶點(diǎn)。