陳春宇，張佳琪，李依萍，米 娜，李 麗，易 帆,

（1.北京工商大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院，北京市植物資源研究開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100048；2.北京工商大學(xué)，中國(guó)輕工業(yè)化妝品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100048）

非酶糖基化反應(yīng)又稱美拉德反應(yīng)[1]，當(dāng)還原糖與氨基反應(yīng)生成不穩(wěn)定的希夫堿（Schiff bases），繼而重排形成較穩(wěn)定的阿馬多里（Amadori）重排產(chǎn)物，稱早期糖化產(chǎn)物；阿馬多里重排產(chǎn)物與蛋白質(zhì)的氨基作用，糖基部分經(jīng)脫水反應(yīng)后形成不飽和醛酮化合物；醛酮化合物再與蛋白質(zhì)的游離氨基作用，蛋白質(zhì)因分子間或分子內(nèi)交聯(lián)及裂解而變性，最終生成不可逆的非酶糖基化終末產(chǎn)物（Advanced Glycation End Products，AGEs）[2]。

AGEs的積累與許多退行性過(guò)程或疾病的發(fā)展相關(guān)[3-4]，包括糖尿病[5]、心血管疾病[6]、神經(jīng)紊亂[7]、動(dòng)脈粥樣硬化[8]及其并發(fā)癥等，以及加重涉及氧化應(yīng)激機(jī)制的病理過(guò)程和加快衰老的進(jìn)程[9]。AGEs能激活受體RAGE，進(jìn)而誘導(dǎo)并進(jìn)一步促進(jìn)氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生，同樣誘導(dǎo)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)發(fā)生以及促進(jìn)促炎細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子的表達(dá)[10]。AGEs還可以通過(guò)交聯(lián)胞內(nèi)外蛋白質(zhì)，破壞蛋白結(jié)構(gòu)、變形，最終使蛋白失去生物學(xué)特性。因此，AGEs抑制劑作為預(yù)防或減輕這些疾病的治療藥物十分具有前景。

AGEs抑制劑主要分為合成和天然兩大類。化學(xué)合成抑制劑如氨基胍（AG）、吡哆胺、二甲雙胍等雖然具有抑制AGEs的作用，但也伴隨著腸胃功能紊亂、罕見(jiàn)血管炎等副作用和安全隱患[11]。因此，從食物中提取天然生物活性物質(zhì)病開(kāi)發(fā)成AGEs抑制劑已引起研究人員的廣泛關(guān)注。研究表明，多酚類化合物是天然AGEs抑制劑的重要來(lái)源，肉桂酸及其衍生物、綠原酸、丁香酸、香草酸、鞣花酸、槲皮素、染料木素、沒(méi)食子酸等重要酚類化合物有效抑制糖基化已見(jiàn)報(bào)道[12]。

別樣茶（non-Camelliateas）在民間常作為預(yù)防及治療疾病的藥物，在部分地區(qū)和民族范圍內(nèi)有作茶飲用的悠久歷史，有一定的安全性基礎(chǔ)，具有作為新藥研究和保健品開(kāi)發(fā)的潛力[13]。有研究分析別樣茶含有豐富的黃酮類、多酚類、萜類、揮發(fā)油、生物堿和有機(jī)酸類化合物，其中黃酮類、多酚類化合物在別樣茶中占比最大[14]，具有較強(qiáng)的降糖作用和抗氧化活性。

目前在國(guó)內(nèi)確認(rèn)屬于可食用的別樣茶有20余種，我們對(duì)其中具有降血糖、降血脂和抗氧化的別樣茶進(jìn)行了篩選，共整理出8種。本研究以此8種別樣茶（大麥茶、大葉苦丁茶、枸杞茶、甜茶、湖北海棠、連翹葉茶、青錢柳茶、小葉苦丁茶）為研究對(duì)象，通過(guò)還原日常茶飲過(guò)程的水提法對(duì)其有效成分進(jìn)行提取，并檢測(cè)其中總黃酮化合物含量。隨后通過(guò)構(gòu)建體外牛血清白蛋白-果糖反應(yīng)液孵育體系，模擬體內(nèi)蛋白質(zhì)非酶糖基化過(guò)程檢測(cè)8種別樣茶抑制晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）生成的能力，最終對(duì)篩選出抑制AGEs活性較好的大葉苦丁茶及甜茶進(jìn)一步檢測(cè)其對(duì)非酶糖基化反應(yīng)早期產(chǎn)物果糖胺、中期產(chǎn)物活性羰基化合物以及蛋白質(zhì)交聯(lián)的抑制能力。本文旨在探索別樣茶抑制非酶糖基化功效，并闡明其對(duì)糖基化過(guò)程的抑制機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

8種別樣茶（見(jiàn)表1） 分別采購(gòu)于相應(yīng)產(chǎn)區(qū)；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、十二水合磷酸氫二鈉、二水合磷酸二氫鈉 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；果糖、牛血清白蛋白 碧云天生物技術(shù)有限公司：硫酸氨基胍、疊氮化鈉 西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；果糖胺檢測(cè)試劑盒、活性羰基化合物檢測(cè)試劑盒 北京百瑞極生物科技有限公司。

表1 8種別樣茶功效成分Table 1 functional ingredients of 8 non-Camellia teas

TB-2002電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；XS205分析天平 梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司；XL-10B粉碎機(jī) 廣州市旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司；DW-86L388A超低溫保存箱 海爾集團(tuán)；VIRTIS冷凍干燥機(jī) 北京艾澤信科技公司；N-1200A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海愛(ài)朗儀器有限公司；ILMVAC GmbH真空抽濾機(jī) 上海易晟機(jī)電科技有限公司；M200PRO多功能酶標(biāo)儀，TECAN；KYC-100B恒溫箱 上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；QL861渦旋器 海門市其抹貝爾儀器制造公司；HWS24型水浴鍋 上海一恒科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 別樣茶活性成分提取 將8種別樣茶烘干粉碎，過(guò)50目篩備用。按料液比1:50（g/mL），稱取原料4.0 g，去離子水200 mL，80 ℃下回流提取2 h，過(guò)濾。利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將濾液真空濃縮10倍。將濃縮提取液倒入培養(yǎng)皿中，-80 ℃下冷凍24 h，取出，用凍干機(jī)將別樣茶有效物質(zhì)干燥，稱重，備用。

1.2.2 黃酮含量測(cè)定 采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，用75%乙醇將蘆丁對(duì)照品溶解，制備質(zhì)量濃度為1.0 g/L的蘆丁溶液；用乙醇稀釋得質(zhì)量濃度分別為0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的對(duì)照品溶液；分別取1 mL不同濃度的蘆丁對(duì)照品溶液于容量瓶（10 mL）中，依次加入4 mL去離子水和0.3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的NaNO2，搖勻；5 min后分別加入0.3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的Al（NO3）3，搖勻；待反應(yīng)6min后分別加入2 ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 mol/L的NaOH；加入去離子水補(bǔ)齊至刻度線，靜置10 min后測(cè)定510 nm處吸光值，以75%乙醇作為空白對(duì)照，得標(biāo)準(zhǔn)曲線y=7.1408x+0.0039，R2=0.9979（n=6）。分別稱取適量8種別樣茶凍干粉溶于去離子水中，配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL的溶液，分別取出1 mL于10 mL容量瓶中，依次加入4 mL去離子水和0.3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的NaNO2，搖勻；5 min后分別加入0.3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的Al（NO3）3，搖勻；待反應(yīng)6 min后分別加入2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 mol/L的NaOH；最后加入去離子水補(bǔ)齊至刻度線，靜置10 min后測(cè)定510 nm處吸光值，以75%乙醇作為空白對(duì)照。黃酮得率計(jì)算如以下公式：

式中，V：水提液總體積，200 mL；y：黃酮含量測(cè)定中510 nm處的吸光度；m：提取中加入樣品的質(zhì)量，4000 mg。

1.2.3 體外非酶糖基化抑制試驗(yàn) 參考Spagnuolo等[24]的方法，配制pH為7.3～7.4的PBS溶液，并向其中加入0.02%疊氮化鈉；以配制的PBS溶液為溶劑分別配制20 mg/mL牛血清白蛋白（BSA）溶液和0.5 mol/L果糖溶液，前者0.45 μm水系濾膜過(guò)濾；20 mg/mL BSA溶液與0.5 mol/L果糖溶液1:1混勻得BSA-果糖反應(yīng)液備用。

用配制好的PBS稀釋1.2.1中的別樣茶提取物至 5000、500、50、10 μg/mL四個(gè)濃度。將受試物與反應(yīng)液混合，作為樣品組（A組）；將PBS與反應(yīng)液混合，作為陰性對(duì)照組；以氨基胍為陽(yáng)性對(duì)照物，與反應(yīng)液混合作為陽(yáng)性對(duì)照；受試物與PBS混合，作為空白對(duì)照。按表2給出的配比配制不同試驗(yàn)組作為孵育體系，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱避光孵育5 d。

表2 反應(yīng)體系建立Table 2 Establishment of reaction system

第5 d，每個(gè)樣品設(shè)定3個(gè)平行，使用熒光酶標(biāo)儀，設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)370 nm和發(fā)射波長(zhǎng)440 nm檢測(cè)結(jié)果為3次測(cè)定的算數(shù)平均值，計(jì)算RSD（相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差）。3個(gè)平行測(cè)定的熒光值RSD應(yīng)≤3%，有時(shí)其中一個(gè)數(shù)值偏差大，導(dǎo)致RSD＞3%，應(yīng)適當(dāng)選取另兩個(gè)平行測(cè)定的算數(shù)平均值作為檢測(cè)結(jié)果。并根據(jù)公式2計(jì)算抑制率（IR）：

1.2.4 果糖胺含量測(cè)定 參考Liu等[25]的方法，非酶糖基化孵育體系的建立參照“1.2.3”中“表3”所示，孵育時(shí)間調(diào)整為3 d。將10 μL糖化牛血清白蛋白與硝基四氮唑藍(lán)NBT顯色液200 μL充分混勻作為樣品孔，10 μL牛血清白蛋白與2 mmlol/L N,N-二甲基甲酰胺（DMF）標(biāo)準(zhǔn)液混合作為標(biāo)準(zhǔn)孔，在37 ℃下孵育15 min，530 nm下測(cè)定OD值。

式中，1 mmol/L=1 mmol/L×分子量（249）×10-3=0.249 g/L

1.2.5 活性羰基化合物含量的檢測(cè) 參考Shin等[26]的方法，試驗(yàn)方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)，非酶糖基化孵育體系的建立參照1.2.4中方法，孵育時(shí)間調(diào)整為4 d。將0.125 mL樣本與0.750 mL雙蒸水進(jìn)行混合后加入0.125 mL 2,4-二硝基苯肼（DNPH）溶液，靜置5 mL，在370 nm測(cè)定吸光度值。

1.2.6 硫黃素-T分析蛋白質(zhì)交聯(lián)抑制率 參考吳夏青[27]的方法，配制硫黃素T（ThT）工作液，置于4 ℃避光儲(chǔ)存待用。將10 μL待測(cè)液（“1.2.4”中的孵育體系）與200 μL ThT工作液（稀釋10倍）混合，用酶標(biāo)儀振蕩均勻，在激發(fā)波長(zhǎng)440 nm，發(fā)射波長(zhǎng)482 nm下測(cè)定熒光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，采用Graph Prism 9和SPSS軟件整理分析數(shù)據(jù)，不同濃度的組間兩兩比較采用two-way ANOVA檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01為差異高度顯著，P＜0.001為差異極顯著，所得結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 總黃酮含量

對(duì)8種別樣茶總黃酮含量進(jìn)行測(cè)定，表3為8種別樣茶總黃酮含量及得率。結(jié)果表明：大葉苦丁茶的總黃酮含量最高，高達(dá)4.8835 mg/mL，明顯高于其他7種別樣茶，其余7種別樣茶的提取得率都低于5.2%，黃酮含量相對(duì)較低。大麥茶中未檢測(cè)出黃酮成分。

表3 8種別樣茶提取物中總黃酮含量及總黃酮得率Table 3 Flavonoid content and flavonoid extraction rate in 8 non-Camellia teas

2.2 別樣茶抑制非酶糖基化反應(yīng)能力及與總黃酮含量的相關(guān)性分析

非酶糖基化反應(yīng)又稱美拉德（Millard）反應(yīng)，是發(fā)生在還原糖的羰基和蛋白質(zhì)游離的氨基上的一系列復(fù)雜反應(yīng)，最終生成晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs），以AGEs抑制率作為指標(biāo)，研究8種別樣茶抑制非酶糖基化反應(yīng)能力，結(jié)果見(jiàn)表4。如表4所示，在最高濃度5000 μg/mL時(shí)，別樣茶提取物均表現(xiàn)出較強(qiáng)烈的抑制作用，大葉苦丁茶、枸杞茶、甜茶、連翹葉茶以及青錢柳茶的提取物均表現(xiàn)出高于90%的抑制率，除了小葉苦丁茶外均呈現(xiàn)濃度依賴性。濃度降低至50 μg/mL時(shí)，大葉苦丁茶、甜茶提取物仍然保持較高的抑制率，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于同等濃度下的其他別樣茶提取物以及陽(yáng)性對(duì)照氨基胍AG，大麥茶在該濃度下沒(méi)有抑制效果。即使是最低濃度10 μg/mL下，大葉苦丁茶糖基化抑制率19.26%±0.15%，甜茶抑制率15.11%±0.86%，這兩種別樣茶提取物仍有抑制效果，遠(yuǎn)高于同等濃度下的其余的別樣茶提取物。綜合考慮，大葉苦丁茶、甜茶的抑制AEGs產(chǎn)生的能力最強(qiáng)，因此選擇這兩種別樣茶進(jìn)行進(jìn)一步的研究，探索它們的抑制非酶糖基化反應(yīng)的機(jī)制。

表4 8種別樣茶對(duì)體外非酶糖基化抑制率的影響Table 4 Influence of 8 non-Camellia teas on the inhibition rate of non-enzymatic glycosylation in vitro

總黃酮得率較高的別樣茶中，大葉苦丁茶、湖北海棠茶提取物均表現(xiàn)出較好的抗糖基化活性，在50 μg/mL濃度下仍有較高的抑制率。而沒(méi)有總黃酮含量的大麥茶提取物在50 μg/mL時(shí)對(duì)糖基化反應(yīng)無(wú)抑制效果。根據(jù)結(jié)果推測(cè)黃酮類化合物含量高的別樣茶相較于含量低的別樣茶抑制糖基化效果更好。隨后采用GraphPad Prism 9.0進(jìn)行糖基化抑制率與總黃酮含量的相關(guān)性分析，未能發(fā)現(xiàn)明顯強(qiáng)相關(guān)性（r=0.6493,P=0.115，95%置信區(qū)間：-0.2030～0.9418）。

2.3 別樣茶對(duì)果糖胺生成的抑制作用

果糖胺是非酶糖基化早期Amadori加合物的氧化產(chǎn)物，是非酶糖基化反應(yīng)的早期階段的標(biāo)志性產(chǎn)物[25]，通過(guò)測(cè)定對(duì)果糖胺的抑制率，考察2種篩選出的別樣茶提取物對(duì)非酶糖基化反應(yīng)早期的抑制能力。如圖1所示，在50、500和5000 μg/mL的濃度下，兩種別樣茶對(duì)果糖胺生成的抑制率均極顯著高于陽(yáng)性對(duì)照氨基胍的抑制作用（P＜0.01），大葉苦丁茶和甜茶抑制果糖胺能力較強(qiáng)，與5000、50 μg/mL相比，在500 μg/mL濃度時(shí)大葉苦丁茶和甜茶均表現(xiàn)出更強(qiáng)的抑制效果。甜茶相對(duì)大葉苦丁茶抑制能力更強(qiáng)，但兩者并未表現(xiàn)出顯著的差異性。

圖1 別樣茶對(duì)果糖胺的抑制率Fig.1 Inhibition rate of non-Camellia teas on fructosamine

2.4 別樣茶對(duì)活性羰基化合物的抑制率

非酶糖基化反應(yīng)的第二階段是羰基中間體的形成。羰基中間體是糖基化反應(yīng)的標(biāo)志物之一且具有高度的生理?yè)p害性，因此抑制活性羰基化合物的生成能抑制糖基化反應(yīng)的發(fā)生及進(jìn)程[28]。通過(guò)測(cè)定糖化反應(yīng)過(guò)程中期活性羰基化合物的水平，考察2種別樣茶提取物對(duì)非酶糖基化反應(yīng)中期的抑制能力，結(jié)果見(jiàn)圖2。在50、500和5000 μg/mL的濃度下，兩種別樣茶對(duì)蛋白質(zhì)活性羰基化合物的抑制作用依然顯著地高于陽(yáng)性對(duì)照氨基胍的抑制作用，呈現(xiàn)出極其顯著性差異（P＜0.001），大葉苦丁茶結(jié)果呈濃度依賴性。在高濃度（5000 μg/mL）時(shí)大葉苦丁茶的抑制能力要極顯著高于甜茶（P＜0.001），而在低濃度（50 μg/mL）時(shí)甜茶的抑制能力要強(qiáng)于大葉苦丁茶（P＜0.01）。

圖2 別樣茶對(duì)活性羰基化合物的抑制率Fig.2 Inhibition rate of non-Camellia teas on protein carbonylation

2.5 別樣茶提取物對(duì)蛋白質(zhì)交聯(lián)結(jié)構(gòu)的抑制作用

牛血清蛋白被糖基化后分子內(nèi)活分子間含有大量淀粉樣β-交聯(lián)結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)與AGEs進(jìn)行交聯(lián)后會(huì)失去生物學(xué)特性，根據(jù)Tht結(jié)合交聯(lián)結(jié)構(gòu)后的熒光強(qiáng)度大小判定β-交聯(lián)結(jié)構(gòu)水平。如圖3所示，5000 μg/mL時(shí)，氨基胍的抑制能力極顯著強(qiáng)于兩種別樣茶提取物（P＜0.001），在50 μg/mL的濃度下兩種別樣茶表現(xiàn)出較好的AGEs與蛋白質(zhì)交聯(lián)抑制能力，極顯著性強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照氨基胍（P＜0.001），且甜茶的抑制能力要極其顯著強(qiáng)于大葉苦丁茶（P＜0.001）。

圖3 別樣茶提取物濃度對(duì)蛋白質(zhì)交聯(lián)抑制率的影響Fig.3 Effect of the concentration of non-Camellia tea extracts on the inhibition rate of protein cross-linking

3 結(jié)論

為獲得抑制非酶糖基化能力強(qiáng)的別樣茶，本研究通過(guò)模擬日常飲用狀態(tài)對(duì)8種別樣茶進(jìn)行提取，并對(duì)其抑制AGEs生成的作用進(jìn)行檢測(cè)。篩選得到抑制效果較強(qiáng)的大葉苦丁茶和甜茶，實(shí)驗(yàn)表明這兩種別樣茶在最低濃度（10 μg/mL）下仍然發(fā)揮一定的抗糖基化能力。本研究同時(shí)檢測(cè)各別樣茶提取物的總黃酮含量，結(jié)果表明黃酮類化合物含量高的別樣茶相較于含量低的別樣茶抑制糖基化效果更好，但并未呈現(xiàn)出黃酮含量與其抗糖化之間的量效關(guān)系。

糖基化反應(yīng)分為三個(gè)階段，而果糖胺是早期階段的標(biāo)志性產(chǎn)物，活性羰基化合物是中期階段的標(biāo)志性產(chǎn)物。本研究篩選出大葉苦丁茶和甜茶并進(jìn)一步探究其抑制非酶糖基化的機(jī)制。結(jié)果表明，2種別樣茶的抑制作用都主要集中在抑制糖基化中期產(chǎn)物活性羰基化合物的產(chǎn)生，抑制率達(dá)到了90%以上。且甜茶對(duì)蛋白質(zhì)交聯(lián)抑制率最高，為81.41%。本研究首次報(bào)道大葉苦丁茶與甜茶具有強(qiáng)抑制AGEs生成的效果，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步的探究。

AGEs的積累與許多退行性過(guò)程或疾病的發(fā)展或加重有關(guān)，包括老化、動(dòng)脈粥樣硬化和糖尿病等。本研究為大葉苦丁茶和廣甜茶作為具有抑制非酶糖基化功效保健食品或抗糖基化功效化妝品原料提供科學(xué)理論依據(jù)。