趙林林 王艷亭 李小江 李翀 楊仕蕊 顧麗麗 王曉群 陳鴻祥 賈英杰

近年來，肺癌已成為全球死亡率最高的惡性腫瘤，其中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占所有肺癌病例的85% 左右[1]。根據(jù)美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（NCCN）指南，早期NSCLC 可以通過手術(shù)完全治愈，但由于缺乏有效的早期診斷篩查手段，大多數(shù)NSCLC 患者在確診時(shí)已處于Ⅲb 期甚至Ⅳ期，超過81%的患者在確診時(shí)無手術(shù)指征，近70%的患者術(shù)后需要化療或靶向治療[2]。然而，NSCLC 獲得性耐藥嚴(yán)重影響化療和靶向治療的療效以及患者的生存期。NSCLC 獲得性耐藥機(jī)制復(fù)雜[3]，目前研究多集中在三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體（ATP-binding cassette transporter，ABC）異常表達(dá)、DNA 損傷修復(fù)的改變和細(xì)胞凋亡的異常、細(xì)胞自噬及腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cells，CSCs）等方面，確切的機(jī)制仍不清楚。近年來研究表明，外泌體（exosome）作為細(xì)胞間信號(hào)傳遞的媒介，可以通過介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸、侵襲轉(zhuǎn)移及腫瘤耐藥等過程在肺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[4]，腫瘤來源或與腫瘤相關(guān)的外泌體是調(diào)控腫瘤耐藥的重要機(jī)制，可以通過傳遞核酸、蛋白質(zhì)等賦予敏感細(xì)胞耐藥性[5]。本文對(duì)近年來外泌體非編碼RNA（noncoding RNA，ncRNA）相關(guān)的NSCLC 獲得性耐藥的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 外泌體生物學(xué)特性

外泌體是具有雙層膜結(jié)構(gòu)的胞外膜性囊泡，直徑30～150 nm，在蔗糖中的密度為1.13～1.19 g/mL，電鏡下呈現(xiàn)杯托樣結(jié)構(gòu)[6]，是細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）的一種。1983年，Pan 等[7]在研究綿羊網(wǎng)織紅細(xì)胞成熟過程中首次發(fā)現(xiàn)了EVs 的存在。根據(jù)直徑和生成機(jī)制不同，EVs 被分為外泌體、凋亡小體、微囊泡和腫瘤小泡。外泌體主要通過胞吐釋放至細(xì)胞外，可以由多種類型的細(xì)胞主動(dòng)分泌，被發(fā)現(xiàn)存在于體液之中，如血液、尿液、胸腔積液、唾液、支氣管肺泡灌洗液和羊水等[8]。外泌體被釋放到細(xì)胞外環(huán)境后，經(jīng)由體液循環(huán)，通過直接靶向細(xì)胞受體信號(hào)、與受體細(xì)胞質(zhì)膜融合和內(nèi)化到受體細(xì)胞等方式，將其內(nèi)容物輸送到細(xì)胞質(zhì)中，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間的信息交流[9]。目前已知的外泌體相關(guān)信息傳遞途徑：1）外泌體和靶細(xì)胞表面受體之間直接相互作用；2）外泌體表面受體裂解，其受體片段與靶細(xì)胞上受體之間相互作用；3）外泌體膜與靶細(xì)胞質(zhì)膜融合，釋放外泌體進(jìn)入細(xì)胞胞漿；4）靶細(xì)胞通過吞噬作用使整個(gè)外泌體內(nèi)化[10]。外泌體介導(dǎo)信號(hào)傳遞給受體細(xì)胞或組織，是治療癌癥和其他疾病的一種很有前途的診斷生物標(biāo)志物和治療工具[8]。

來源不同的外泌體內(nèi)含物成分存在差異，但基本均含有蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及核酸等。到目前為止，在不同類型細(xì)胞的外顯體中，已識(shí)別出9 769 種蛋白質(zhì)、1 116種脂質(zhì)體、3 408 種信使RNA（messenger RNA，mRNA）、2 838 種microRNA（miRNA）[11]。外泌體富含蛋白質(zhì)，如四跨膜蛋白超家族（CD9、CD63、CD81、CD82），參與細(xì)胞滲透、侵襲和融合；熱休克蛋白（HSP70、HSP90）作為應(yīng)激反應(yīng)的一部分參與抗原結(jié)合和提呈；參與外泌體釋放的多泡體（multivesicular body，MVB）形成蛋白質(zhì)（Alix，TSG101）；以及負(fù)責(zé)膜轉(zhuǎn)運(yùn)和融合的蛋白質(zhì)（annexins 和Rab）等。其中TSG101、HSP70、CD81 和CD63 是常見的外泌體標(biāo)記蛋白[12]。此外，脂質(zhì)如神經(jīng)酰胺、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、二酰甘油酯、膽固醇、鞘磷脂和溶血磷脂酸也存在于外泌體膜上。外泌體還攜帶核酸（DNA、mRNA、miRNA 和其他ncRNA）信號(hào)。目前外泌體的主要提取方法包括超速離心法、密度梯度離心法、聚合物沉淀法、超濾法、體積排阻色譜、免疫親和法等。

2 外泌體與NSCLC 獲得性耐藥

耐藥是導(dǎo)致腫瘤治療失敗的主要原因，包括原發(fā)性耐藥和獲得性耐藥。獲得性耐藥是在藥物治療過程中腫瘤細(xì)胞發(fā)生基因突變或表觀遺傳改變而產(chǎn)生的耐藥表型。獲得性耐藥機(jī)制復(fù)雜，可歸因于細(xì)胞內(nèi)化療藥物濃度降低、癌基因或抑癌基因表達(dá)改變、DNA 損傷修復(fù)增強(qiáng)、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT）、自噬和腫瘤的高酸性微環(huán)境等[5]。近年來，越來越多的證據(jù)強(qiáng)調(diào)了外泌體在NSCLC 獲得性耐藥中的重要作用，外泌體參與腫瘤微環(huán)境中供體細(xì)胞和受體細(xì)胞之間的信息交換，親代細(xì)胞釋放的外泌體可與靶細(xì)胞相互作用，影響靶細(xì)胞表型特征[13]，耐藥腫瘤細(xì)胞脫落的外泌體通過藥物外排泵和ncRNA的轉(zhuǎn)移等機(jī)制將耐藥表型轉(zhuǎn)移到藥物敏細(xì)胞以傳遞耐藥性[14]。因此，外泌體可能具有一組特定的ncRNA（miRNA、lncRNA、circRNA 等），通過改變細(xì)胞生長將耐藥表型轉(zhuǎn)移到敏感癌細(xì)胞誘導(dǎo)抗凋亡程序，參與NSCLC 獲得性耐藥。

2.1 miRNA

與經(jīng)典的由直接黏連、特殊鏈接及可溶性生長因子所調(diào)控的細(xì)胞間信息傳遞不同，外泌體被認(rèn)為是一種新型細(xì)胞間信息傳導(dǎo)機(jī)制，參與miRNA 介導(dǎo)的靶細(xì)胞功能調(diào)節(jié)。miRNAs 是一類內(nèi)源性長度為20~24 個(gè)核苷酸的單鏈ncRNA。主要通過與靶基因3’UTR的配對(duì)，參與調(diào)控許多重要生理活動(dòng)[15]。研究表明，miRNA 在腫瘤的增殖、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移、預(yù)后、多藥耐藥等方面起著關(guān)鍵作用。循環(huán)miRNA 可存在于外泌體中，在細(xì)胞間傳遞發(fā)揮其調(diào)節(jié)作用。在原發(fā)性腫瘤微環(huán)境中，癌細(xì)胞分泌的外泌體和miRNA 可以被其他細(xì)胞攝取，對(duì)受體細(xì)胞進(jìn)行基因組范圍的基因表達(dá)調(diào)控[16]。外泌體保護(hù)循環(huán)miRNA 免受降解，保證其穩(wěn)定性，并在血液中循環(huán)，與循環(huán)miRNA 相比，外泌體miRNA 更加穩(wěn)定、靈敏和特異。

miRNA 是研究最深入的外泌體ncRNA，通過與靶基因特異性結(jié)合來調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)水平而發(fā)揮作用。Qin 等[17]通過miRNA 芯片的方法證明了A549/DDP細(xì)胞和A549 細(xì)胞之間存在11 個(gè)上調(diào)的差異表達(dá)外泌體miRNAs 和31 個(gè)下調(diào)的差異表達(dá)外泌體miRNA，通過靶基因預(yù)測(cè)和通路分析，發(fā)現(xiàn)這些外泌體miRNA 大多數(shù)與耐藥有關(guān)[18]。Yuwen 等[19]在NSCLC 鉑類耐藥患者和鉑類敏感患者的循環(huán)外泌體miRNA 中，發(fā)現(xiàn)表達(dá)差異最大的6 個(gè)外泌體miRNA，包括miRNA-425-3p、miRNA-1273h、miRNA-4 755-5p、miRNA-9-5p、miRNA-146a-5p和miRNA-215-5p。Liang 等[20]通過miRNA 微陣列技術(shù)及生物信息學(xué)分析，篩選出A549 細(xì)胞外泌體中與吉西他濱耐藥相關(guān)的miRNA，包括let-7d-5p、let-7i-5p、miRNA-17-5p、miRNA-23b-3p。此外，肺癌組織及外泌體中miRNA-96 的表達(dá)明顯高于正常肺組織，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-96 可通過下調(diào)耐藥相關(guān)基因LMO7 改變肺癌細(xì)胞的化療敏感性[21]。Wei 等[22]還發(fā)現(xiàn)對(duì)吉西他濱耐藥的A549（A549-GR）細(xì)胞來源的外泌體通過小窩蛋白和脂筏依賴的內(nèi)吞作用被親本敏感細(xì)胞內(nèi)化，從而實(shí)現(xiàn)miRNA-222-3p 的轉(zhuǎn)運(yùn)，外泌體miRNA-222-3p 通過直接靶向SOCS3 的啟動(dòng)子促進(jìn)遷移、侵襲、抗凋亡和吉西他濱耐藥。外泌體還可以將miRNA-100-5p 轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，mTOR 是其潛在的靶基因，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性[18]。此外，外泌體miR-512 和miR-373 也顯示與順鉑敏感性增加和腫瘤進(jìn)展抑制相關(guān)[23]，而外泌體miRNA-204-5p、miRNA-139-5p、miRNA-29c-5p、miRNA-551b-3p、miRNA-29b-2-5p 和miRNA-204-3p 與肺癌的阿霉素耐藥相關(guān)[24]。除腫瘤細(xì)胞源性外泌體外，Wu 等[25]發(fā)現(xiàn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）來源的外泌體（BMSC-exo）miR-193a 通過下調(diào)LRRC1，抑制NSCLC 順鉑耐藥細(xì)胞的集落形成、侵襲、遷移和增殖，并促進(jìn)其凋亡。Zhang 等[26]發(fā)現(xiàn)癌相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs）來源的外泌體通過轉(zhuǎn)移miRNA-130a 而對(duì)NSCLC 細(xì)胞產(chǎn)生順鉑耐藥，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，pumilio 同源物2（PUM2）是將miRNA-130a 包裝成外泌體的關(guān)鍵因素。

PI3K/AKT 信號(hào)通路是調(diào)控外泌體miRNAs 誘導(dǎo)耐藥的重要途徑[27]。外泌體通過ncRNAs 靶向張力蛋白同源物（PTEN），通過負(fù)性調(diào)節(jié)PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路與腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和耐藥性的降低相關(guān)[28]。Dong 等[29]研究發(fā)現(xiàn)，缺氧NSCLC 細(xì)胞源性外泌體miRNA-21 通過下調(diào)磷酸酶和PTEN 促進(jìn)順鉑耐藥。另外，有研究證實(shí)癌細(xì)胞源性外泌體與腫瘤治療中自噬現(xiàn)象之間可能存在的串?dāng)_。在NSCLC化療獲得性耐藥中有少數(shù)研究探討了外泌體miRNAs 作為自噬介質(zhì)的作用，如來源于順鉑耐藥的NSCLC 細(xì)胞的外泌體miRNA-425-3p 通過靶向AKT1/mTOR 信號(hào)通路導(dǎo)致自噬活性的上調(diào)，從而降低對(duì)順鉑的反應(yīng)性[19]。在Ma 等[30]的一項(xiàng)研究中也觀察到了類似的結(jié)果，外泌體miR-425-3p 通過靶向AKT1 上調(diào)自噬水平，導(dǎo)致治療反應(yīng)的降低，值得注意的是，順鉑通過Wnt/β-catenin/c-Myc 途徑在轉(zhuǎn)錄水平誘導(dǎo)miR-425-3p 的表達(dá)。Yuwen 等[31]發(fā)現(xiàn)在復(fù)發(fā)率較高的晚期NSCLC 患者中，外泌體miRNA-146a-5p的水平明顯低于復(fù)發(fā)率較低的患者，且在順鉑誘導(dǎo)的耐藥過程中，癌細(xì)胞及外泌體中miRNA-146a-5p 的表達(dá)逐漸下降，miRNA-146a-5p 通過靶向自噬相關(guān)蛋白2（Atg2）抑制自噬逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥。

2.2 長鏈非編碼RNA

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNAs）是長度超過200 個(gè)核糖核苷酸的RNA 分子，在癌癥中差異表達(dá)[32]，lncRNAs 可能與DNA、RNA 或蛋白質(zhì)相互作用，調(diào)節(jié)基因表達(dá)和細(xì)胞信號(hào)通路。在NSCLC 中l(wèi)ncRNAs 可以通過調(diào)節(jié)EGFR、IGF-1R、Wnt 等信號(hào)通路和p53 等多種途徑、靶基因和miRNAs促進(jìn)耐藥性[33]。由外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)的lncRNA 通常作為miRNAs 的競爭性內(nèi)源性RNA（competitive endogenous RNA，ceRNA）或調(diào)節(jié)RNA 結(jié)合蛋白發(fā)揮其調(diào)節(jié)耐藥性的作用。近期，有研究證實(shí)了外泌體lncRNAPCAT-1 在NSCLC 中通過增加miR-182/miR217 的表達(dá)來調(diào)節(jié)Kras 相關(guān)的耐藥，進(jìn)一步研究表明，CAFs 中的外泌體PCAT-1 可觸發(fā)CD133/SOX2 相關(guān)的干細(xì)胞表型，PCAT-1 基因敲除可破壞CAF 介導(dǎo)的間質(zhì)活化并逆轉(zhuǎn)化療耐藥[34]。當(dāng)前對(duì)于外泌體lncRNAs 在NSCLC 獲得性耐藥的研究更多集中在EGFR-TKIs 等靶向藥物。Lei 等[35]研究表明RNA 結(jié)合蛋白hnRNPA2B1 與lncRNA H19 相互作用，并負(fù)責(zé)將H19 包裝到外泌體，轉(zhuǎn)運(yùn)至非耐藥細(xì)胞，從而誘導(dǎo)吉非替尼耐藥。Pan 等[36]研究發(fā)現(xiàn)，外泌體H19 通過miR-615-3p/ATG7 軸介導(dǎo)NSCLC 對(duì)厄洛替尼的耐藥。此外，在厄洛替尼耐藥的NSCLC 患者中，外泌體lncRNA RP11838N2.4 的血清表達(dá)水平上調(diào)，細(xì)胞外lncRNA RP11838N2.4 可整合到外泌體中并傳遞給敏感細(xì)胞，從而傳播厄洛替尼耐藥性[37]。Chen 等[38]通過體內(nèi)外試驗(yàn)探討NSCLC 外泌體lncRNA 尿路上皮癌相關(guān)基因1（UCA1）在吉非替尼耐藥中的作用，研究表明吉非替尼耐藥的NSCLC 細(xì)胞及其分泌的外泌體中UCA1 均增加，敲除UCA1 可促進(jìn)miRNA-143的表達(dá)，而miRNA-143 通過調(diào)節(jié)FOSL2 的表達(dá)而發(fā)揮逆轉(zhuǎn)吉非替尼耐藥的作用。對(duì)于三代EGFR-TKI奧希替尼，與敏感血漿、H1975 細(xì)胞和外泌體相比，奧希替尼耐藥血漿、耐藥H1975R 細(xì)胞及其外泌體中l(wèi)ncRNA-MSTRG.292666.16 的相對(duì)表達(dá)水平顯著上調(diào)，敲除lncRNAMSTRG.292666.16 可降低H1975R細(xì)胞對(duì)奧希替尼的耐藥性，且耐藥外泌體在敏感H1975 細(xì)胞中傳遞耐藥性，研究還證實(shí)對(duì)奧希替尼耐藥的外泌體可調(diào)控奧希替尼誘導(dǎo)的miRNA-21、miRNA-125b、TGF-β、ARF6 和c-Kit 等基因的表達(dá)[39]。

2.3 環(huán)狀RNA

環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNAs）是一類新的RNA，來源于mRNA 前體的反向剪接，相對(duì)穩(wěn)定和保守，研究表明，circRNAs 可以作為microRNA（miRNA）海綿、基因轉(zhuǎn)錄和選擇性剪接的調(diào)節(jié)因子，與RNA 結(jié)合蛋白（RNA binding proteins，RBPs）相互作用，甚至可以直接翻譯成蛋白質(zhì)[40]。最近的研究表明[41]，circRNAs 在癌癥中的作用主要依賴于ircRNAmiRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，其他機(jī)制包括與RBPs 相互作用，翻譯成肽或全長蛋白以及調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄[40]。循環(huán)circRNAs 主要存在于外泌體中并通過外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)，在人類血清外泌體中發(fā)現(xiàn)1 000 多個(gè)circRNAs，是線性RNA（linear RNA）的6 倍，表明circRNAs 較線性RNA 更容易在外泌體中富集[42]。在NSCLC 中，circRNAs 在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和耐藥中發(fā)揮著多種作用[43]。Shao 等[44]研究表明，外泌體circ_PIP5K1A通過miRNA-101/ABCC1 軸調(diào)控NSCLC 的進(jìn)展及對(duì)順鉑的敏感性，敲除外泌體circ_PIP5K1A 可抑制NSCLC 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡和順鉑敏感性，miRNA-101 是circ_PIP5K1A 的直接靶點(diǎn)，ABCC1 是miRNA-101 的下游靶點(diǎn)，circ_PIP5K1A 又通過海綿狀miRNA-101 正向調(diào)節(jié)ABCC1 的表達(dá)。

3 總結(jié)與展望

外泌體作為重要的細(xì)胞間信息交流的媒介，通過轉(zhuǎn)運(yùn)重要的核酸或蛋白質(zhì)等在NSCLC 獲得性耐藥過程中起到了重要作用。已有的臨床前研究證明了外泌體在逆轉(zhuǎn)NSCLC 獲得性耐藥中的巨大潛力，然而，腫瘤的耐藥性并非由一種或幾種機(jī)制引起的，是內(nèi)在（如突變）和外在（如藥物失活）因素共同作用的結(jié)果，并且外泌體的內(nèi)含物成分復(fù)雜，其功能也才剛剛開始被逐漸闡明，目前仍缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的外顯子分離技術(shù)、儲(chǔ)存方法和適當(dāng)?shù)馁|(zhì)量控制。因此，今后應(yīng)集中在外泌體的精確識(shí)別和分離以及實(shí)現(xiàn)大規(guī)模制備治療性外泌體的技術(shù)開發(fā)上，并進(jìn)一步明確外泌體生物效應(yīng)分子影響耐藥性獲得的關(guān)鍵靶分子與信號(hào)通路，為靶向治療及利用外泌體的新型治療提供重要的理論依據(jù)。