師俊亮　郝豫萍　夏源　戴恩云

［摘要］ 目的 探討血清中外泌體miR-223及核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（NLRP3）表達水平與阿爾茨海默?。ˋlzheimers disease，AD）發(fā)生及進展的關系。方法 選取2018年3月—2019年12月于我院老年醫(yī)學科就診的老年AD患者65例作為研究組，分為輕度認知功能障礙（MCI）亞組（41例）和癡呆（DAT）亞組（24例）；另外納入同時期神經功能正常的老年人60例作為對照組。采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應和酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測受檢者血清中外泌體miR-223及NLRP3表達水平。采用Pearson及Spearman檢驗分析受檢者血清中外泌體miR-223及NLRP3與簡易精神狀態(tài)檢查量表（MMSE）評分的關系。繪制受試者工作特征（ROC）曲線，計算血清中外泌體miR-223及NLRP3用于AD患者MCI診斷或者DAT鑒別診斷的曲線下面積（AUC）。結果 與對照組相比較，研究組受試者血清中外泌體miR-223的表達水平顯著降低，NLRP3表達水平顯著升高（t=6.623，Z=－9.451，P<0.05）；與MCI亞組相比，DAT亞組受試者血清中外泌體miR-223表達水平顯著降低，NLRP3表達水平顯著升高（t=3.190，Z=－5.288，P<0.05）。研究組受試者血清中外泌體miR-223表達水平與NLRP3表達水平呈負相關（r=－0.859，P<0.001），與MMSE評分呈正相關（r=0.790，P<0.001），研究組受試者血清中NLRP3表達水平與MMSE評分則呈負相關（r=－0.776，P<0.001）。血清中外泌體miR-223聯(lián)合NLRP3診斷AD患者MCI的AUC為0.91（95%CI=0.86～0.97），靈敏度為89.0%，特異度為76.5%；其鑒別診斷DAT的AUC為0.81（95%CI=0.75～0.88），靈敏度為70.0%，特異度為85.0%。結論 miR-223/NLRP3信號通路可能參與AD的發(fā)生和發(fā)展，血清中外泌體miR-223和NLRP3的檢測對AD患者MCI和DAT的診斷或鑒別診斷具有一定價值，值得進一步深入研究。

［關鍵詞］ 阿爾茨海默?。徽J知功能障礙；微RNAs；NLR家族，熱蛋白結構域包含蛋白3；外泌體；曲線下面積；診斷；老年人

［中圖分類號］ R749.16

［文獻標志碼］ A

EXPRESSION OF BLOOD EXOSOMAL miR-223 AND NUCLEOTIDE-BINDING OLIGOMERIZATION DOMAIN-LIKE RECEPTOR PROTEIN 3 IN PATIENTS WITH ALZHEIMERS DISEASE AND THEIR CLINICAL SIGNIFICANCE＼ SHI Junliang， HAO Yuping， XIA Yuan， DAI Enyun （Department of Geriatrics， Henan Workers Hospital， Zhengzhou 450003， China）

［ABSTRACT］ Objective To investigate the expression levels of serum exosomal miR-223 and nucleotide-binding oligome-rization domain-like receptor protein 3 （NLRP3） in patients with Alzheimers disease （AD） and their association with the development and progression of AD. Methods A total of 65 elderly patients with AD who attended Department of Geriatrics in our hospital from March 2018 to December 2019 were enrolled as study group and were divided into mild cognitive impairment （MCI） subgroup with 41 patients and dementia of Alzheimer type （DAT） subgroup with 24 patients， and 60 elderly individuals with normal neurological function were enrolled as control group. Quantitative real-time PCR and ELISA were used to measure the expression levels of serum exosomal miR-223 and NLRP3. The Pearson and Spearman tests were used to analyze the correlation of serum exosomal miR-223 and NLRP3 with Mini-Mental State Examination （MMSE） score. The receiver operating characteristic （ROC） curve was plotted to calculate the area under the ROC curve （AUC） of serum exosomal miR-223 and NLRP3 in the diagnosis of MCI in AD patients or the differential diagnosis of DAT. Results Compared with the control group， the study group had a significantly lower expression level of serum exosomal miR-223 and a significantly higher expression level of NLRP3 （t=6.623，Z=-9.451，P<0.05）， and compared with the MCI subgroup， the DAT subgroup had a significantly lower expression level of serum exosomal miR-223 and a significantly higher expression level of NLRP3 （t=3.190，Z=-5.288，P<0.05）. In the study group， the expression level of serum exosomal miR-223 was negatively correlated with that of NLRP3 （r=-0.859，P<0.001） and was positively correlated with MMSE score （r=0.790，P<0.001）， while the expression level of serum NLRP3 was negatively correlated with MMSE score （r=-0.776，P<0.001）. Serum exosomal miR-223 combined with NLRP3 had an AUC of 0.91 （95%CI=0.86-0.97）， a sensitivity of 89.0%， and a specificity of 76.5% in the diagnosis of MCI in AD patients， while it had an AUC of 0.81 （95%CI=0.75-0.88）， a sensitivity of 70.0%， and a specifi-city of 85.0% in the differential diagnosis of DAT. ConclusionThe miR-223/NLRP3 signaling pathway might be involved in the development and progression of AD， and measurement of serum exosomal miR-223 and NLRP3 has a certain value in the diagnosis of MCI or the differential diagnosis of DAT in AD patients， which requires further studies in the future.

［KEY WORDS］ Alzheimer disease; Cognitive dysfunction; MicroRNAs; NLR family， pyrin domain-containing 3 protein; Exosomes; Area under curve; Diagnosis; Aged

阿爾茨海默?。ˋlzheimers disease，AD）屬于一種不可逆的神經退行性疾病，以認知功能障礙和進行性癡呆為主要特征^[1]。美國國立老化研究所和阿爾茨海默病協(xié)會（NIA-AA）提出的最新AD研究框架指出，AD是包括輕度認知功能障礙（MCI）和癡呆（DAT）在內的連續(xù)病程，在AD核心臨床診斷標準的基礎上，應綜合考慮AD病理生理變化證據，并強調生物學標志物可以用于AD的早期診斷^[2]。NOD樣受體蛋白（NLRs）屬于細胞質模式識別受體，可以被部分病原微生物或者受損細胞釋放的非微生物危險信號激活，進而啟動炎癥小體依賴性天然免疫反應^[3]。目前動物實驗證實，降低AD小鼠大腦皮質區(qū)小膠質細胞核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（NLRP3）的表達，可以明顯改善AD小鼠的學習和記憶的能力^[4]，由此可以推測miR-223/NLRP3信號通路可能參與AD的發(fā)生機制。本研究以我院老年醫(yī)學科就診的65例老年AD患者作為研究的對象，旨在探討miR-223/NLRP3信號通路在AD的發(fā)生及發(fā)展中的作用，為血清中外泌體miR-223及NLRP3作為AD診斷和進展判斷的血清學指標提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2018年3月—2019年12月于我院老年醫(yī)學科就診的老年AD患者作為研究組。納入標準：①初診者；②癥狀、實驗室檢查、簡易精神狀態(tài)檢查量表（MMSE）評分^[2]、腦部CT及MRI等檢查結果符合NIA-AA提出的AD核心臨床診斷標準^[5]；③MMSE評分≤26分，日常生活能力保留者。排除標準：①合并其他疾病者，包括患有心肌梗死、惡性腫瘤、帕金森病、顱腦外傷、多發(fā)性硬化癥等可能引起miR-223表達異常者；②存在其他類型癡呆（如血管性癡呆、額顳葉癡呆）者。依據MMSE量表，按認知功能障礙進展程度將研究組受試者分為MCI亞組和DAT亞組。另外選擇60例神經功能正常的老年人作為對照組，納入標準：①同時期自愿接受血樣采集和MMSE問卷調查的同一社區(qū)人群；②年齡、性別、體質量指數（BMI）、基礎疾病、受教育程度等基本資料與研究組受試者匹配者；③一般認知功能及記憶正常，無癡呆臨床癥狀及其他精神系統(tǒng)疾病者。排除標準同研究組。

研究組受試者共65例，其中MCI亞組41例，DAT亞組24例。研究組與對照組受試者的年齡、性別、BMI、基礎疾病、受教育程度等基本資料比較無顯著差異（P＞0.05），兩組受試者具有可比性。研究組受試者的MMSE評分和日常生活能力量表（ADL）評分顯著低于對照組（t=13.981～18.371，P<0.001）。見表1。

1.2 研究方法

1.2.1 樣本采集 每位受試者禁食12 h后采集外周靜脈血，室溫下3 000 r/min離心10 min，后4 ℃下12 000 r/min離心5 min。將采集的血清樣本保存在－80 ℃冰箱備用。

1.2.2 血清中外泌體提取及鑒定 取出凍存?zhèn)溆脴颖?，于?5±3）℃室溫下放置20 min復溶，使用外泌體分離試劑盒（美國Invitrogen公司）按照說明書步驟分離血清中外泌體。用HT7700透射電子顯微鏡（日本日立公司）觀察外泌體形態(tài)及顆粒大小，用納米粒徑追蹤技術分析粒徑分布。采用蛋白質印跡法測定外泌體特征蛋白熱休克蛋白70（Hsp70）、溶酶體相關膜蛋白-3（CD63）以及內質網特征蛋白Calnexin的表達水平。

1.2.3 血清中外泌體miR-223表達水平測定 利用miRNA分離試劑盒提取上述外泌體中總RNA，選取microRNA First Strand cDNA合成試劑盒（大連寶生生物公司）在20 μL反應體系中進行逆轉錄反應，獲得cDNA。以cDNA為模板，U6 mRNA為內源對照，采用MicroRNAs Quantization PCR Kit（上海Sangon公司）和LightCycler 480實時PCR系統(tǒng)（德國Roche applied science公司）進行實時熒光定量聚合酶鏈式反應。反應進行條件為：95 ℃ 10 min，1個循環(huán)；95 ℃ 15 s，59.5 ℃ 30 s，36個循環(huán)。miR-223正向引物為5′-CCACGCTCCGTGT-ATTTGAC-3′，反向引物為5′-CCGCACTTGGGGTATTTGAC-3′，使用公式2^-ΔΔCT計算miR-223相對表達量，進行3次獨立重復試驗，結果選取3次試驗的平均值。

1.2.4 血清中NLRP3表達水平測定 取出凍存?zhèn)溆脴颖荆冢?5±3）℃室溫下放置20 min復溶，利用酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒（加拿大MyBioSource公司），按照試劑盒說明檢測血清中NLRP3水平。

1.3 統(tǒng)計方法

利用SPSS 17.0和Graphpad prism 6.0軟件進行數據分析。計量資料采用x?±s或M（P₂₅，P₇₅）表示，組間相關指標的比較采用t檢驗或非參數檢驗；分類變量以例（率）表示，組間比較采用卡方檢驗；相關分析采用Pearson檢驗或Spearman檢驗。繪制受試者工作特征（ROC）曲線，計算曲線下面積（AUC）、診斷靈敏度和特異度。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 血清中外泌體提取及鑒定結果

透射電子顯微鏡觀察顯示，分離出形狀、大小不一的囊泡，具有典型的胞外體形態(tài)和雙層膜結構（圖1A）；粒徑平均分布范圍為50.00～200.00 nm，平均粒徑為（158.52±18.71）nm，稀釋后調整粒子濃度為2.86×10⁹個/L（圖1B）。蛋白質印跡結果顯示，內質網特征蛋白Calnexin蛋白表達陰性，而外泌體特征蛋白Hsp70以及溶酶體相關膜蛋白CD63則呈特異性高表達（圖1C）。

2.2 兩組受試者血清中外泌體miR-223及NLRP3表達水平比較

研究組和對照組受試者血清中外泌體miR-223表達水平分別為0.67±0.34、1.00±0.19，NLRP3水平分別為12.31（7.82，19.44）、4.45（2.45，9.58），兩組間上述兩指標比較差異具有顯著意義（t=6.623，Z=－9.451，P<0.05）。在研究組中，DAT亞組和MCI亞組受試者血清中外泌體miR-223表達水平分別為0.52±0.26、0.76±0.31，NLRP3水平分別為20.78（14.45，28.52）、8.87（6.11，12.63），兩亞組當中上述兩指標相比較差異具有顯著意義（t=3.190，Z=－5.288，P<0.05）。

2.3 研究組受試者血清中外泌體miR-223、NLRP3表達水平及MMSE評分間的相關性

Pearson及Spearman檢驗示，研究組受試者血清中外泌體miR-223與NLRP3表達水平呈負相關（r=－0.859，P<0.001），與MMSE評分呈正相關（r=0.790，P<0.001）；血清中NLRP3表達水平與MMSE評分呈負相關（r=－0.776，P<0.001）。

2.4 血清中外泌體miR-223、NLRP3的測定對AD患者MCI的診斷價值

將對照組受試者作為對照，繪制ROC曲線。血清中外泌體miR-223以及NLRP3診斷AD患者MCI的AUC分別為0.85（95%CI=0.76～0.91）和0.84（95%CI=0.75～0.89），最佳截斷值為0.74和8.15。該最佳截斷值下，血清中外泌體miR-223和NLRP3診斷AD患者MCI的靈敏度分別為89.4%和81.7%，特異度分別為76.1%以及70.9%。另外，血清中外泌體miR-223聯(lián)合NLRP3診斷AD患者MCI的AUC為0.91（95%CI=0.86～0.97），靈敏度和特異度分別為89.0%和76.5%。見圖2。

2.5 血清中外泌體miR-223、NLRP3水平測定對DAT的鑒別診斷價值

將MCI亞組受試者作為對照，繪制ROC曲線。血清中外泌體miR-223和NLRP3鑒別診斷DAT的AUC分別為0.70（95%CI=50.64～0.78）和0.79（95%CI=0.71～0.85），最佳截斷值分別為0.61和15.42。該最佳截斷值下，血清中外泌體miR-223和NLRP3鑒別診斷DAT的靈敏度分別為85.0%和72.8%，特異度分別為76.1%和57.5%。血清中外泌體miR-223聯(lián)合NLRP3鑒別診斷DAT的AUC為0.81（95%CI=0.75～0.88），靈敏度和特異度分別為70.0%和85.0%。見圖3。

3 討論

AD屬于一種不可逆轉的認知功能進行性障礙綜合征，受人口老齡化影響，近年來我國AD發(fā)病率明顯上升^[6]。大量研究表明，異常miRNAs在多種人類疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。本研究結果顯示，與對照組相比較，研究組受試者的血清中外泌體miR-223表達水平普遍降低，同時伴有血清中NLRP3水平升高；且與MCI亞組相比，DAT亞組受試者也存在上述變化。上述結果說明miR-223/NLRP3信號通路可能參與了AD的發(fā)生以及進展過程。

miRNAs是神經系統(tǒng)當中大量存在的一種非編碼小分子RNA，是神經元細胞的重要功能調節(jié)因子^[7-8]。眾多研究在AD大腦組織和腦脊液中觀察到了異常miRNAs表達，這表明不同miRNAs參與調節(jié)神經退行性變相關基因表達，可能是AD的發(fā)病機制之一^[9]。miRNAs不僅調節(jié)細胞內生物學過程，也存在于外周血外泌體中，在內分泌模式下調節(jié)其他細胞中的靶mRNA^[10]。例如WEI等^[11]研究證實間充質干細胞衍生的外泌體miR-223通過磷酸酶張力蛋白同源物-磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B信號通路保護神經元免于凋亡，并為AD治療提供了一種潛在的靶點。在本研究中，研究組受試者血清中外泌體中miR-223表達水平較對照組下調，且DAT亞組受試者血清中外泌體miR-223表達水平低于MCI亞組，這可能是因為miR-223下調可能會干擾與神經元細胞周期相關的信號通路，從而導致與AD進展相關的神經元凋亡。另外，本研究的ROC曲線提示血清中外泌體miR-223用于AD患者MCI的早期診斷以及DAT的鑒別診斷，其靈敏度和特異度均較高。這些結果均證實了血清中外泌體miR-223作為AD診斷生物標志物的有效性。此外，血清樣本相較于腦脊液樣本較為簡單易得，隨著二代基因測序技術的發(fā)展，血清miRNAs檢測也愈發(fā)方便準確。

神經退行性疾病與遺傳易感性、蛋白質結構異常、線粒體功能障礙以及氧化應激失衡等密切相關，β-淀粉樣蛋白（Aβ）沉積并激活小膠質細胞驅動腦神經炎癥是AD主要的病理基礎^[12]。本研究結果顯示，研究組血清中NLRP3表達水平普遍升高，且DAT亞組血清中NLRP3水平高于MCI亞組，這說明NLRP3是參與AD發(fā)生和進展的重要分子，對AD的識別和治療具有一定指導意義。神經炎癥是AD進行性神經病變的重要基礎，腦組織中NLRP3在認知功能障礙早期即被激活，現(xiàn)有研究成果推測NLRP3炎癥小體可能在AD的發(fā)生發(fā)展中起作用，這可能與其在小膠質細胞中被Aβ激活會引發(fā)神經炎癥有關^[13-15]。Aβ聚集蛋白的積累以及小膠質細胞和星形膠質細胞的激活是AD的典型病理特征，后者可促進炎癥分子的釋放，上述過程都會損害神經元的結構和功能，導致偶發(fā)性記憶缺陷和認知功能障礙^[16]。NLRP3炎癥小體被認為是AD關鍵及常見的先天免疫應答物，NLRP3炎癥小體的激活是在小膠質細胞吞噬原纖維Aβ后開始的，該過程導致溶酶體損傷，組織蛋白酶B釋放、半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白水解酶1激活和一氧化氮的釋放，進而促進AD病理的發(fā)展^[17]。HENEKA等^[18]發(fā)現(xiàn)，小膠質細胞中NLRP3炎癥小體被Aβ激活是白細胞介素-1β成熟及隨后炎性事件的基礎，并且推測抑制NLRP3炎癥小體有望成為AD治療的新型手段之一。

既往研究表明，NLRP3為miR-223的重要靶點，但miR-223并不會立即觸發(fā)負反饋機制，而是通過調節(jié)炎癥因子，到達啟動機體炎癥反應所需的“炎癥水平”，從而導致NLRP3炎癥小體的激活^[19]。本研究中，研究組受試者的血清中外泌體miR-223與NLRP3表達水平呈負相關，這也進一步提示了miR-223/NLRP3信號通路在AD中的作用機制。此外，ROC曲線評估外泌體miR-233聯(lián)合NLRP3診斷AD源性MCI的AUC為0.91，靈敏度及特異度分別為89.0%和76.5%，二者聯(lián)合鑒別診斷AD患者DAT的AUC為0.81，靈敏度以及特異度分別為70.0%和85.0%，上述結果均表明miR-233聯(lián)合NLRP3對AD具有良好的診斷效能，且對評估該病進展具有一定意義。

綜上所述，miR-223/NLRP3信號通路可能參與AD的發(fā)生和發(fā)展，檢測血清中外泌體miR-223和NLRP3表達水平對于AD患者的早期MCI以及DAT進展具有一定的判斷價值，值得進一步深入研究。同時本文仍存在一定的局限性，如miR-223與NLRP3之間的靶向調控關系，以及兩者在AD發(fā)生發(fā)展中的作用機制，仍需要在細胞實驗、動物實驗乃至大樣本臨床研究中進一步驗證。

倫理批準和知情同意：本研究涉及的所有試驗均已通過河南省職工醫(yī)院倫理委員會的審核批準（文件號L2019015）。所有試驗過程均遵照《涉及人的生命科學和醫(yī)學研究倫理審查辦法》的條例進行。受試對象或其親屬已經簽署知情同意書。

作者聲明：師俊亮、郝豫萍參與了研究設計；夏源、師俊亮、戴恩云參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文，且均聲明不存在利益沖突。

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（本文編輯 范睿心 厲建強）