吳 闊， 陳永對， 王田田， 吳少政， 朱若萌， 張仲凱

(云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所/云南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室， 云南昆明 650205)

0 引言

【研究意義】番茄是云南高原農(nóng)業(yè)特色蔬菜，也是云南省主要外銷蔬菜之一。病毒病是番茄的主要病害，及時檢測明確病原，有利于病毒病的有效防控，為番茄產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供保障?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】番茄褐色皺紋果病毒(Tomato brown rugose fruit virus，ToBFRV)屬于Virgaviridae煙草花葉病毒屬(Tobamovirus)，基因組為單鏈正RNA，病毒粒子桿狀，長約300 nm, 直徑約18 nm，可經(jīng)無性繁殖、種子及接觸等方式傳播，引起葉片系統(tǒng)花葉、斑駁，果實褐色斑、有皺紋，是番茄和辣椒的毀滅性病害。該病毒在約旦番茄果實上首次報道[1]，后傳播至以色列、意大利、巴勒斯坦、墨西哥、荷蘭等亞洲、美洲、歐洲的國家和地區(qū)[2-5]，2019年在我國山東番茄上發(fā)現(xiàn)[6-8]，2021年在云南元謀番茄上發(fā)現(xiàn)[9]。番茄受該病毒感染后能夠引起植株系統(tǒng)發(fā)病，造成減產(chǎn)30%～70%?！狙芯壳腥朦c】從感病的番茄果實入手，探索番茄褐色皺紋果病毒快速檢測技術(shù)，通過形態(tài)學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、血清學(xué)和分子生物學(xué)手段檢測該病毒，以達(dá)到快速精準(zhǔn)的目的。【擬解決的關(guān)鍵問題】2021年6月在云南省紅河州蒙自市發(fā)現(xiàn)番茄果實表面褐色斑塊且果實表面皺縮不光滑的病樣，為明確引起云南紅河番茄褐色皺紋果病原，建立病毒檢測技術(shù)，為預(yù)防該病毒傳播和治療提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

感病番茄(SolanumlycopersicumL.)于2021年6月采自云南省紅河州蒙自市，共采集7個番茄果實樣品，其癥狀表現(xiàn)為果實表面褐色斑塊，果實表面皺縮不光滑，樣品編號記錄為21YV151～21YV157。

1.2 方法

1.2.1 病毒形態(tài)學(xué)和細(xì)胞病理學(xué)檢測 將番茄果實(21YV151)的褐色病斑部位用刀片切下，切碎，加1～2滴ddH2O混勻，用鍍有聚醋酸甲基乙烯酯(Formvar)膜的銅網(wǎng)吸附3 min，用吸水紙吸去余液，待膜略干，用2%鉬酸銨(pH 5.5)染色3 min，吸去余液，晾干后在FEITECNAIG2Spirit型透射電子顯微鏡下觀察病毒粒體形態(tài)。

將21YV151病果表皮切成1 mm×2 mm小片，經(jīng)3%戊二醛固定，用0.2 mol/L磷酸緩沖液漂洗，再用1%鋨酸固定2 h，用0.2 mol/L磷酸緩沖液漂洗后，乙醇按照30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%系列脫水，Epon812樹脂包埋，超薄切片，醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙染色，在FEITECNAIG2Spirit型透射電鏡下觀察切片。

將采集的7個番茄果實用粉碎機打碎，提取病毒粒子[10]，作負(fù)染色在FEITECNAIG2 Spirit型透射電鏡下觀察切片。

1.2.2 間接ELISA檢測 用浙江大學(xué)吳建祥課題組提供的煙草花葉病毒屬(Tobamovirus) 病毒抗體即黃瓜綠斑駁花葉病毒(Cucumber green mottle mosaic viurs，CGMMV)、齒蘭環(huán)斑病毒(Odontoglussum ring spot virus，ORSV)、番茄花葉病毒(Tomato mosaic virus，ToMV)以及購自Agdia的煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)和正番茄斑萎病毒屬(Orthotospovirus)的番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt orthotospovirus，TSWV)進(jìn)行ELISA檢測(酶聯(lián)免疫吸附劑測定)，抗體詳情見表1。檢測方法參見文獻(xiàn)[10]，即將番茄果實研磨在磷酸鹽緩沖液(PBS)中，然后將樣品上清液加入96孔酶標(biāo)板中，每孔加入100 μL樣品溶液(抗原)，37℃孵育3 h，用洗板機(Biotech)清洗酶標(biāo)板，用含有2%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液于4℃封閉過夜。第2天分別加入一抗和酶標(biāo)抗體，各孵育1.5 h，加底物于室溫顯色30 min，根據(jù)酶標(biāo)儀讀數(shù)的數(shù)值大小，判斷病毒含量。

表1 ELISA檢測用植物病毒抗體

1.2.3 病毒分子生物學(xué)方法鑒定 引物參照文獻(xiàn)[2]設(shè)計，反轉(zhuǎn)錄起始引物為ToBRFV特異性下游引物， PCR擴增引物為番茄褐色皺紋果病毒(ToBRFV)特異性引物ToBRFV -F (5′-AAT GTC CAT GTTTGTTACGCC-3′)和ToBRFV -R( 5′-CGAATGTGATTTAAAACTGTGAAT-3′)，擴增片段位置為小復(fù)制酶亞基區(qū)，該引物只能擴增ToBRFV，不能擴增煙草花葉病毒屬其他病毒，預(yù)期產(chǎn)物約560 bp。采用Progema總RNA提取試劑盒，參照說明書進(jìn)行。以提取的病葉總RNA為模板，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega)，以隨機引物為起始引物反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA；以第一鏈cDNA為模板，ToBRFV-F和ToBRFV-R為引物進(jìn)行PCR擴增，94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸40 s，共35個循環(huán)；最后72℃延長10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。用膠回收法純化目的PCR產(chǎn)物，與pGEM-T Easy (Progema)載體連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布在加入氨芐青霉素的麥康凱瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)16 h，用一步法RT-PCR試劑盒進(jìn)行菌落RT-PCR鑒定陽性克隆，送測序公司測定序列。用NCBI的BLASTn進(jìn)行同源性檢索。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒的形態(tài)學(xué)和細(xì)胞病理學(xué)特征

感病番茄果實表皮呈褐色斑塊等典型褐色皺紋果的癥狀(圖1A)。番茄果實經(jīng)負(fù)染后電鏡觀察，可觀察到桿狀的病毒粒體，長度約300 nm、直徑約18 nm，具有典型的煙草花葉病毒屬病毒的粒子特征(圖1B)。感病果實的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)顯示，桿狀病毒粒子散布于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)(圖1C)，葉綠體膜較完整，其中聚集大量病毒粒子，感病果實細(xì)胞為典型的Tobamovirus細(xì)胞病理特征(圖1D)。

注：A為典型褐色皺紋果的癥狀，B為負(fù)染后電鏡觀察病毒粒體，C為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)散布病毒粒子，D為葉綠體中聚集大量病毒粒子。

2.2 病毒與TMV和ToMV的血清學(xué)相關(guān)性

經(jīng)ELISA檢測發(fā)現(xiàn)，5個感病番茄果實樣品病毒與TMV的多克隆抗體呈陽性反應(yīng)，3個感病番茄果實樣品病毒與ToMV單克隆抗體呈陽性反應(yīng)，所有感病番茄果實樣品病毒均與CGMMV、ORSV、TSWV單克隆抗體無血清學(xué)反應(yīng)(表2)。說明，該病毒與Tobamovirus的TMV和ToMV具有血清學(xué)相關(guān)性。

表2 番茄果實的血清學(xué)反應(yīng)

2.3 PCR產(chǎn)物克隆及序列測定

從感病番茄果實分離物中提取總RNA，用番茄褐色皺紋果病毒特異性引物進(jìn)行RT-PCR擴增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，得到大小約560 bp的特異片段(圖2)，與引物設(shè)計預(yù)期結(jié)果一致。將回收的特異性片段進(jìn)行克隆、篩選，得到7個陽性克隆，經(jīng)序列測定，陽性克隆序列一致，插入片段全長為560 bp，用NCBI的BLASTn進(jìn)行同源性搜索，該序列與番茄褐色皺紋果病毒(ToBRFV)的南美洲分離物(GeneBank：MW314111.1)的同源性最高，為99.81%。因此判斷，在云南紅河州蒙自市發(fā)現(xiàn)的番茄果實褐色斑塊由番茄褐色皺紋果病毒侵染。

注：M為marker 2000，1為陰性對照，2為21YV151，3為21YV152，4為21YV153，5為21YV154，6為21YV155，7為21YV156，8為21YV157，9為陽性對照。

3 討論

番茄褐色皺紋果病毒(ToBRFV)是通過種子傳播的新型煙草花葉病毒屬病毒[11]，2014年在中東地區(qū)首先發(fā)現(xiàn)。近年在我國也有報道，2021年4月被農(nóng)業(yè)農(nóng)村部列入《中華人民共和國進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄》。2021年6月在云南省紅河州蒙自市發(fā)現(xiàn)番茄果實表面褐色斑塊且果實表面皺縮不光滑的病樣，從癥狀看，番茄病樣與國內(nèi)外報道ToBRFV侵染的番茄具有相似癥狀，疑似由ToBRFV引起。通過電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，病毒粒子呈約300 nm×18 nm的桿狀形態(tài)，具有煙草花葉病毒的病毒粒子特征；病毒粒子中間有核酸線，病毒粒子散布于細(xì)胞質(zhì)中，在葉綠體中有規(guī)律排列[12]，其病理學(xué)特征與TMV相似。

ELISA檢測發(fā)現(xiàn)，采集的7個感病番茄果實樣品中有5個樣品與煙草花葉病毒屬的TMV多克隆抗體呈陽性反應(yīng)，3個樣品與ToMV單克隆抗體呈陽性反應(yīng)，但與同病毒屬的ORSV、CGMMV的單克隆抗體無血清學(xué)反應(yīng)，推測引起云南紅河州番茄果實褐色皺紋癥狀的病毒可能為煙草花葉病毒屬病毒，基于RT-PCR特異性擴增的病毒部分基因序列分析，進(jìn)一步證實該病毒是ToBRFV。

紅河州是云南省冬早蔬菜番茄、辣椒的主要種植區(qū)，因此，對番茄等作物種子和種苗進(jìn)行種植前檢測，是預(yù)防該病毒入侵至關(guān)重要的環(huán)節(jié)，可從根本上遏制該病毒的傳播為害[13]。

4 結(jié)論

通過病害癥狀、病毒粒子形態(tài)和細(xì)胞病理學(xué)特征、ELISA檢測及部分基因序列測序?qū)υ颇霞t河州番茄褐色皺果病的病原檢測，電子顯微鏡觀察到病毒粒子為長300 nm、直徑18 nm的桿狀病毒，ELISA檢測發(fā)現(xiàn)與煙草花葉病毒屬的煙草花葉病毒(TMV)和番茄花葉病毒(ToMV)有血清學(xué)反應(yīng)；RT-PCR擴增獲得的目的片段與番茄褐色皺紋果病毒的病毒基因相似性達(dá)99.81%。因此判斷，引起云南紅河州番茄褐色皺紋果病的病毒是煙草花葉病毒屬的番茄褐色皺果病毒。ToBRFV與同屬病毒具有血清相關(guān)性，也具有抗原特異性。因此，ToBRFV的血清檢測技術(shù)需要制備特異的單克隆抗體，以避免檢測時因同屬病毒的血清相關(guān)性而出現(xiàn)診斷錯誤。