倫靜雯，盧宇靖，袁宇璽，黎秋茹，馮啟榮，趙海山

(廣東工業(yè)大學(xué)1.生物醫(yī)藥學(xué)院、2.輕工化工學(xué)院，廣東 廣州 510006；3.廣東省人民醫(yī)院廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，廣東 廣州 510080)

迄今，癌癥治療的技術(shù)手段得到快速發(fā)展，全球大部分地區(qū)癌癥死亡率呈下降趨勢[1]。但多種化療藥物在治療腫瘤的同時(shí)，也會造成正常細(xì)胞的損傷，引起多種化療的不良反應(yīng)，因此腫瘤治療的預(yù)后成為主要的關(guān)注點(diǎn)。目前，已報(bào)道的化療藥物引起的毒性有多種，其中腫瘤心臟病(onco-cardiology)，主要是指腫瘤診療過程中產(chǎn)生的心血管疾病[2]。腫瘤心臟病已成為影響腫瘤預(yù)后的因素，是癌癥幸存者的一個(gè)重要問題[3]，并且它導(dǎo)致的死亡風(fēng)險(xiǎn)已經(jīng)超過癌癥復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)[4-5]。因此，解決腫瘤心臟病的難題迫在眉睫。已知市面上有大量抗腫瘤藥物具有心臟毒性，包括蒽環(huán)類、烷基化劑類、鉑類、抗代謝類、抗微管劑類等[6-7]。右雷佐生(Dexrazoxane， Dex)作為FDA唯一批準(zhǔn)可用于降低蒽環(huán)類化合物心臟毒性的藥物[8]，它是一種鐵螯合劑，可去除鐵，防止自由基的形成，誘導(dǎo)拓?fù)洚悩?gòu)酶IIβ的快速降解[9]。但是，Dex對其他類型的腫瘤心臟病的研究并沒有明確的報(bào)道。

動物模型是藥物發(fā)現(xiàn)的基石，斑馬魚模型由于其與人類大部分基因組相同，同源性高達(dá)80%～90%，胚胎透明，可觀察早期發(fā)育進(jìn)程，具有非凡的繁殖速度，可進(jìn)行高密度生長，成本低，能進(jìn)行顯微注射操縱基因表達(dá)等特點(diǎn)，常用于疾病的研究，尤其是心血管和代謝類疾病的研究[10-11]。本文通過早期斑馬魚胚胎模型評價(jià)非蒽環(huán)類抗腫瘤藥物的急性毒性、整體動物形態(tài)、心臟功能，以確定5種非蒽環(huán)類抗腫瘤藥物的疾病模型，為尋找治療非蒽環(huán)類腫瘤心臟病的藥物提供快速、高效的方法[12-13]。并且通過建立的疾病模型進(jìn)一步探究Dex對非蒽環(huán)類抗腫瘤藥物引起的腫瘤心臟病的保護(hù)作用，為Dex的進(jìn)一步研究提供新的論據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器Axio Observer A1型研究型倒置顯微鏡(ZEISS)、DHP-9012型恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒)、Stemi 508型體式顯微鏡(ZEISS)、Axio Imager.2型研究型正置顯微鏡(ZEISS)、KG-SX-500型滅菌鍋(日本TOMY公司)、L500型醫(yī)用離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)、CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)、TriStar2S型多功能酶標(biāo)儀(BERTHOLD)

1.2 材料

1.2.1細(xì)胞株 H9C2傳代細(xì)胞(大鼠心肌細(xì)胞系)來自廣東工業(yè)大學(xué)生物醫(yī)藥研究院實(shí)驗(yàn)室凍存。

1.2.2試劑 Dex(D134376，97%，阿拉丁生化公司)，順鉑(cisplatin, DDP，A2111110001，98%)、紫杉醇(paclitaxel, Taxol，A2007230001，100%)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU，A2108230002，99%)、硫酸長春新堿(vincristine sulfate, VCR，A2007230002，98%)和環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide, CTX，A2108230001，97%)均夠自廣州優(yōu)南科技有限公司，氯化鈉(7647-14-5，99.5%，天津市大茂化學(xué)試劑廠)，碳酸氫鈉(144-55-8，99.5%，天津市大茂化學(xué)試劑廠)，氯化鉀(P112134，99.5%，阿拉丁生化公司)，氯化鈣(C110766，96.0%，阿拉丁生化公司)，甲基纖維素(S14012)購自源葉生物，DMSO(Q5733)購自MP Biomedlcals，LLC，高糖DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶和胎牛血清(FBS)均購自美國Gibco公司，CCK-8試劑盒(Cell Counting Kit，F(xiàn)C101-04)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2.3魚系 Tg[myl7：EGFP]和Wild-type AB strain品系的成年斑馬魚(包含雄雌)，魚齡為6～12個(gè)月，兩種魚系均購于國家斑馬魚資源中心。

1.3 方法

1.3.1制備溶液 配制Holt buffer，分別將0.100 g KCl、7.000 g NaCl、0.235 g CaCl2和0.400 g NaHCO3置于裝有1.900 L超純水的燒杯中，并定容為2.000 L，待完全溶解后于121 ℃滅菌30 min，最后使用真空過濾器(孔徑為0.22 μm)進(jìn)行過濾，室溫保存。Dex用DMSO溶解，配制為50 mmol·L-1的儲備液，于-20 ℃冰箱避光保存。DDP、Taxol、VCR、CTX、 5-FU使用含0.6%DMSO的Holt buffer溶解至相對應(yīng)的濃度，且以上5種溶液均采用現(xiàn)配現(xiàn)用的方式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2獲取早期斑馬魚胚胎 在實(shí)驗(yàn)前一天斑馬魚進(jìn)食1 h后，選取健康的Tg[myl7：EGFP]或者Wild-type AB strain品系的成年斑馬魚置于交配缸中，用隔板將雄、雌魚按1 ∶1分隔開。次日早上8 ∶00，讓雄、雌魚自由交配，并在1 h后收集胚胎。每個(gè)培養(yǎng)皿加入100顆發(fā)育正常的卵以及適量的Holt buffer，在溫度為28.5 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.3早期斑馬魚急性毒性實(shí)驗(yàn) 挑選健康的受精24 h(hours post-fertilization，hpf) Wild-type AB strain斑馬魚胚胎置于24孔板中，每孔加入20顆卵，設(shè)置4組重復(fù)。每種化療藥物分別設(shè)置6個(gè)或以上濃度進(jìn)行測試，以每孔1 mL相應(yīng)濃度藥液的體積量加入到孔板中，同時(shí)設(shè)置含體積分?jǐn)?shù)為0.6%DMSO的Holt buffer為空白組。以胚胎心臟停止跳動為判定死亡的標(biāo)準(zhǔn)，在48、72、96 hpf時(shí)，對胚胎的存活狀況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。最后計(jì)算每種藥物的胚胎96 hpf的LC50值。然后采用聯(lián)合給藥的方式，以化療藥物的LC50值為模型組濃度評價(jià)Dex的保護(hù)作用，聯(lián)合不同濃度梯度的Dex(20、40、60、80、100 μmol·L-1)處理72 h，統(tǒng)計(jì)斑馬魚胚胎存活率。

1.3.4評價(jià)早期斑馬魚胚胎組織器官毒性和心臟功能 選取健康的24 hpf Tg[myl7：EGFP]的轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎置于24孔板，每孔放入15顆，設(shè)置4組重復(fù)，并用Holt buffer稀釋DDP、Taxol、5-FU、VCR和CTX至相應(yīng)濃度(LC50值)，同時(shí)設(shè)置含0.6%DMSO的Holt buffer為空白組。待胚胎在72 hpf時(shí)，使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的甲基纖維素將斑馬魚側(cè)躺固定在載玻片上，置于研究型正置顯微鏡下進(jìn)行拍照。使用錄像系統(tǒng)記錄每分鐘心跳次數(shù)(heart rate， HR)。測量每條斑馬魚的1個(gè)心跳周期心臟的舒張和收縮末期的心室，計(jì)算收縮分?jǐn)?shù)(fractional shortening， FS)、心室容積(stroke volume， SV)和心臟輸出量(cardiac output， CO)。然后采用聯(lián)合給藥的方式，以Dex的最佳藥效濃度評價(jià)對化療藥物的心臟功能的保護(hù)作用。每組選取8條斑馬魚進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.3.5細(xì)胞急性毒性實(shí)驗(yàn) 采用高糖DMEM完全培養(yǎng)基將H9C2細(xì)胞以每孔6 000個(gè)的細(xì)胞密度接種于96孔板中，每孔加入100 μL培養(yǎng)基，設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，然后將孔板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。棄去培養(yǎng)基，以每孔100 μL藥液加入孔板中，同時(shí)設(shè)置空白組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，測量450 nm處的OD值，從而獲得藥物的毒性曲線。根據(jù)曲線，確定細(xì)胞活力值接近50%的藥物濃度為造模濃度，先給予Dex預(yù)處理24 h，然后棄去培養(yǎng)基，加入相應(yīng)濃度的藥液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，最后測定450 nm處的OD值，從而獲得給藥后的活力曲線。

2 結(jié)果

2.1 Dex在斑馬魚模型上的藥效安全性根據(jù)經(jīng)Dex處理24 h、48 h、72 h的斑馬魚胚胎存活率以及孵化率(Fig 1A、B)，結(jié)果表明Dex的給藥濃度為500 μmol·L-1以下時(shí)，胚胎的孵化率與空白組相比沒有明顯改變，說明此濃度范圍不影響斑馬魚胚胎的發(fā)育周期。結(jié)合斑馬魚96 hpf的胚胎整體形態(tài)(Fig 1C)，經(jīng)400 μmol·L-1Dex處理72 h的斑馬魚胚胎出現(xiàn)輕微圍心腔水腫，經(jīng)300 μmol·L-1以下濃度的Dex處理72 h并未出現(xiàn)明顯毒性。因此，確定Dex的安全濃度為300 μmol·L-1以下(包括300 μmol·L-1)。

2.2 非蒽環(huán)類抗腫瘤藥物對斑馬魚胚胎急性毒性的影響為了評價(jià)Dex對DDP、Taxol、5-FU、VCR和CTX的保護(hù)作用，需確定它們對斑馬魚胚胎急性毒性的影響。結(jié)果顯示，空白組的96 hpf斑馬魚胚胎存活率無明顯變化。胚胎經(jīng)不同梯度濃度的DDP、VCR、5-FU和CTX處理72 h后，各組胚胎存活率明顯降低，其96 hpf斑馬魚胚胎的LC50見Tab 1，而Taxol在最大水溶解度下，其存活率與空白組相比并沒有明顯改變(Fig 2A)。

在探究5種藥物對斑馬魚急性毒性的基礎(chǔ)上，研究Dex對斑馬魚胚胎存活率的影響，結(jié)果如Fig 2B所示：只有DDP聯(lián)合Dex處理后，胚胎的存活率明顯上升，當(dāng)Dex的濃度為40～100 μmol·L-1時(shí)差異有顯著性(P<0.01)，且Dex的濃度為80 μmol·L-1時(shí)達(dá)到最大藥效濃度，LC50值達(dá)639.448 μmol·L-1(590.582～725.419 μmol·L-1)。而VCR聯(lián)合Dex后，胚胎的存活率明顯降低，加劇胚胎毒性。因此，Dex能降低DDP的急性毒性，不影響5-FU和CTX的急性毒性，加劇VCR的急性毒性。

Fig 1 Effects of Dexrazoxane on survival rate， hatching rate and morphology of zebrafish

Tab 1 Acute toxicity LC50 value of 96 hpf zebrafish embryos

2.3 非蒽環(huán)類抗腫瘤藥物對斑馬魚胚胎組織器官毒性的影響為了進(jìn)一步評價(jià)Dex對DDP、5-FU、VCR和CTX的組織器官的保護(hù)作用，本研究對斑馬魚胚胎的主要組織器官進(jìn)行觀察。結(jié)果為，空白組斑馬魚胚胎發(fā)育正常，已脫殼孵化為幼魚，心血管系統(tǒng)無形態(tài)學(xué)改變，心房和心室部分重疊，且心臟環(huán)化正常。與空白組相比，經(jīng)438 μmol·L-1DDP處理48 h后，胚胎出現(xiàn)卵黃囊腫大、身體脊椎彎曲、小眼畸形、心臟輕微畸形、心室和心房容積減少，心房變??；經(jīng)65 mmol·L-1的5-FU處理48 h后胚胎出現(xiàn)心包膜明顯的水腫、卵黃囊出血且凹陷、小眼畸形、心房和心室腫大畸形；經(jīng)25 μmol·L-1VCR處理48 h后胚胎出現(xiàn)身體脊椎彎曲、尾部卷曲、卵黃囊輕微腫大、小眼畸形、心室變小；經(jīng)20 mmol·L-1CTX處理48 h后胚胎心包膜出現(xiàn)明顯的水腫、卵黃囊出血且輕微凹陷、小眼畸形、心房和心室輕微腫大畸形。見Fig 3。

聯(lián)合80 μmol·L-1Dex給藥處理后，明顯改善DDP引起的毒性，但并沒有明顯改善5-FU、VCR或CTX所產(chǎn)生的組織器官毒性，結(jié)果見Fig 3。

因此，斑馬魚胚胎經(jīng)過DDP、5-FU、VCR和CTX處理后，除心臟毒性外還表現(xiàn)出其他組織器官毒性。而Dex只對DDP引起的組織器官毒性具有保護(hù)作用，對5-FU、VCR和CTX并沒有影響。

2.4 非蒽環(huán)類抗腫瘤藥物對斑馬魚胚胎的心臟功能影響為了更進(jìn)一步評價(jià)4種非蒽環(huán)類抗腫瘤藥物對斑馬魚胚胎心臟功能的影響，選取HR、FS、SV和CO 4項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行評價(jià)，見Tab 2。與空白組相比，DDP與VCR均明顯降低斑馬魚胚胎的4項(xiàng)心功能指標(biāo)；5-FU與CTX除降低斑馬魚胚胎的HR外，其余3項(xiàng)指標(biāo)均上調(diào)，表現(xiàn)為擴(kuò)張型心臟病。而經(jīng)過Dex聯(lián)合處理后，可恢復(fù)DDP引起的斑馬魚4項(xiàng)心功能指標(biāo)的降低，明顯保護(hù)斑馬魚胚胎由于DDP引起的心臟毒性(P<0.01)，但不影響5-FU、VCR和CTX 4項(xiàng)心功能指標(biāo)的變化。

2.5 Dex和DDP對細(xì)胞活力的影響結(jié)合斑馬魚急性毒性、組織器官毒性以及心臟毒性3個(gè)維度評價(jià)Dex對非蒽環(huán)類抗腫瘤藥物引起的毒性保護(hù)作用，認(rèn)為只有Dex對DDP具有保護(hù)作用，因此我們進(jìn)一步采用哺乳動物細(xì)胞模型進(jìn)行驗(yàn)證，DDP對H9C2大鼠心肌細(xì)胞毒性影響見Fig 4。單獨(dú)給予不同DDP藥物濃度處理H9C2細(xì)胞24 h后，H9C2細(xì)胞的存活率隨濃度增大而降低(Fig 4A)。而采用Dex對H9C2細(xì)胞進(jìn)行24 h預(yù)處理，結(jié)果顯示：Dex明顯提高由DDP引起的細(xì)胞活力降低，且最佳濃度為1.25 μmol·L-1，說明Dex可以降低DDP引起的心肌細(xì)胞毒性。

Fig 2 Effects of five anti-tumor drugs and combined Dexrazoxane on survival rate of zebrafish

Tab 2 Heart function of 72 hpf zebrafish embryos

Fig 3 Effects of four anti-tumor drugs and combined Dexrazoxane on overall development of 72 hpf zebrafish

Fig 4 Effects of cisplatin and combined Dexrazoxane on survival rate of H9C2

3 討論

抗腫瘤藥物在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也對正常細(xì)胞造成損傷，引起不良反應(yīng)，影響患者的生活質(zhì)量，即使現(xiàn)在腫瘤治療明顯提高患者的壽命，但是目前的新藥還沒完全實(shí)現(xiàn)高活性與低不良反應(yīng)相結(jié)合，心臟毒性嚴(yán)重影響腫瘤治療的預(yù)后，仍然是我們現(xiàn)在所要關(guān)注的問題[14]?？鼓[瘤藥物中，以阿霉素為代表的蒽環(huán)類抗腫瘤藥物對于心臟毒性的不良反應(yīng)研究甚多，目前Dex是FDA唯一批準(zhǔn)用于降低蒽環(huán)類化合物心臟毒性的藥物[15]，但是其能否降低其他抗腫瘤藥物的不良反應(yīng)尚屬未知。

斑馬魚是常用于藥物篩選的整體動物模型，擁有82%的人類疾病相關(guān)基因的直系同源基因，表現(xiàn)出接近，有時(shí)候甚至超過嚙齒動物的生理和藥理學(xué)保守性[16]。本課題組前期已使用斑馬魚模型對多種抗腫瘤藥物的心血管毒性進(jìn)行了描述[13]及藥物篩選[17]。因此，本研究選擇斑馬魚作為模型對Dex的心臟保護(hù)作用進(jìn)行進(jìn)一步探索。

本研究選取了若干種具有代表性的，且被報(bào)導(dǎo)具有心血管毒性的抗腫瘤藥物進(jìn)行研究，包括烷基化類的CTX、鉑類的DDP、抗代謝類的5-FU、抗微管劑型的VCR以及Taxol。結(jié)果顯示：在斑馬魚急性毒性測試中，5種抗腫瘤藥物中只有4種藥物(DDP、5-FU、VCR和CTX)明顯降低斑馬魚的胚胎存活率。DDP、5-FU、VCR和CTX在斑馬魚胚胎中也表現(xiàn)出明顯的心臟毒性。此外，DDP、5-FU、VCR和CTX還引起其他組織器官毒性，分別為：DDP表現(xiàn)為肝臟及代謝毒性、發(fā)育延緩和神經(jīng)毒性；5-FU表現(xiàn)為肝臟及代謝毒性和神經(jīng)毒性；VCR表現(xiàn)為神經(jīng)毒性、肝臟及代謝毒性和發(fā)育延緩；CTX表現(xiàn)為肝臟及代謝毒性和神經(jīng)毒性。我們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Dex對DDP引起的斑馬魚胚胎死亡率增加，明顯的心臟毒性及發(fā)育毒性均有較好的保護(hù)作用，而對5-FU、VCR和CTX的各種毒性均未見明顯作用。

由此說明，Dex不僅可以保護(hù)蒽環(huán)類抗腫瘤藥物的心臟毒性，還可以保護(hù)DDP引起的心臟毒性，同時(shí)還能改善DDP引起的肝臟及代謝毒性、發(fā)育延緩和神經(jīng)毒性。但在本研究的條件下，Dex并不能保護(hù)5-FU、VCR和CTX引起心臟毒性以及其他毒性。因此我們認(rèn)為，Dex發(fā)揮作用的機(jī)制并非直接靶向心臟，而是通過影響抗腫瘤藥物產(chǎn)生毒性的毒理機(jī)制起作用。由于DDP產(chǎn)生多種毒副作用的根本原因是DDP與DNA相互作用，并與嘌呤DNA堿基形成共價(jià)加合物[18]，所以Dex對DDP發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制可能影響此通路，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)Dex可能降低由抗腫瘤藥物DDP引起的心臟及其他組織毒性，但并未發(fā)現(xiàn)對5-FU、VCR和CTX毒性的保護(hù)作用。本研究的發(fā)現(xiàn)說明，Dex可作為降低DDP化療不良反應(yīng)的潛在藥物進(jìn)行開發(fā)，并為Dex進(jìn)一步的藥理機(jī)制研究提供了線索和理論基礎(chǔ)。