牛肖飛,袁雪晶,馬鳳娟

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210023；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029)

小兒哮喘是一種慢性氣道炎癥，反復(fù)發(fā)作，纏綿難愈，受遺傳、環(huán)境等多種因素的影響[1]，近年來，兒童哮喘的患病率仍呈上升趨勢(shì)。西醫(yī)主要通過擴(kuò)張支氣管等達(dá)到止咳平喘的作用，但是難以達(dá)到有效且持久的效果。中醫(yī)認(rèn)為，小兒先天稟賦不足，哮喘多以肺脾氣虛患兒為主[2]，中醫(yī)治療小兒哮喘貫穿“治病求本”理念，通過增強(qiáng)患兒體質(zhì)，“扶正以祛邪”。近年來中醫(yī)藥治療哮喘的效果較佳，但相關(guān)作用機(jī)制并不明確。固本防哮飲具有補(bǔ)肺固表、健脾化痰的功效。前期臨床研究表明，固本防哮飲聯(lián)合穴位敷貼治療小兒哮喘的有效率明顯優(yōu)于西藥，且復(fù)發(fā)率普遍降低[3]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等學(xué)科的集合與發(fā)展，為新藥研發(fā)提供了重要思路[4]。因此，本研究擬通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接術(shù)探討固本防哮飲治療小兒哮喘的作用機(jī)制，以有效指導(dǎo)臨床通過中醫(yī)藥對(duì)小兒哮喘的辯證施治。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動(dòng)物 15只健康SPF級(jí)雄性SD大鼠，7～8周齡，體質(zhì)量(280～320) g，購于南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場，許可證號(hào): 202005A041，飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物管理中心。將大鼠隨機(jī)分為3組:空白血清組4只，固本防哮飲血清組6只、孟魯司特鈉血清組5只。本實(shí)驗(yàn)已通過南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理號(hào)為202005A041。

1.1.2細(xì)胞 人支氣管上皮細(xì)胞(BEAS-2B)、人喉癌上皮細(xì)胞(Hep-2)由南京中醫(yī)藥大學(xué)兒科研究所藥學(xué)組饋贈(zèng)，培養(yǎng)地點(diǎn)為南京中醫(yī)藥大學(xué)兒科研究所細(xì)胞培養(yǎng)房。將凍存BEAS-2B細(xì)胞復(fù)蘇后，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育，采用傳第2～3代的對(duì)數(shù)分裂期細(xì)胞。Hep-2細(xì)胞培養(yǎng)方法同上。

1.1.3RSV病毒 呼吸道合胞病毒A亞型(Long株)，由南京中醫(yī)藥大學(xué)兒科研究所饋贈(zèng)，保存于南京中醫(yī)藥大學(xué)兒科研究所。根據(jù)前期課題組研究[5]用Hep-2細(xì)胞復(fù)蘇擴(kuò)增RSV，擴(kuò)增效果最佳。因此，本實(shí)驗(yàn)用Hep-2細(xì)胞擴(kuò)增RSV后收集病毒，用于后續(xù)病毒毒力的測定及細(xì)胞的感染。

1.1.4藥物 孟魯司特鈉片：10 mg/片，杭州默沙東制藥有限公司，產(chǎn)品批號(hào)：R033495。固本防哮飲每劑由以下藥物組成：炙黃芪、黨參、炒白術(shù)、茯苓、煅牡蠣、蟬蛻、陳皮、防風(fēng)、辛夷、五味子、生甘草，按5 ∶3.33 ∶3.33 ∶3.33 ∶ 5 ∶2 ∶2 ∶1 ∶2 ∶2 ∶1的比例配制。實(shí)驗(yàn)用固本防哮飲藥物配制：第1煎先加8倍量涼水浸泡30 min，煎煮30 min后濾過；第2煎加6倍量水煎煮30 min,將2次煎液過濾、蒸餾、濃縮至相當(dāng)于生藥2 kg·L-1的濃縮液，密封保存于無菌50 mL離心管，-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.5試劑 人IL-4，IL-13,鼠抗SRC單克隆抗體(南京柏賽生物，批號(hào)：MFP06004-05、SRP3274、ET1609-65)，兔抗TP53多克隆抗體(深圳市文樂生物科技有限公司，批號(hào)：D220082-0100)，羊抗兔多克隆IgG-H&L二抗(美國Proteintech公司，批號(hào)：K1225)，人Tublin 內(nèi)參引物(批號(hào)：232212)，細(xì)胞核蛋白質(zhì)提取試劑盒(批號(hào)：C500009-0050)，RIPA(批號(hào)：RIPA-BL504A)，PMSF[生工生物工程(上海)股份有限公司，批號(hào)：PMSF-BL507A]，特級(jí)胎牛血清(深圳百泰克科技有限公司，批號(hào)：10099-141)，賽默飛RPMI 1640培養(yǎng)基(廣州市魯誠生物科技有限公司，批號(hào)：C11875)，CCK-8細(xì)胞增殖計(jì)數(shù)試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司，批號(hào)：A311-01)，Human IL-6 ELISA試劑盒(廣州泰勒生物科技有限公司，批號(hào)：PI330)，糖原PAS染色液-細(xì)胞專用(北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：G1360)等。

1.1.6儀器 AF103型制冰機(jī)(美國Scotsman公司)；5810R型高速冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；Power Pac Basic型垂直電泳儀，Trans-Blot Turbo全能型蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)，Chemi-Doc型化學(xué)發(fā)光成像儀(美國Bio-Rad公司)；TCSSP5型倒置顯微鏡(德國Leica公司)。

1.2 方法

1.2.1網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接

1.2.1.1固本防哮飲有效成分的篩選 通過TCMSP 2.3數(shù)據(jù)庫(http://tcmspw.com/tcmsp.php)及文獻(xiàn)檢索，整合固本防哮飲各個(gè)藥物有效活性成分。將類藥性(drug likeness，DL)≥0.18，口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%作為數(shù)據(jù)庫ADME的篩選條件。

1.2.1.2有效成分相關(guān)靶點(diǎn)的收集 在TCMSP 2.3數(shù)據(jù)庫篩選藥物活性成分的相關(guān)靶點(diǎn)信息，并通過UniProt數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org)進(jìn)行靶點(diǎn)蛋白與基因名稱的統(tǒng)一匹配。

1.2.1.3疾病相關(guān)靶點(diǎn)的篩選 以“children asthma”為關(guān)鍵詞，在GeneCard數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org)、OMIM數(shù)據(jù)庫(http://www.omim.org)、Drugbank數(shù)據(jù)庫(https://www.drugbank.ca)進(jìn)行檢索，收集相關(guān)靶點(diǎn)。篩選GeneCard數(shù)據(jù)庫中位數(shù)值，刪去重復(fù)值得到哮喘的潛在靶點(diǎn)信息。

1.2.1.4固本防哮飲“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 采用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建“中藥-成分-共同靶點(diǎn)”、“共同靶點(diǎn)互相作用”網(wǎng)絡(luò)圖，運(yùn)用NetworkAnalyzer工具進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)參數(shù)分析。其中Degree為重要參數(shù)，數(shù)值越大代表該節(jié)點(diǎn)越重要。

1.2.1.5蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用Venney 2.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)在線平臺(tái)對(duì)藥物與疾病靶點(diǎn)繪制韋恩圖，并提取交集基因。將交集基因上傳String 11.0數(shù)據(jù)庫，得到PPI網(wǎng)絡(luò)TSV文件，借助Cytoscape軟件進(jìn)行節(jié)點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析，得到蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。結(jié)合內(nèi)置插件“cytoHubba”分析，篩選出關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.2.1.6基因本體(gene ontology，GO)功能及京都基因與基因組百科全書(kyotoen cyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析 將固本防哮飲治療哮喘的潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入輸入DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)，設(shè)置標(biāo)識(shí)符為“OFFICIALGENESYMBOL”、物種選擇為“homo sapiens”，其余默認(rèn)選擇，進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析。

1.2.1.7分子對(duì)接 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫及PubChem數(shù)據(jù)庫得到小分子mol2格式文件，通過String數(shù)據(jù)平臺(tái)(https://cn.string-db.org/)，PDB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/)下載大分子靶蛋白的pdb格式文件。使用AutodockTool 4.0軟件分別對(duì)小分子和大分子進(jìn)行加氫、去水，借助PyMOL 2.5軟件進(jìn)行分子活性位點(diǎn)對(duì)接。

1.2.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.2.2最大藥物無毒濃度的測定及RSV擴(kuò)增最大藥物無毒濃度 將對(duì)數(shù)生長期的培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞數(shù)至1×108·L-1，加至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 μL，BEAS-2B細(xì)胞置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48 h，細(xì)胞長成單層后，吸棄各孔培養(yǎng)液，將固本防哮飲含藥血清按10倍梯度稀釋8個(gè)濃度(10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%),分別接種于96孔板，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，24 h后加入100 μL CCK-8溶液，同時(shí)設(shè)置空白組和對(duì)照組，避光孵育2 h，上機(jī)檢測每孔的吸光度并進(jìn)行記錄,通過計(jì)算每個(gè)稀釋梯度的細(xì)胞存活率，存活率大于90%的稀釋濃度代表藥物最大無毒濃度。

RSV擴(kuò)增 將Hep-2用如上方法接種于10 mL大皿中，將倍數(shù)生長期的細(xì)胞在10 mL無菌培養(yǎng)瓶中進(jìn)行傳代，待細(xì)胞貼壁60%時(shí)，分別加入20%、50%、80%稀釋倍數(shù)的RSV病毒液，每天觀察合胞生長情況，合胞脫落后，用細(xì)胞刮將細(xì)胞從壁上刮落，連同培養(yǎng)液一起轉(zhuǎn)移至50 mL離心管，4 ℃，2 000 r·min-1離心10 min，將上清液進(jìn)行分裝，-80 ℃ 進(jìn)行保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.3固本防哮飲對(duì)哮喘模型細(xì)胞的影響 以杯狀細(xì)胞作為模型細(xì)胞觀察哮喘炎癥指標(biāo)。參考文獻(xiàn)中白介素使用劑量，本實(shí)驗(yàn)用IL-4、IL-13各取50 mg·L-1，加/不加RSV[6]病毒液4 μL進(jìn)行造模。以下藥物組均為RSV+IL-4+IL-13造模。將細(xì)胞分為空白對(duì)照組(15%空白血清)、固本防哮飲組(10%，15%，20%固本防哮飲含藥血清)、孟魯司特鈉組(15%孟魯司特鈉含藥血清)，按照上述細(xì)胞培養(yǎng)方法，當(dāng)細(xì)胞生長到60%～70%時(shí)，分別換成含藥血清，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，各組細(xì)胞棄去培養(yǎng)基，PBS清洗3遍后，參照PAS染色試劑盒說明書進(jìn)行染色后，置于倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化。

1.2.2.4ABC-ELISA法測IL-6表達(dá)水平 ABC-ELISA稱為橋聯(lián)親和素-生物素法，是基于傳統(tǒng)ELISA法的升級(jí)。如上培養(yǎng)分組、造模、給藥的BEAS-2B(除去固本防哮飲高劑量組,只保留固本防哮飲低、中劑量組)，4 ℃、13 000 r·min-1離心30 min后取上清液，不加細(xì)胞裂解液，BCA法測定濃度并定量為等濃度。嚴(yán)格按ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.2.5Western blot法測SRC、TP53的表達(dá)水平 參照上述細(xì)胞分組培養(yǎng)方法，細(xì)胞裂解后提取的蛋白均置于4 ℃，14 000 r·min-1，離心15 min，BCA法測定蛋白濃度進(jìn)行定量。變性后取10 μL的蛋白在8%的預(yù)制膠進(jìn)行恒壓垂直電泳，用濕轉(zhuǎn)法將膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，加1×Tris-HCl緩沖鹽溶液(1×TBST)在搖床上清洗3次，每次10 min，用5%脫脂奶粉在搖床上封閉2 h，1×TBST再次清洗3遍后，4 ℃孵育SRC、TP53一抗過夜。TBST清洗后在搖床上室溫孵育二抗(1 ∶5 000) 1 h，孵育結(jié)束后再次TBST清洗3次，加ECL發(fā)光液于曝光機(jī)上掃描膠片，進(jìn)行顯影、定影，采用Image Lab軟件進(jìn)行結(jié)果分析。

2 結(jié)果

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理分析及分子對(duì)接結(jié)果

2.1.1固本防哮飲有效成分及靶點(diǎn)篩選結(jié)果 經(jīng)過TCMSP數(shù)據(jù)庫、UniProt、化源網(wǎng)、SwissTargetPrediction及文獻(xiàn)檢索，收集整合，數(shù)據(jù)整理(排除檢索有效成分靶點(diǎn)信息無果的成分)，共得到231個(gè)成分，其中五味子8個(gè)、黃芪21個(gè)、黨參21個(gè)、白術(shù)7個(gè)、茯苓13個(gè)、煅牡蠣16個(gè)、蟬蛻15個(gè)、陳皮5個(gè)、防風(fēng)18個(gè)、辛夷15、生甘草92個(gè)，1個(gè)成分為陳皮、防風(fēng)、甘草共有，1個(gè)成分為陳皮、甘草共有，1個(gè)成分為黨參、甘草共有，1個(gè)成分為黨參、防風(fēng)共有，1個(gè)成分為白術(shù)、黃芪共有，1個(gè)成分為茯苓、甘草共有，7個(gè)成分為黃芪、甘草共有。對(duì)篩選出的活性成分進(jìn)行手動(dòng)檢索相關(guān)靶點(diǎn)信息，剔除未查詢到相關(guān)靶點(diǎn)的成分，最終獲得23個(gè)活性成分。在UniProt數(shù)據(jù)庫、SwissTargetPrediction對(duì)以上活性成分進(jìn)行檢索或預(yù)測，刪除無效值與重復(fù)值，共得到692個(gè)靶基因。

2.1.2小兒哮喘疾病靶點(diǎn)預(yù)測結(jié)果 將“children asthma”作為關(guān)鍵詞在多個(gè)疾病數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，GeneCard數(shù)據(jù)庫獲得3 868個(gè)基因，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)設(shè)定Relevancescore大于中位數(shù)的靶點(diǎn)為潛在作用靶點(diǎn)，Drugbank數(shù)據(jù)庫113個(gè)、OMIM數(shù)據(jù)庫38個(gè)靶基因，將以上靶基因進(jìn)行整合、去重后，最終獲得1 052個(gè)有效靶基因。

2.1.3固本防哮飲“中藥-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將固本防哮飲的成分、作用靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，進(jìn)行“中藥-活性成分-靶點(diǎn)”關(guān)系圖構(gòu)建，見Fig 1。網(wǎng)絡(luò)中共912個(gè)節(jié)點(diǎn)，3 881條邊。

2.1.4固本防哮飲治療小兒哮喘的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將整理得到的疾病和藥物獨(dú)立靶點(diǎn)導(dǎo)入微生信作圖平臺(tái)，得到242個(gè)交集靶點(diǎn)，繪制韋恩圖，見Fig 1，將所得交集基因?qū)隨tring數(shù)據(jù)庫進(jìn)行PPI分析，通過調(diào)試，最終將互動(dòng)分?jǐn)?shù)設(shè)置為高可信度，結(jié)果輸出為TSV文件通過Cytoscape 3.7.2軟件進(jìn)行可視化處理，得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖。共得到231個(gè)節(jié)點(diǎn),1 948條關(guān)系路線，平均節(jié)點(diǎn)度值為16.866，平均局部聚類系數(shù)為0.422，節(jié)點(diǎn)圖形大小及顏色隨著Degree值增大而變大、加深，連接線段也相應(yīng)增粗。通過cytohubba插件，使用MCC算法篩選出排名前10的關(guān)鍵基因，見Fig 2，顏色越深代表基因的重要性越高。

Fig 1 Gubenfangxiaoyin- pediatric asthma target Wayne diagram

2.1.5KEGG、GO通路富集分析

2.1.5.1GO功能與通路富集分析 運(yùn)用Metascape數(shù)據(jù)平臺(tái)對(duì)242個(gè)共有靶點(diǎn)進(jìn)行富集分析，以P值作為篩選條件，GO富集分析分別選取分子功能(molecular function，MF)、生物過程(biological process，BP)、細(xì)胞組分(cell composition，CC)的前10條通路進(jìn)行展示，見Fig 3。根據(jù)富集分析結(jié)果，共有靶點(diǎn)GO的MF包括：G蛋白偶聯(lián)胺受體活性(G protein couple damine receptor activity)、蛋白激酶活性(protein kinase activity)、細(xì)胞因子受體結(jié)合(cytokine receptor binding)等功能。GO-BP包括：細(xì)胞對(duì)有機(jī)氮化合物的反應(yīng)(cellular response to organ onitrogen compound)、MAPK級(jí)聯(lián)調(diào)節(jié)(regulation of MAPK cascade)、對(duì)激素的反應(yīng)(response to hormone)、炎癥反應(yīng)(inflammatory response)等生物過程。GO-CC包括：膜筏(membraneraft)、膜側(cè)(side of membrane)、受體復(fù)合物(receptor complex)、囊泡腔(vesicle lumen)、突觸后(post synapse)等組分。

Fig 2 Key nodes of PPI network

Fig 3 GO analysis

2.1.5.2KEGG富集通路分析 以P值作為篩選條件，KEGG通路分析展示前20條通路，縱坐標(biāo)代表富集通路名稱，橫坐標(biāo)代表每條通路上的基因數(shù)占共有基因數(shù)的比例。由Fig 4可知，242個(gè)哮喘與固本防哮飲共有靶點(diǎn)主要富集在鈣信號(hào)通路(calcium signaling pathway)、cAMP信號(hào)通路(cAMP signaling pathway)、AGE-RAGE信號(hào)通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、5-羥色胺能(serotonergic synapse)等多種通路上。

Fig 4 KEGG enrichment analysis

2.1.5.3分子對(duì)接結(jié)果 通過分子對(duì)接術(shù)對(duì)篩選出的度值較高的成分及靶點(diǎn)進(jìn)行活性成分對(duì)接，根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果，篩選出5′-hydroxyiso-muronulatol-2′、5′-di-O-glucoside、槲皮素、異鼠李素、山奈酚、木犀草素等小分子配體，STAT3、SRC、AKT1、TP53、TNF、MAPK3、IL-6等大分子受體，進(jìn)行分子對(duì)接，其結(jié)合能見Fig 5。取結(jié)合能力最高的對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化處理，選取結(jié)合能分?jǐn)?shù)最低的HQ19(5′-hydroxyiso-muronulatol-2′,5′-di-O-glucoside)與SRC、TP53作圖分析，結(jié)合模式如Fig 6、7。

Fig 5 Analysis of docking-binding energy

Fig 6 Figure between SRC and HQ19

Fig 7 TP53 and HQ19

2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1PAS染色法 見Fig 8，與正常組相比，IL-4+IL-13組，RSV+IL4+IL-13組杯狀細(xì)胞數(shù)量增多，并且RSV+IL4+IL-13組杯狀細(xì)胞數(shù)量比IL-4+IL-13組杯狀細(xì)胞數(shù)量稍多。與RSV+IL4+IL-13組相比，固本防哮飲中、高劑量組、孟魯司特鈉組杯狀細(xì)胞數(shù)量減少，并且固本防哮飲中劑量組杯狀細(xì)胞數(shù)量最少，固本防哮飲高劑量組與孟魯司特鈉組杯狀細(xì)胞數(shù)量相比差別不明顯。證明固本防哮飲可以降低炎癥反應(yīng)。

2.2.2ELISA法檢測固本防哮飲對(duì)IL-6的影響 細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-6的表達(dá)水平結(jié)果見Tab 1，與正常組相比，IL-4+IL-13組、RSV+IL-4+IL-13組IL-6的表達(dá)水平升高(P<0.05)。與RSV+IL-4+IL-13組相比，固本防哮飲組、孟魯司特鈉組IL-6的表達(dá)降低(P<0.05)。

Tab 1 Comparison of IL-6 protein expression levels

Fig 8 PAS staining of goblet

2.2.3Western blot檢測固本防哮飲對(duì)SRC、TP53的影響 結(jié)果見Fig 9。與空白組相比，IL-4+IL-13組、RSV+IL4+IL-13組SRC表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與RSV+IL4+IL-13組相比，固本防哮飲組、孟魯司特鈉組SRC的表達(dá)均降低(P<0.05)。與空白組相比，IL-4+IL-13組、RSV+IL4+IL-13組TP53的表達(dá)均明顯升高(P<0.05)，與RSV+IL4+IL-13組相比，固本防哮飲組、孟魯司特鈉組、TP53的表達(dá)均降低(P<0.05)。

3 討論

小兒哮喘屬于中醫(yī)“哮病”范疇，哮喘論述首見于《黃帝內(nèi)經(jīng)》，散見于《玉機(jī)真藏論》、《藏氣法時(shí)論》、《咳論》等，奠定了后世防治哮喘的理論基礎(chǔ)。哮病常反復(fù)發(fā)作，責(zé)之于宿根不除，反復(fù)受外邪引觸之故。小兒哮喘以肺脾氣虛、痰濁內(nèi)阻為主，因此補(bǔ)肺健脾、祛濁化痰為治療小兒哮喘的重要方法[7]。固本防哮飲是江蘇省中醫(yī)院經(jīng)典方，具有補(bǔ)肺固表、健脾化痰的功效，對(duì)治療哮喘緩解期患兒有獨(dú)特功效。

根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果顯示，固本防哮飲防治小兒哮喘的主要成分可能是槲皮素、異鼠李素、山奈酚等。槲皮素能夠通過調(diào)節(jié)谷胱甘肽活性、清除活性氧，具有抗氧化、抗病毒、抗菌、抗炎和抗腫瘤等多種藥理作用[8]。異鼠李素可抑制支氣管上皮細(xì)胞炎癥模型釋放的大量促炎性因子、趨化因子，具有強(qiáng)抗氧化性，可抗炎、抗病毒、抗氧化和抗過敏，還可以調(diào)節(jié)免疫功能[9]。山奈酚具有抗炎、抗氧化以及抗癌活性，發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用[10]。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鲋械腄egree值以及MCC算法，篩選出較為重要的靶點(diǎn)，包括STAT3、SRC、AKT1、TP53、IL-6等。SRC在促進(jìn)氣道平滑肌細(xì)胞生長和促進(jìn)氣道重塑中的遷移方面發(fā)揮重要作用，可以介導(dǎo)表皮生長因子受體(EGFR)反式激活[11]，有研究表明，通過SRC(SU6656)或EGFR(AG1478)抑制劑減少EGFR磷酸化和下游信號(hào)傳導(dǎo)，從而抑制OVA誘導(dǎo)的支氣管肺泡灌洗液中炎癥細(xì)胞的募集，降低血管、支氣管周圍炎癥、纖維化、杯狀細(xì)胞化生和氣道高反應(yīng)性[12]。且患兒外周血中TNF、IL-6的分泌增加[13]，降低其分泌水平可能會(huì)減輕哮喘癥狀。

GO富集、KEGG通路分析及分析對(duì)接結(jié)果顯示，STAT3、SRC、AKT1、TP53、TNF、IL-6等靶點(diǎn)，可能是固本防哮飲干預(yù)小兒哮喘的關(guān)鍵靶點(diǎn)，它們參與調(diào)控了鈣信號(hào)通道、cAMP信號(hào)通路，AGE-RAGE信號(hào)通路、cGMP-PKG信號(hào)通路等多種通路。目前已被證實(shí)鈣通道、cAMP通路信號(hào)傳導(dǎo)失調(diào)與哮喘的發(fā)生密切相關(guān)。鈣庫控制的鈣內(nèi)流是介導(dǎo)細(xì)胞鈣信號(hào)的重要途徑之一，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上鈣缺乏時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的基質(zhì)相互作用分子1蛋白傳遞鈣缺乏信號(hào)，激活細(xì)胞膜上的鈣通道，介導(dǎo)鈣離子進(jìn)入胞質(zhì)，參與氣管收縮、氣道炎癥等許多生物反應(yīng)[14]。cAMP是參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的第二信使，參與調(diào)控人類多種病理生理過程,如炎癥、細(xì)胞生長與分化、凋亡及代謝等。通過實(shí)驗(yàn)對(duì)分子對(duì)接結(jié)合能力最強(qiáng)的蛋白進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)RSV感染支氣管上皮細(xì)胞哮喘模型，SRC、TP53、IL-6的分泌水平均增高，且RSV感染后，杯狀細(xì)胞數(shù)目顯著增加，提示固本防哮飲可能通過以上信號(hào)通路來調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)等病理反應(yīng)，發(fā)揮防治哮喘作用，但是具體治療哮喘的機(jī)制，尚需更多深入研究。

Fig 9 SRC, TP53 protein expression levels in

綜上所述，本文借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接初步分析發(fā)現(xiàn)，固本防哮飲可能通過槲皮素、異鼠李素、山奈酚等活性成分，作用于STAT3、SRC、AKT1、TP53、TNF、MAPK3、IL-6、JUN等靶點(diǎn)，調(diào)節(jié)鈣、cAMP、cGMP-PKG等信號(hào)通路，發(fā)揮降低炎癥反應(yīng)，改善肺功能及微循環(huán)等作用，從而達(dá)到防治小兒哮喘的目的。本研究存在局限性，不論是中藥有效成分，還是疾病靶點(diǎn)信息，在不同數(shù)據(jù)庫之間存在差異，最終獲取的信息可能會(huì)導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)差異性。但本文在一定程度上驗(yàn)證了固本防哮飲作為臨床治療小兒哮喘常用藥的可用性，也為今后相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究、藥物開發(fā)提供了理論依據(jù)。