馬春玉，于子喬，王新娜，牛 萍，劉立明，劉 璐，于俊超，趙德喜

(1. 長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長春 130117；2. 長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 長春 130021)

腦卒中是世界范圍的公共衛(wèi)生問題，據(jù)世界衛(wèi)生組織報道，腦卒中位列全球死亡原因的第2位，卒中致死人數(shù)占總死亡人數(shù)的11.9%[1]。作為人口大國，我國的形勢更為嚴(yán)峻，腦卒中居人群死亡原因首位，占年總死亡人數(shù)的1/5(約160萬人/年)，其中缺血性腦卒中占腦卒中發(fā)病人數(shù)的70%～80%[2-3]。中醫(yī)在《內(nèi)經(jīng)》時代就對本病有了實(shí)際的觀察和理論層面的闡述，后世醫(yī)書中也不乏對這一疾病的記載，可見本病是伴隨著人類歷史發(fā)展進(jìn)程的，醫(yī)學(xué)家們對本病的診治也一直探索著。代謝組學(xué)(metabolomics)是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后發(fā)展起來的一門新興科學(xué)，它通過定性和定量分析生物樣本中小分子代謝物組學(xué)的方法來觀察生物體受到刺激后內(nèi)源性代謝物變化和代謝通路及途徑，以尋找代謝物與生理病理變化之間的相對關(guān)系，并利用液質(zhì)聯(lián)用/氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，反映其在某一時刻樣本內(nèi)所有代謝物及代謝動態(tài)規(guī)律[4-6]。代謝組學(xué)放大了基因和蛋白表達(dá)的微小變化，反映了機(jī)體系統(tǒng)的生理和病理狀態(tài)，近年來在中醫(yī)藥防治疾病方面取得了很大的進(jìn)展。現(xiàn)將近10年基于代謝組學(xué)的中醫(yī)藥防治腦卒中的研究作如下綜述。

1 中醫(yī)學(xué)對腦卒中的認(rèn)識及治療優(yōu)勢

腦卒中與中醫(yī)學(xué)中的“中風(fēng)”一名相對應(yīng)。《內(nèi)經(jīng)》中有與本病表現(xiàn)相關(guān)的癥狀記載，如意識不清者稱為“薄厥”，偏側(cè)肢體活動不利者稱為“偏枯”“偏風(fēng)”，“瘖”則表示言語謇澀者。漢代張仲景所著的《金匱要略》中首見“中風(fēng)”之名。由于各代醫(yī)家所處歷史階段不同，臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)各異，他們對于中風(fēng)病致病因素、病理性質(zhì)、病因、病機(jī)關(guān)鍵的闡述不盡相同。在唐宋以前，以張仲景提出的“內(nèi)虛邪中”論為例，本病主要以“外風(fēng)”立論。到宋末元初逐漸發(fā)展為以“內(nèi)風(fēng)”學(xué)說為主，并出現(xiàn)了以朱丹溪的“濕痰生熱”論等為代表的病因病機(jī)學(xué)說。陳言對于中風(fēng)病進(jìn)行了較為細(xì)致的臨床癥狀觀察，并總結(jié)了本病的發(fā)病特點(diǎn)——喉中痰鳴、病發(fā)前眩暈、病情進(jìn)展速度快等，使得后世醫(yī)家更加意識到了預(yù)防本病的重要性。張子和在《儒門事親·風(fēng)論》中述：“風(fēng)，有善行而數(shù)變，風(fēng)之為致病皆生倉卒之變，致人言語謇澀、行動不利”。至明清及近代，則以“內(nèi)傷積損”“肝陽化風(fēng)”“氣虛血瘀”“肝陽化風(fēng)，氣血并迸，直沖犯腦”等病機(jī)學(xué)說為代表。

呂健等[7]對臨床常見的中藥注射劑的研究頗為深入，課題組對燈盞細(xì)辛注射液治療缺血性腦卒中進(jìn)行了系統(tǒng)評價，結(jié)果顯示：西藥+燈盞細(xì)辛注射液的有效性、安全性均優(yōu)于單純西藥治療(P<0.000 01)。楊云芳等[8]采用隨機(jī)的方法將986例符合納入標(biāo)準(zhǔn)的缺血性卒中急性期患者進(jìn)行分組，每組493例，治療組在觀察組西醫(yī)治療的基礎(chǔ)上，給予中醫(yī)非藥物治療(穴位敷貼、中藥熏洗等)，結(jié)果顯示：治療組加用中醫(yī)非藥物治療的總有效率高于觀察組的西醫(yī)治療，體現(xiàn)出中醫(yī)非藥物療法在腦卒中急性期患者治療中的價值。以上結(jié)果均表明，中醫(yī)藥對在腦卒中的治療中具有優(yōu)勢。

2 代謝組學(xué)對腦卒中的認(rèn)識

代謝組(metabolome)是基因組的下游產(chǎn)物，也是最終產(chǎn)物，是一些參與生物體新陳代謝、維持生物體正常生長和發(fā)育功能的小分子化合物的集合。代謝組學(xué)是通過考察細(xì)胞、組織等生物體系受刺激或擾動后，其代謝產(chǎn)物的變化或其隨時間的變化，來研究生物體系的一門科學(xué)。一般包括非靶向代謝組學(xué)、靶向代謝組學(xué)和脂質(zhì)代謝組學(xué)。

2.1預(yù)防與診斷 在已確定的腦卒中危險因素中，血脂異常和糖尿病等疾病均以代謝變化為特征；代謝產(chǎn)物體積較小，更容易穿過血腦屏障；代謝產(chǎn)物相比于蛋白質(zhì)，能更早地反映疾病的發(fā)生。因此，在評估腦卒中風(fēng)險時，直接定量代謝物水平可能是一種優(yōu)于傳統(tǒng)基于危險因素分類的方法[9]。應(yīng)用代謝組學(xué)的方法研究腦卒中的代謝產(chǎn)物水平及靶點(diǎn)可以為預(yù)防與診斷本病提供參考。Adnan等[10]進(jìn)行了一項(xiàng)前瞻性隊(duì)列研究，通過對比健康對照組和腦卒中風(fēng)險組之間的不同代謝產(chǎn)物，以分析發(fā)生腦卒中之前血液的病理生理學(xué)變化。研究使用非靶向代謝組學(xué)得到了能夠區(qū)分兩組的氨基酸。此外，靶向代謝組學(xué)方法證實(shí)，定量的L-色氨酸、3-甲氧基酪胺、甲硫氨酸、高半胱氨酸、半胱氨酸、異亮氨酸、肉堿、精氨酸、亞油酸和鞘氨醇這些產(chǎn)物在后來被診斷出腦卒中的患者血清中異常升高。這些化合物可以作為早期診斷腦卒中的新型生物標(biāo)志物。

Sun等[11]采用非靶向血清代謝組學(xué)的方法進(jìn)行了一項(xiàng)尋找腦卒中生物標(biāo)志物的前瞻性研究，對114例腦卒中患者和112例健康對照樣本的研究結(jié)果表明，與細(xì)胞內(nèi)十六烷二酸合成相關(guān)的通路參與了腦卒中的發(fā)生。Hu等[12]對招募的129名腦梗死和73名腦出血患者，以及98名健康對照者進(jìn)行了血液樣品的代謝組學(xué)分析。與健康對照組相比，腦梗死和腦出血患者分別顯示出明顯的代謝物變化，如在腦梗死組的Tyr、C5-OH/C0、Cit、Asn、Pro、Val、Arg/Orn、Leu和Val/Phe水平明顯升高。Yun等[13]應(yīng)用代謝組學(xué)研究大鼠局灶性腦缺血/再灌注(I/R)損傷早期的生化變化。研究結(jié)果表明，缺血大鼠腦脊液中的潛在生物標(biāo)志物有乙酸、3-羥基異戊酸、3-羥基丁酸、膽堿、L-丙氨酸、肌酸、肌酐、甘氨酸、丙酮酸、甘油、谷氨酸、d-果糖、L-乳酸和丙酮。這些發(fā)現(xiàn)有助于我們了解局灶性腦缺血/再灌注損傷早期大鼠腦脊液中的生化代謝物變化。張春兵等[14]為探討腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織和血清中的差異表達(dá)代謝物采用Zea Longa改良栓線法構(gòu)建大鼠腦中動脈栓塞(MCAO)模型，收集腦組織和血清，采用氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)方法檢測代謝物表達(dá)譜。研究共鑒定出105個血清代謝物以及95個腦組織代謝物，與假手術(shù)組相比，MCAO組大鼠血清中尿素、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甘露糖、尿素、苯丙氨酸以及蛋氨酸代謝物水平顯著升高(P<0.05)，脯氨酸、丙氨酸、谷氨酸、肌醇、絲氨酸、丙三醇、亞油酸以及4-羥基脯氨酸水平顯著降低(P<0.05)，MCAO模型大鼠腦組織丙氨酸、乳酸、尿素、亮氨酸、脯氨酸、纈氨酸、2-羥基異丁酸、異亮氨酸水平顯著升高(P<0.05)。代謝通路分析結(jié)果表明，這些差異代謝物可參與部分氨基酸合成及亞油酸代謝通路、甲烷代謝通路、甘油酯類代謝通路及氨酰-tRNA生物合成等，腦缺血再灌注損傷時腦組織與血清中存在的差異表達(dá)代謝物，可能參與腦卒中發(fā)病機(jī)制。以上結(jié)論突出了代謝組學(xué)在發(fā)現(xiàn)新的中風(fēng)生物標(biāo)志物方面的潛力，證明了靶向、非靶向代謝組學(xué)分析可能是診斷腦卒中的有效工具，值得進(jìn)一步推廣研究。

代謝組學(xué)的方法也應(yīng)用于對卒中亞型診斷的研究中。Nelson等[15]采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS)檢測367例急性腦卒中患者發(fā)病9 h內(nèi)血漿中144種代謝產(chǎn)物，將181例心源性卒中與186例非心源性卒中患者進(jìn)行比較。研究發(fā)現(xiàn)了琥珀酸與心源性卒中及卒中復(fù)發(fā)有關(guān)，揭示了心源性卒中與能量代謝之間的潛在聯(lián)系。

2.2發(fā)病機(jī)制 腦卒中發(fā)病機(jī)制與能量代謝障礙、興奮性氨基酸毒性作用、活性氧失衡等代謝紊亂密切相關(guān)，而代謝組學(xué)可明確生物體不同代謝產(chǎn)物與相應(yīng)生理、病理狀態(tài)的關(guān)系。因此運(yùn)用代謝組學(xué)分析不同樣本代謝物的變化，對揭示腦卒中的發(fā)病機(jī)制有著至關(guān)重要的意義。黃玉等[16]采用基于超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜(UPLC/Q-TOF MS)的代謝組學(xué)方法，分析了缺血性腦卒中的生物標(biāo)志物。實(shí)驗(yàn)收集30例缺血性腦卒中患者和17例健康志愿者的血漿樣品，采用主成分分析和正交偏最小二乘判別分析，研究了2組血漿中的代謝物差異，并進(jìn)行了代謝通路分析。結(jié)果表明，患者組血漿中的二氫神經(jīng)鞘氨醇、植物鞘氨醇等物質(zhì)含量升高，谷氨酰胺、焦谷氨酸和2-酮丁酸等物質(zhì)含量降低，即腦卒中不僅影響了鞘脂類和氨基酸的代謝，還對能量代謝產(chǎn)生了顯著的影響。Zhang等[17]使用UPLC/Q-TOF MS對腦出血患者進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)分析，以探討腦出血的可能機(jī)制。共有30名腦出血患者和30名對照受試者參加了該研究。結(jié)果共確定了腦出血患者11種與對照組相比不同的代謝物，它們與脂肪酸氧化、鞘脂和磷脂代謝的破壞以及炎癥、氧化應(yīng)激和血管病變的增加有關(guān)。對這些代謝物的進(jìn)一步多元logistic回歸分析表明，左旋肉堿和磷脂酰膽堿具有作為腦出血生物標(biāo)志物的潛力。這為腦出血發(fā)病機(jī)制的研究提供了參考。

2.3腦保護(hù)機(jī)制 有研究表明，中藥提取物可針對腦缺血性損傷提供直接保護(hù)并充當(dāng)潛在的神經(jīng)保護(hù)劑[18]。代謝組學(xué)可綜合分析生物樣品中的內(nèi)源性小分子，通過多元統(tǒng)計分析機(jī)體受到刺激或者干擾后內(nèi)源性代謝物的整體變化，是中醫(yī)藥與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)相結(jié)合的有力工具，對中醫(yī)藥治療疾病機(jī)制的研究具有很大的潛力。應(yīng)用代謝組學(xué)的方法研究中藥對腦卒中的保護(hù)機(jī)制可能是一個可靠的方法[19]。

Wang等[20]通過基于GC-MS的代謝組學(xué)研究了臨床上常用來治療缺血性腦卒中恢復(fù)期的神經(jīng)保護(hù)劑蒺藜果實(shí)總皂苷(GSTTF)對MCAO大鼠模型的保護(hù)作用。代謝組學(xué)分析顯示，GSTTF可以通過調(diào)節(jié)包括脂肪酸代謝、氨基酸代謝和碳水化合物代謝在內(nèi)的多種代謝途徑來逆轉(zhuǎn)MCAO引起的血清代謝偏差，起到神經(jīng)保護(hù)作用。

丹參-冰片復(fù)方已廣泛用于治療缺血性腦卒中。丹酚酸B(Sal B)是丹參中含量及生物活性最高的化合物。然而，Sal B-冰片復(fù)方的科學(xué)內(nèi)涵和配伍機(jī)制尚不清楚。Duan等[21]基于UPLC-Q/TOF-MS結(jié)合病理學(xué)的代謝組學(xué)方法，研究Sal B/冰片對抗MCAO大鼠的缺血性腦卒中。代謝組學(xué)結(jié)果分析表明，Sal B可以通過改善能量代謝、脂質(zhì)代謝、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激來改善MCAO誘導(dǎo)的腦缺血；冰片神經(jīng)保護(hù)作用的增強(qiáng)與Sal B濃度的提高有關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)初步闡明了Sal B或Sal B/冰片治療缺血性腦卒中的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制，可推動丹參-冰片復(fù)方的二次開發(fā)。

3 基于代謝組學(xué)對中醫(yī)藥治療缺血性腦卒中的研究

利用代謝組學(xué)的方法研究中醫(yī)藥，能夠揭示疾病發(fā)病機(jī)制、復(fù)方及中醫(yī)非藥物療法等治療疾病過程中生物體系內(nèi)所發(fā)生的代謝物及代謝通路的變化，即從中醫(yī)“整體觀念”的角度和中醫(yī)藥多組分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)出發(fā)研究生物體的功能水平，具有廣闊的應(yīng)用前景。

丹參川芎嗪注射液(DSCXQ)是一種常用于治療腦卒中及其相關(guān)后遺癥的中藥制劑。目前對于DSCXQ對缺血性腦卒中起到保護(hù)作用的機(jī)制缺乏系統(tǒng)研究。Zhou等[22]基于UHPLC-Q-Orbitrap HRMS的代謝組學(xué)分析DSCXQ治療MCAO誘導(dǎo)的缺血性腦卒中的潛在機(jī)制。通過代謝組學(xué)分析，DSCXQ組和模型組之間鑒定出55種差異代謝物，涉及鞘脂代謝、甘油磷脂代謝、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、初級膽汁酸、泛酸、CoA、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成途徑。這項(xiàng)研究有助于我們了解缺血性腦卒中的代謝變化以及與DSCXQ臨床應(yīng)用相關(guān)的潛在機(jī)制。

徐敉等[23]采用代謝組學(xué)檢測技術(shù)評價血府逐瘀湯對缺血性腦卒中大鼠的保護(hù)作用并探究其機(jī)制。采用線栓法建立缺血性腦卒中大鼠模型。灌藥2周后采用UPLCQTOF-MS/MS法檢測各組大鼠血清代謝譜的變化情況，用主成分分析和正交偏最小二乘法判別分析，對檢測結(jié)果作多元變量統(tǒng)計分析，篩選差異代謝物，并作代謝通路分析。結(jié)果顯示，血府逐瘀湯對缺血性腦卒中保護(hù)作用的代謝途徑主要有氨基酸代謝(丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，精氨酸和脯氨酸代謝，甘氨酸、絲氨酸和色氨酸代謝)、鞘磷脂代謝和丁酸代謝等，即血府逐瘀湯液對缺血性腦卒中大鼠的治療作用與氨基酸代謝和脂代謝有關(guān)。

補(bǔ)陽還五湯是一種臨床上常用于幫助腦卒中后神經(jīng)功能恢復(fù)的方劑。為了尋找補(bǔ)陽還五湯在中風(fēng)治療和預(yù)后中療效的潛在臨床指標(biāo)，夏鑫華等[24]利用代謝組學(xué)技術(shù)探討其干預(yù)缺血性腦卒中的作用機(jī)制。結(jié)果顯示，與模型組比較，補(bǔ)陽還五湯組的內(nèi)源性代謝物質(zhì)谷氨酰胺、異亮氨酸、次黃嘌呤、前列腺素2、谷氨酸、脯氨酸、焦谷氨酸、纈氨酸、膽固醇和吲哚丙酸在模型組、假手術(shù)組、補(bǔ)陽還五湯組中變化顯著，為缺血性腦卒中的潛在生物標(biāo)志物，即補(bǔ)陽還五湯對局灶性腦缺血模型的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)內(nèi)源性代謝物變化有關(guān)。

黃連解毒湯(HLJDD)是經(jīng)典的解熱毒方劑。該方中黃芩、梔子等具有多種神經(jīng)保護(hù)作用，已被廣泛用于治療腦卒中等神經(jīng)系統(tǒng)疾病。Zhang等[25]研究了HLJDD的主要成分小檗堿(A)、黃芩苷(B)和茉莉花苷(C)的各種組合對大鼠MCAO模型的治療效果。使用基于質(zhì)子核磁共振(1H NMR)的代謝組學(xué)，對A、B和C單獨(dú)及其組合的作用機(jī)制進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，ABC聯(lián)合治療提高了細(xì)胞抗氧化水平，這些抗氧化劑在缺血再灌注期間通過Nrf2信號級聯(lián)反應(yīng)清除活性氧，使用其他處理則未觀察到這些保護(hù)作用。以上結(jié)果表明HLJDD中的成分組合比單味草藥表現(xiàn)出更強(qiáng)的效果，也說明代謝組學(xué)方法是一種探索中藥復(fù)方機(jī)制的有效工具。

腦脊液(CSF)中的氨基酸(AA)在腦缺血(CI)中起關(guān)鍵作用。步長腦心通膠囊(BNC)廣泛用于治療心腦血管疾病。為從系統(tǒng)層面探討B(tài)NC逆轉(zhuǎn)CI的治療效果和藥理機(jī)制，Xu等[26]首次構(gòu)建了含有AA代謝物、關(guān)鍵調(diào)控酶和蛋白質(zhì)的CI氨基酸-蛋白質(zhì)相互作用失衡網(wǎng)絡(luò)。該研究基于MCAO大鼠模型，分析了MCAO后3,6,12和24 h腦脊液中氨基酸的動態(tài)水平?；贑I的不平衡網(wǎng)絡(luò)，選擇并使用酶聯(lián)免疫吸附測定和蛋白質(zhì)印跡法驗(yàn)證了調(diào)節(jié)BNC介導(dǎo)AA生物標(biāo)志物生成的四種關(guān)鍵酶，最后發(fā)現(xiàn)芳香族L-氨基酸脫羧酶(AADC)是BNC起到神經(jīng)保護(hù)作用的靶點(diǎn)之一。本研究為探索腦缺血的機(jī)制研究提供了新的策略，并有助于發(fā)現(xiàn)BNC的潛在作用機(jī)制。

4 小結(jié)與展望

中醫(yī)藥在防治腦卒中方面具有獨(dú)特優(yōu)勢，且隨著現(xiàn)代中醫(yī)的發(fā)展，干預(yù)方法逐漸豐富，基礎(chǔ)研究日漸深入。對于中藥干預(yù)原本因出血或缺血產(chǎn)生紊亂的代謝產(chǎn)物的研究，需要通過對代謝產(chǎn)物的定量分析，為其病因病機(jī)和中藥療效提供物質(zhì)解釋[6]。

目前，代謝組學(xué)已在中醫(yī)藥與腦卒中之間架起了一座堅實(shí)的橋梁。然而，代謝組學(xué)在中醫(yī)藥方面的研究仍有很大的發(fā)展空間。首先，需要更新代謝組學(xué)技術(shù)，探索更為精準(zhǔn)的靶點(diǎn)，以對腦卒中的診斷及用藥有更精確的把握；其次，目前有關(guān)代謝組學(xué)在腦卒中治療中的應(yīng)用主要集中在實(shí)驗(yàn)性研究，相關(guān)的特異性生物學(xué)標(biāo)志物存在與臨床結(jié)合不夠深入、研究數(shù)量不足、機(jī)制闡述不夠全面等諸多問題，這些都是未來代謝組學(xué)技術(shù)的重點(diǎn)研究方向。想要在代謝組的基礎(chǔ)上對腦卒中甚至于整個腦病系統(tǒng)的研究有更好的發(fā)展，除了代謝組學(xué)本身的進(jìn)步外，還要求研究者運(yùn)用這一技術(shù)對腦卒中進(jìn)行全方位的研究，充分發(fā)揮代謝組學(xué)的優(yōu)勢，使中醫(yī)藥更好地服務(wù)于人類健康事業(yè)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。