曾維新，云川，李曉燕，李大偉

（海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 內(nèi)分泌科，海南 海口 570102）

糖尿病是一種常見的內(nèi)分泌疾病，包括1 型和2 型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus,T2DM），其中T2DM 可發(fā)生于任何年齡，是最主要的糖尿病類型。隨著我國人民生活水平的提高和飲食方式的改變，T2DM 發(fā)病率逐年升高。目前約11.6%成年人患T2DM，預(yù)計到本世紀(jì)40 年代，國內(nèi)糖尿病患者將會超過6億[1]。胰島β 細(xì)胞功能缺陷導(dǎo)致的胰島素缺乏和胰島素抵抗（insulin resistance,IR）是T2DM 患者發(fā)病的最主要原因[2]。MicroRNA（miRNA）是一種具有保守序列的微小RNA，可以通過抑制或促進(jìn)RNA降解來調(diào)節(jié)后續(xù)基因的表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn)，肥胖與瘦人群的miRNA 表達(dá)有顯著差異[3]，而肥胖引起的脂質(zhì)超載與T2DM 發(fā)病關(guān)系密切。DEHGHANI等[4]發(fā)現(xiàn)，T2DM 患者血清miR-181b 水平異常。NDRG2是NDRG 家族成員，與miRNA 類似，具有高度保守性。近年來研究發(fā)現(xiàn)，NDRG2 在糖尿病小鼠的胰腺中異常表達(dá)，可能參與胰島素分泌[5]；同時腫瘤相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，NDRG2 可能是miR-181b 的下游靶基因[6]?；诖?，本研究觀察miR-181b 能否通過靶向調(diào)控下游基因NDRG2參與IR，探究其在T2DM 發(fā)病中的機制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、主要試劑及儀器

細(xì)胞株選用小鼠胰島β 細(xì)胞（美國ATCC）。熒光素酶檢測試劑盒（美國Biovision 公司），miR-181b模擬物、miR181b inhibitor、陰性對照（上海吉滿生物科技有限公司），轉(zhuǎn)染試劑盒（賽默飛世爾科技中國有限公司），NDRG2 單克隆抗體、二抗（英國Abcam公司），辣根過氧化物酶（北京中杉金橋生物技術(shù)公司）。二氧化碳培養(yǎng)箱（常州恒隆儀器有限公司），酶標(biāo)儀（賽默飛世爾科技中國有限公司），二級生物安全柜（BSC-1100IIA2-X，濟(jì)南歐萊博科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)采用含10 μL/L β-巰基乙醇和10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)小鼠胰島β細(xì)胞，培養(yǎng)條件為：37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長至融合度＞80%開始進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.2.2 轉(zhuǎn)染首先使用預(yù)測軟件Targetsca（http://www.targetscan.org）和miRanda（http://www.microrna.org/microrna/home.do）進(jìn)行靶基因預(yù)測，利用Primer 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計，構(gòu)建NDRG2 野生型（NDRG2WT-1uc）與突變型（NDRG2MUT-1uc）熒光素酶報告基因質(zhì)粒。

1.2.3 熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測相對熒光強度將培養(yǎng)后的小鼠胰島β 細(xì)胞接種于24 孔板，繼續(xù)培養(yǎng)過夜，待完全貼壁后采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染，分為Control 組（陰性對照）、NDRG2-WT 組（轉(zhuǎn)染NDRG2WT-luc）、NDRG2-MUT組（轉(zhuǎn)染NDRG2MUT-luc）、miR-181b mimics+NDRG2-WT 組（轉(zhuǎn)染miR-181b 模擬物和NDRG2WT-luc）、miR-181b mimics+NDRG2-MUT 組（轉(zhuǎn)染miR-181b 模擬物和NDRG2MUT-luc）、miR-181b inhibitor+NDRG2-WT 組（轉(zhuǎn) 染miR-181b inhibitor 和 NDRG2WT-luc）、miR-181 binhibitor+NDRG2-MUT 組（轉(zhuǎn) 染 miR-181b inhibitor 和NDRG2MUT-luc）。轉(zhuǎn)染48 h 的細(xì)胞將用于后續(xù)實驗。轉(zhuǎn)染結(jié)束后檢測海腎和螢火蟲熒光素酶的熒光強度，以兩者的比值來衡量相對活性，反映miR-181b與NDRG2 結(jié)合情況。

1.2.4 過表達(dá)和抑制 NDRG2根據(jù)LipofectamineTM2000 試劑盒說明書進(jìn)行操作，所有質(zhì)粒購自美國Addgene 公司。將pLenti6-NDRG2（過表達(dá)組）、pLenti6-Cherry（過表達(dá)對照組）、pLKONDRG2 shRNA（敲低組）、pLKO-Scramble（敲低對照組）分別與psPAX2 質(zhì)粒、pMD2.G 質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染至小鼠胰島β 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48 h 取上清液，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）檢測NDRG2 mRNA 的表達(dá)（按2-ΔΔCt法計算相對表達(dá)量）；Western blotting 檢測NDRG2 蛋白的表達(dá)；葡萄糖刺激的胰島素釋放試驗檢測低濃度（5 mmol/L）和高濃度（20 mmol/L）葡萄糖條件下的胰島素分泌量。

1.2.5 qRT-PCR檢測 miR-181b 和 NDRG2 mRNA未轉(zhuǎn)染的小鼠胰島β 細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，予以低濃度（5 mmol/L）和高濃度（20 mmol/L）葡萄糖刺激，收集上清液，以未加入葡萄糖為對照組，采用qRT-PCR 檢測5 mmol/L 葡萄糖組、20 mmol/L 葡萄糖組及對照組小鼠胰島β 細(xì)胞內(nèi)源性miR-181b 和NDRG2 mRNA 表達(dá)。

1.2.6 葡萄糖刺激的胰島素釋放試驗檢測胰島素分泌量在低濃度（5 mmol/L）和高濃度（20 mmol/L）葡萄糖條件下，將miR-181b 模擬物（miR-181b mimics組）、miR-181b 抑制劑（miR-181b inhibitor 組）、陰性對照（Control 組）轉(zhuǎn)染至小鼠胰島β 細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h 后采用葡萄糖刺激的胰島素釋放試驗檢測胰島素分泌量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組比較用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組相對熒光強度比較

Control 組相對熒光強度為（100.00±1.01）%、NDRG2-WT 組為（104.20±3.04）%、NDRG2-MUT 組為（98.00±2.12）%、miR-181b mimics+NDRG2-WT 組為（63.27±5.16）%、miR-181b mimics+NDRG2-MUT組 為（96.67±2.23）%、miR-181b inhibitor+NDRG2-WT組為（133.59±4.48）%、miR-181 binhibitor+NDRG2-MUT 組為（97.13±1.0）%。各組相對熒光強度比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=46.325，P=0.000）。見圖1。

圖1 miR-181b與NDRG2靶基因結(jié)合位點示意圖

熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測發(fā)現(xiàn)，miR-181b模擬物可以明顯抑制NDRG2WT-luc 的3'-端非翻譯區(qū)的表達(dá)，但對NDRG2-MUT 組和Control 組無明顯影響；miR-181b inhibitor 可以加強NDRG2WT-luc 的3'-端非翻譯區(qū)的表達(dá)，但對NDRG2-MUT 組和Control 組無明顯影響。說明miR-181b 可以通過與NDRG2 的3'-端非翻譯區(qū)結(jié)合來調(diào)控NDRG2 的表達(dá)。

2.2 NDRG2對胰島素分泌的影響

過表達(dá)組與過表達(dá)對照組NDRG2 mRNA 和蛋白相對表達(dá)量比較，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），過表達(dá)組均高于過表達(dá)對照組。在5 mmol/L 葡萄糖條件下，過表達(dá)組與過表達(dá)對照組胰島素分泌量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。在20 mmol/L 葡萄糖條件下，過表達(dá)組與過表達(dá)對照組胰島素分泌量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），過表達(dá)對照組高于過表達(dá)組。見表1 和圖2。

表1 過表達(dá)組與過表達(dá)對照組NDRG2 mRNA和蛋白相對表達(dá)量、胰島素分泌量比較（）

表1 過表達(dá)組與過表達(dá)對照組NDRG2 mRNA和蛋白相對表達(dá)量、胰島素分泌量比較（）

敲低組與敲低對照組NDRG2 mRNA 和蛋白相對表達(dá)量比較，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），敲低組均低于敲低對照組。在5 mmol/L 葡萄糖條件下，敲低組與敲低對照組胰島素分泌量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。在20 mmol/L 葡萄糖條件下，敲低組與敲低對照組胰島素分泌量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），敲低組高于敲低對照組。見表2 和圖2。

表2 敲低組與敲低對照組NDRG2 mRNA和蛋白相對表達(dá)量、胰島素分泌量比較（）

表2 敲低組與敲低對照組NDRG2 mRNA和蛋白相對表達(dá)量、胰島素分泌量比較（）

圖2 NDRG2蛋白的表達(dá)

2.3 高糖刺激對小鼠胰島β細(xì)胞內(nèi)源性miR-181b和NDRG2 mRNA表達(dá)的影響

5 mmol/L 葡萄糖組、20 mmol/L 葡萄糖組及對照組小鼠胰島β 細(xì)胞內(nèi)源性miR-181b 和NDRG2 mRNA 相對表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：5 mmol/L葡萄糖組與對照組的miR-181b 和NDRG2 mRNA 相對表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；20 mmol/L 葡萄糖組miR-181b 相對表達(dá)量高于對照組和5 mmol/L 葡萄糖組（P＜0.05），NDRG2 mRNA 相對表達(dá)量低于對照組和5 mmol/L 葡萄糖組（P＜0.05）。見表3。

表3 3組小鼠胰島β細(xì)胞內(nèi)源性miR-181b和NDRG2 mRNA相對表達(dá)量比較（）

表3 3組小鼠胰島β細(xì)胞內(nèi)源性miR-181b和NDRG2 mRNA相對表達(dá)量比較（）

注：?與5 mmol/L葡萄糖組和對照組比較，P ＜0.05。

2.4 miR-181b對胰島素分泌的影響

5 mmol/L葡萄糖條件下，Control 組、miR-181b mimics 組、miR-181b inhibitor 組胰島素分泌量比較，經(jīng)方差分析，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。在20 mmol/L 葡萄糖條件下，3 組胰島素分泌量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：miR-181b mimics 組高于Control 組（P＜0.05），miR-1b1 inhibitor 組低于Control組和miR-181b mimics 組（P＜0.05）。見表4。

表4 不同濃度葡萄糖條件下各組胰島素分泌量比較（IU，）

表4 不同濃度葡萄糖條件下各組胰島素分泌量比較（IU，）

注：①與Control 組比較，P ＜0.05；②與miR-181b mimics 組比較，P ＜0.05。

3 討論

T2DM 占總的糖尿病人群的90%以上，是主要的糖尿病類型，也是僅次于心血管疾病和惡性腫瘤的嚴(yán)重危害人類健康的慢性疾病，該病由基因和環(huán)境等多種因素導(dǎo)致，主要特征是胰島素相對或絕對不足導(dǎo)致高血糖狀態(tài)，胰島β 細(xì)胞分泌胰島素功能障礙導(dǎo)致骨骼肌、肝臟、脂肪等組織發(fā)生胰島素抵抗是T2DM 發(fā)病的主要原因。胰島素是由胰島β 細(xì)胞分泌的特異性激素，可以通過與肌肉、肝臟和脂肪等組織上的特異性受體結(jié)合，來調(diào)節(jié)葡萄糖代謝，維持血液葡萄糖穩(wěn)定狀態(tài)。胰島素的分泌不僅受胰島素基因的調(diào)控，而且受外源性營養(yǎng)物質(zhì)和內(nèi)源性因子的影響。隨著分子生物學(xué)的飛躍發(fā)展，近年來研究發(fā)現(xiàn)糖尿病患者miRNA 譜表達(dá)異常[7]，miRNA 異常表達(dá)可能與胰島β 細(xì)胞功能障礙、T2DM病情進(jìn)展關(guān)系密切。

miRNA 是一類短鏈的非編碼RNA，可以通過與其他靶基因的3'-非編碼區(qū)結(jié)合，來調(diào)控其他RNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯。有研究表明，miR-181b 在肥胖小鼠中低表達(dá)，外源性注射miR-181b 后其胰島素敏感性提高[8]。COPIER等[9]報道外周循環(huán)miR-181b 是糖尿病心肌病的生物標(biāo)志物，可能是研究T2DM 的新靶點。本研究前期預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)NDRG2 上可能存在miR-181b 的靶向結(jié)合位點，且兩者都與胰島素抵抗關(guān)系密切，故本研究以小鼠胰島β 細(xì)胞株為研究對象，觀察miR-181b 是否能夠通過靶向調(diào)控NDRG2參與T2DM 的發(fā)生、發(fā)展。熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-181b mimics 和inhibitor 可以顯著影響野生型NDRG2WT-luc 的3'-端非翻譯區(qū)表達(dá)，但對突變型NDRG2MUT-1uc 和陰性對照無明顯影響，提示miR-181b 可以通過與NDRG2 的3'-端非翻譯區(qū)結(jié)合來調(diào)控NDRG2 的表達(dá)。高楠等[10]在胃癌細(xì)胞的培養(yǎng)過程中同樣發(fā)現(xiàn)miR-181b 能與NDRG2 的3'-UTR 結(jié)合，提示miR-181b 可以與NDRG2 的3'-UTR結(jié)合。

小鼠胰島β 細(xì)胞的胰島素分泌功能與人體胰腺有高度相似性，是研究胰島素分泌和糖尿病的理想細(xì)胞株之一。LI等[11]在腎癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，提高miR-181b 表達(dá)能抑制包括NDRG2 在內(nèi)的多種基因表達(dá)。高楠等[10]在胃癌細(xì)胞中通過熒光素酶報告基因分析發(fā)現(xiàn)NDRG2 為miR-181b 的下游靶基因，提出通過抑制miR-181b 的表達(dá)來抑制NDRG2，進(jìn)一步干擾細(xì)胞侵襲作用。NDRG2 屬于NDRG 家族一員，位于染色體14q11.1，其在進(jìn)化上非常保守，提示該基因在人類生命過程中具有重要作用。NDRG2 高表達(dá)于人體骨骼肌中，不僅參與腫瘤、氧化應(yīng)激、細(xì)胞分化、增殖、凋亡等眾多生理活動[12]，而且可能通過蛋白激酶Akt 磷酸化調(diào)節(jié)胰島素分泌[12]。有學(xué)者通過Western blotting 檢測糖尿病小鼠胰島和骨骼肌NDRG2，發(fā)現(xiàn)胰腺NDRG2 表達(dá)增強[14]。本研究通過過表達(dá)和敲低NDRG2基因來驗證NDRG2 是否能直接影響胰島素分泌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在20 mmol/L 高糖刺激下，過表達(dá)組胰島素分泌量顯著降低，而敲低組則顯著升高，提示NDRG2 對胰島素分泌具有抑制作用。為了進(jìn)一步探討miR-181b 對NDRG2 的靶向調(diào)控是否會影響小鼠胰島β 細(xì)胞分泌胰島素，本研究進(jìn)一步檢測了胰島素分泌量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在20 mmol/L 葡萄糖刺激下，小鼠胰島β 細(xì)胞內(nèi)源性miR-181b 相對表達(dá)量顯著升高，NDRG2 mRNA 相對表達(dá)量顯著降低，但是在5 mmol/L 葡萄糖刺激下無顯著變化，說明高糖刺激會影響小鼠胰島β 細(xì)胞內(nèi)源性miR-181b 和NDRG2 mRNA 表達(dá)變化，這2 個基因可能直接參與胰島素分泌的調(diào)控。進(jìn)一步添加miR-181b mimics 和 miR-181b inhinitor 并給予20 mmol/L 葡萄糖刺激后發(fā)現(xiàn)，miR-181b mimics 能顯著提高NDGR2 表達(dá)，同時胰島素分泌量顯著升高，而miR-181b inhibitor 能顯著下調(diào)NDGR2 表達(dá)，且胰島素分泌量隨之下降。這為miR-181b 能通過靶向調(diào)控NDRG2 介導(dǎo)胰島素分泌，并參與T2DM 的發(fā)病過程提供了直接證據(jù)。

綜上所述，miR-181b 不影響小鼠胰島β 細(xì)胞增殖，但可以通過靶向抑制NDRG2 的表達(dá)來提高胰島素分泌，可以為T2DM 的發(fā)病機制研究和治療提供新思路。