高利超，甘林望，耿磊，劉建，吳蔚樺，歐三桃

（西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 腎病內(nèi)科，四川 瀘州 646000）

隨著我國生活水平提高，糖尿病發(fā)病率越來越高。糖尿病腎病（diabetic nephropathy,DN）是糖尿病最常見的并發(fā)癥，DN 最終可發(fā)展為終末期腎病，導(dǎo)致不良預(yù)后[1-2]。積極防治DN，抑制病情進(jìn)展，是避免腎衰竭，延長患者生命的主要手段。氧化應(yīng)激是DN 致病機(jī)制中的重要部分，低聚原花青素是天然的抗氧化劑，具有降糖降脂、調(diào)節(jié)免疫的作用。劉尚軍等[3]研究表明，原花青素能有效減輕自發(fā)性高血壓大鼠腎纖維化程度，發(fā)揮腎保護(hù)功效。

近年來研究證實(shí)，Wnt 信號(hào)通路參與急性腎損傷、腎臟腫瘤等多種腎臟病變，并通過調(diào)節(jié)腎小球固有細(xì)胞的增殖與凋亡，參與腎臟疾病的發(fā)生、發(fā)展，與DN 也存在密切聯(lián)系[4-6]。為研究低聚原花青素治療DN 的具體作用機(jī)制，探究其是否能通過Wnt/β-catenin 信號(hào)通路發(fā)揮腎臟保護(hù)功效，西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院開展如下研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

60 只SD 雄性大鼠購自上海海利生物技術(shù)股份有限公司，體重300～320 g。大鼠自由飲食、飲水，在25℃、濕度50%的環(huán)境中喂養(yǎng)，12 h 晝/夜循環(huán)照明。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2021-0005，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（川）2021-0014。

1.2 主要試劑與儀器

低聚原花青素（西安通澤生物科技有限公司），鏈脲佐菌素（美國Sigma公司），SOD、MDA檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所），SABC 免疫組織化學(xué)試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司），兔抗鼠Wnt4多克隆抗體、兔抗鼠β-catenin 多克隆抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司），TRIzol 試劑（上海生工生物工程股份有限公司），光學(xué)顯微鏡及全自動(dòng)生化分析儀（日本Olympus 公司），One Touch Ⅱ型血糖儀（美國強(qiáng)生公司），PCR擴(kuò)增儀（杭州領(lǐng)航基因科技有限公司），-80℃冰箱（美國Thermo Scientific forma公司），低溫高速離心機(jī)（美國Bckman公司）。

1.3 分組及處理

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組選擇60 只SD 雄性大鼠隨機(jī)分為正常對照組（NC 組）、DN 模型組（DN 組）、DN 模型+低劑量低聚原花青素組（低劑量組）、DN 模型+中劑量低聚原花青素組（中劑量組）、DN 模型+高劑量低聚原花青素組（高劑量組），每組12只。

1.3.2 處理方法①采用單次腹腔注射鏈脲佐菌素復(fù)制DN 模型，具體操作：將鏈脲佐菌素溶解于pH 4.5 檸檬酸鈉，按照55 mg/kg 的比例，腹腔注射復(fù)制DN 模型。24 h 后采集大鼠尾靜脈血，血糖儀監(jiān)測血糖，若血糖＞16.7 mmol/L則模型復(fù)制成功。②模型復(fù)制成功后，低、中、高劑量組分別給予50 mg/kg、100 mg/kg、150 mg/kg 低聚原花青素灌胃，NC 組和DN 組給予等體積蒸餾水灌胃。連續(xù)灌胃16 周。

1.4 留取標(biāo)本

分別于實(shí)驗(yàn)4周、8周、12周、16周末收集大鼠24 h尿量，檢測24 h尿蛋白定量。16周末大鼠行腹腔麻醉，取4 mL血液，用于檢測血糖、血清肌酐（serum creatinine,Scr）、血尿素氮（blood urea nitrogen,BUN）。

固定大鼠，打開胸腔，充分暴露心臟，將注射器插入左心室，連接輸液器，使PBS 溶液順利進(jìn)入心臟，用眼科剪在右心耳處剪一個(gè)小口，使血液流出，持續(xù)輸入PBS液，待腎臟變白后取出左腎，去除包膜，用濾紙擦拭干，稱取重量，計(jì)算腎重指數(shù)（腎臟重量/體重），取出部分腎組織，按照組織塊重量與預(yù)冷勻漿體積比1∶9，冰水浴制成10%組織勻漿，2 000 r/min 離心15min，收集上清液用于檢測腎組織內(nèi)超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）活性、丙二醛（Malondialdehyde,MDA）含量。取出部分腎臟組織固定于10% 甲醛，待行病理檢查、Westernblotting及實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）。

1.5 指標(biāo)檢測

1.5.1 24 h 尿蛋白定量采用雙縮脲法檢測24 h尿蛋白定量。

1.5.2 血糖、Scr、BUN水平采用全自動(dòng)生化分析儀檢測血糖、Scr、BUN 水平。

1.5.3 腎組織SOD活性及MDA含量采用黃嘌呤氧化酶法檢測SOD活性，硫代巴比妥酸法檢測MDA含量。

1.5.4 蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin,HE）及過碘酸希夫（periodic acid-Schiff,PAS）染色觀察腎組織病理形態(tài)①用10%中性甲醛固定大鼠腎臟組織24 h，將腎組織修剪為2 mm厚的組織塊，乙醇脫水，二甲苯透明處理，浸泡后石蠟包埋。②HE 染色：脫蠟至水，經(jīng)二甲苯處理30 min，100%乙醇、95%乙醇分別處理5 min，蘇木精液染色10 min，1%鹽酸乙醇處理4 s，1%氨水返藍(lán)，伊紅染色3 min，顯微鏡下觀察。③PAS 染色：梯度乙醇脫蠟至水，高碘酸氧化液室溫處理20 min，無色品紅染色15 min，蘇木精染細(xì)胞核15 min，1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒，95%乙醇、100%乙醇分別脫水5 min，二甲苯3 次透明。

1.5.5 Western blotting 檢測腎組織Wnt4、β-catenin蛋白的表達(dá)取部分腎組織，采用玻璃勻漿器制備組織勻漿，通過SDS-PAGE 凝膠電泳對其進(jìn)行分離，分別加入50 μL 兔抗鼠Wnt4 多克隆抗體（1∶200）、β-catenin 多克隆抗體（1∶100），采用ELC 增強(qiáng)型發(fā)光液檢測Wnt4、β-catenin 蛋白的表達(dá)，以β-actin 為內(nèi)參，計(jì)算各組蛋白相對表達(dá)量。

1.5.6 qRT-PCR 檢測腎組織Wnt4、β-catenin mRNA 的表達(dá)①提取總RNA：取實(shí)驗(yàn)大鼠腎組織，加入Trizol 試劑，提取總RNA，取5 μL RNA 溶液，稀釋100倍，用紫外分光光度計(jì)檢測各樣品OD值，按照1 個(gè)OD260 值相當(dāng)于40 μg/mL RNA 計(jì)算RNA 濃度，總RNA 濃度=OD260 值×40 μg/mL×100，RNA 純度以A260/280 表示，其值在1.8～2.2 為純度符合要求。②RNA 逆轉(zhuǎn)錄：逆轉(zhuǎn)錄體系在冰上完成，取10 μL RNA，隨機(jī)引物（0.2 μg/mL）1 μl，加去DEPC 水至12 μL，均勻后離心3 s，65℃孵育5 min，冷卻30 s，加入5×Buffer 4 μL，3 μL dNTP（10 mmol/L），1 μL RNA 酶抑制劑（20 u/μL），1 μL 逆轉(zhuǎn)錄酶（20 u/μL），最后體積為20 μL，混勻離心，25℃孵育10 min，42℃孵育1 h，72℃孵育15 min。③qRT-PCR：以逆轉(zhuǎn)錄所得cDNA 為模板，在聚合酶催化下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物設(shè)計(jì)及合成均由上海生工生物工程技術(shù)有限公司完成，引物序列見表1。PCR 反應(yīng)體系共20 μL，包括FastStat universsl SYYBR green master 10 μL，正反向引物各0.5 μL，CDNA 溶液2.0 μL，DNase/Rnase free ddH2O 7.0 μL。④擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性10 min，94℃變性15 s，60℃延伸1 min，共45 個(gè)循環(huán)。⑤采用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA 相對表達(dá)量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較用單因素方差分析或重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血糖、Scr、BUN比較

各組大鼠血糖、Scr 及BUN 水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：DN 組血糖、Scr、BUN 水平較NC 組升高（P＜0.05）；低、中、高劑量組血糖、Scr、BUN水平較DN 組下降（P＜0.05）。見表1。

表2 各組大鼠血糖、Scr、BUN比較（n=12，）

表2 各組大鼠血糖、Scr、BUN比較（n=12，）

注：①與NC組比較，P ＜0.05；②與DN組比較，P ＜0.05。

2.2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)24 h尿蛋白定量的變化

各組大鼠灌胃4 周、8 周、12 周、16 周的24 h尿蛋白定量比較，采用重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)24 h 尿蛋白定量有差異（F=102.38，P=0.000）。②各組24 h 尿蛋白定量有差異（F=86.58，P=0.000）。③各組24 h 尿蛋白定量變化趨勢有差異（F=174.64，P=0.000）。見表3。

表3 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)24 h尿蛋白定量比較（n=12，mg/24 h，）

表3 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)24 h尿蛋白定量比較（n=12，mg/24 h，）

2.3 各組大鼠腎組織病理變化

腎切片HE 染色和PAS 染色光鏡檢查結(jié)果顯示，NC 組可見正常腎小球及腎小管，腎小管上皮細(xì)胞排列整齊。DN 組大鼠腎組織部分腎小管萎縮、小管間質(zhì)區(qū)基質(zhì)增加，間質(zhì)內(nèi)見大量炎癥細(xì)胞浸潤，腎間質(zhì)纖維化、部分腎小管上皮細(xì)胞空泡變性、脫落。低、中、高劑量組以上病理改變均較DN 組減弱，且各劑量組呈劑量依賴性減弱。見圖1。

圖1 各組大鼠腎組織病理改變（×200）

2.4 各組大鼠左腎指數(shù)比較

NC 組、DN 組及低、中、高劑量組左腎指數(shù)分別 為（0.22±0.07）、（0.46±0.11）、（0.37±0.09）、（0.33±0.07）、（0.29±0.06），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=14.605，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：DN 組左腎指數(shù)較NC 組升高（P＜0.05）；低、中、高劑量組左腎指數(shù)較DN 組降低（P＜0.05）。

2.5 各組大鼠腎組織SOD活性及MDA含量比較

各組大鼠SOD 活性比較，經(jīng)方差分析，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。各組大鼠MDA 含量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：與NC 組比較，DN 組MDA 含量升高（P＜0.05），與DN 組比較，不同劑量組MDA 含量降低（P＜0.05）。見表4。

表4 各組大鼠腎組織SOD活性及MDA含量比較（n=12，）

表4 各組大鼠腎組織SOD活性及MDA含量比較（n=12，）

注：①與NC組比較，P ＜0.05；②與DN組比較，P ＜0.05。

2.6 各組大鼠腎組織Wnt4、β-catenin mRNA 和蛋白表達(dá)

各組大鼠腎組織Wnt4、β-catenin mRNA 和蛋白相對表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：DN 組大鼠腎組織Wnt4、β-catenin mRNA 和蛋白相對表達(dá)量高于NC 組（P＜0.05），不同劑量組Wnt4、β-catenin mRNA 和蛋白相對表達(dá)量低于DN 組（P＜0.05）。見 表5 和圖2。

表5 各組大鼠腎組織Wnt4、β-catenin mRNA和蛋白相對表達(dá)量比較（n=12，）

表5 各組大鼠腎組織Wnt4、β-catenin mRNA和蛋白相對表達(dá)量比較（n=12，）

注：①與NC組比較，P ＜0.05；②與DN組比較，P ＜0.05。

圖2 各組大鼠腎組織Wnt4、β-catenin蛋白的表達(dá)

3 討論

腎臟是糖尿病最常累及的器官，DN 最終將發(fā)展為終末期腎病，影響患者預(yù)后。低聚原花青素是一種天然抗氧化劑，清除體內(nèi)自由基的效能遠(yuǎn)高于維生素C 及維生素E[7-9]。有研究結(jié)果表明，原花青素能有效清除機(jī)體自由基，減輕心肌缺血再灌注損傷，同時(shí)還能抗動(dòng)脈粥樣硬化[8,10]。為研究低聚原花青素治療DN 的作用，本研究通過復(fù)制鏈脲佐菌素模型DN 大鼠模型，并分別以50 mg/kg、100 mg/kg、150 mg/kg 低聚原花青素對DN 大鼠進(jìn)行灌胃處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與NC 組比較，DN 組大鼠血糖、Scr、BUN 水平顯著上升，而經(jīng)不同劑量低聚原花青素干預(yù)后，以上指標(biāo)水平均有所下降，且下降趨勢呈劑量依賴性。本研究中各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)24 h 尿蛋白定量結(jié)果表明，NC 組各時(shí)間點(diǎn)24 h尿蛋白定量無明顯變化，而DN 組大鼠24 h 尿蛋白定量隨時(shí)間的推移呈上升趨勢，且各時(shí)間點(diǎn)尿蛋白定量水平均明顯高于NC 組。但經(jīng)各劑量低聚原花青素干預(yù)后，DN 模型大鼠各時(shí)間點(diǎn)尿蛋白定量均明顯下降，且下降幅度呈劑量依賴性。

DN最主要的病理改變有腎小管間質(zhì)纖維化、腎小球硬化等，本實(shí)驗(yàn)中大鼠腎組織切片染色結(jié)果提示，DN 組大鼠腎組織內(nèi)腎小管萎縮、小管間質(zhì)區(qū)基質(zhì)增生、纖維化等改變明顯。而經(jīng)不同劑量低聚原花青素處理后的大鼠腎組織以上改變均減輕，且減輕程度呈劑量依賴性。檢測各組大鼠左腎指數(shù)也發(fā)現(xiàn)，DN 組腎指數(shù)明顯升高，提示大鼠腎組織組成成分發(fā)生了改變，而經(jīng)不同劑量低聚原花青素處理后，大鼠左腎指數(shù)有所下降，且下降程度呈劑量依賴性。以上研究結(jié)果表明，經(jīng)低聚原花青素處理后，DN大鼠腎組織纖維化、腎小管硬化等病理改變減輕，24 h尿蛋白定量異常在一定程度上得到糾正，說明低聚原花青素能有效改善大鼠DN腎臟結(jié)構(gòu)和臨床表現(xiàn)。

SOD 是一類含有金屬的氧化還原酶，能催化超氧化物，其活性與機(jī)體自由氧清除能力呈正相關(guān)，是機(jī)體最重要的細(xì)胞防御系統(tǒng)[11-13]。MDA 是組織細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化作用的產(chǎn)物之一，能有效反映組織內(nèi)抗氧化能力[14-15]。本研究檢測各組大鼠腎臟組織勻漿上清液SOD 活性及MDA 含量發(fā)現(xiàn)，DN 組SOD 活性明顯降低，MDA 含量明顯上升，提示DN大鼠腎臟組織的抗氧化及自由基清除能力減弱。但經(jīng)不同濃度低聚原花青素處理后，大鼠SOD 活性增強(qiáng)，MDA 含量下降，說明低聚原花青素能有效增強(qiáng)自由基清除能力，發(fā)揮抗氧化功能。

DN 的致病機(jī)制復(fù)雜，除氧化應(yīng)激外，Wnt 信號(hào)通路也可能通過調(diào)節(jié)腎小球固有細(xì)胞的增殖與凋亡，參與腎臟疾病的發(fā)生、發(fā)展[16-19]。本研究結(jié)果也表明，DN 大鼠腎組織Wnt4、β-catenin mRNA 和蛋白相對表達(dá)量較NC 組明顯升高，提示DN 大鼠腎組織內(nèi)Wnt4/β-catenin 信號(hào)通路被激活，而經(jīng)不同濃度低聚原花青素干預(yù)后，大鼠腎組織Wnt4、βcatenin mRNA 和蛋白相對表達(dá)量降低，提示低聚原花青素可能通過抑制Wnt4/β-catenin 信號(hào)通路，抑制DN 病情發(fā)展，減輕腎組織病理改變。

綜上所述，低聚原花青素能有效降低DN 大鼠24 h 尿蛋白定量，減輕腎臟病理損害。低聚原花青素可能通過抗氧化作用及抑制Wnt4/β-catenin 信號(hào)通路，發(fā)揮腎臟保護(hù)功效，并有望成為DN 的治療藥物。