戴伶俐，王 娜，白 帆，張 帆，宋 越，張月梅，達來寶力格，李曉艷，王根云，趙世華

（1. 內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學院， 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031；2. 呼和浩特市動物疫病防控中心， 內(nèi)蒙古 呼和浩特010020）

綿羊肺炎支原體（Mycoplasma ovipneumoniae，MO）是重要的羊呼吸道病原體，能引起綿羊和山羊非典型性肺炎。 患病羊只出現(xiàn)不同程度的臨床癥狀，主要表現(xiàn)為咳嗽、流鼻涕、漸進性消瘦、腹瀉和滲出性間質(zhì)性肺炎［1］，給養(yǎng)羊產(chǎn)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。MO 在我國廣泛存在，主要集中在肉羊、奶羊主產(chǎn)區(qū)，如內(nèi)蒙古、新疆、甘肅、四川等地［2］。羊只一旦感染MO，即便未出現(xiàn)明顯的臨床癥狀和肺部病變， 也會嚴重影響生產(chǎn)性能， 如日增重下降、胴體質(zhì)量降低等［3］。 應(yīng)用抗生素治療并不能降低MO 在羊體內(nèi)的定植率［4］，通過抗生素治療無法達到有效的治療效果， 患病羊只常常出現(xiàn)反復發(fā)病的情況。 非典型性肺炎是影響?zhàn)B羊業(yè)健康發(fā)展的重要呼吸道疫病［5-6］，因此，急需開發(fā)高效的診斷方法和疫苗產(chǎn)品，用于該病的有效防控。目前對于MO 的重要功能蛋白研究較少， 嚴重影響了其分子致病機制的研究以及防控技術(shù)的開發(fā)。

肺炎支原體入侵宿主造成感染的第1 步是黏附，因此，確定支原體黏附因子是防治感染的有效途徑。 P97 蛋白是豬肺炎支原體的黏附因子，介導豬肺炎支原體與呼吸道纖毛黏附［7］，是重要的毒力因子［8］。 根據(jù)生物信息學分析結(jié)果推測MO 的P113 蛋白與豬肺炎支原體黏附蛋白P97 直系同源，可能與MO 的黏附相關(guān)［9］。P113 蛋白C 末端具有良好的免疫原性［10］，且含有與P97 蛋白類似的重復序列。 楊發(fā)龍等［11］對MO 的P113 蛋白C末端重復區(qū)域進行原核表達， 證明該區(qū)域具有良好的免疫原性。 根據(jù)序列及結(jié)構(gòu)分析推測，P113 蛋白可能是MO 的黏附因子， 是潛在的毒力因子，因此，對該蛋白進行深入分析有利于進一步驗證其生物學功能。 該研究對9 株MO 內(nèi)蒙古分離株P(guān)113 基因序列進行擴增測序，分析P113 蛋白C 末端序列重復區(qū)域在不同菌株之間的變化情況， 為研究MO 黏附因子分子機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 MO 菌株

MO 內(nèi)蒙古分離株9 株，由內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學院獸醫(yī)研究所分離、 鑒定， 菌株信息見表1。MO 標準株Y98，由內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學院獸醫(yī)研究所保存。

表1 MO 內(nèi)蒙古分離株信息

1.1.2 主要試劑

支原體培養(yǎng)基， 青島海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；馬血清，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；細菌基因組DNA 提取試劑盒，天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品；2×高保真PCR Mix 預(yù)混液、氨芐西林、瓊脂糖、PCR 產(chǎn)物膠回收試劑盒，購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

恒溫搖床（THZ-98AB，上海一恒科學儀器有限公司），PCR 儀（Verit，ABI 公司），凝膠成像系統(tǒng)（Universal HoodⅡ，Bio-Rad 公司）， 電泳儀（DYCP-31DN，北京六一生物科技有限公司），生物安全柜（AirstreamRA2，Esco 公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 MO 培養(yǎng)及基因組DNA 提取

按照支原體培養(yǎng)基說明書配制培養(yǎng)基， 按照1∶10 比例接種MO 菌液， 在37 ℃、150 r/min 恒溫搖床培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)至培養(yǎng)基顏色變?yōu)槌赛S色；收集培養(yǎng)產(chǎn)物，4 ℃、13 000 r/min 離心20 min，棄盡上清液， 菌體沉淀用于提取基因組DNA，操作過程按照細菌基因組DNA 提取試劑盒說明書。獲得的各菌株基因組DNA 保存于-20 ℃，備用。

1.2.2 P113 基因克隆與測序

根據(jù)GenBank 公布的支原體GZ-QX1 株P(guān)113 基因序列 （GenBank 登錄號：KR270152.1），使用Oligo 7.37 軟件設(shè)計P113 基因片段擴增引物，上游引物P113-F：5′-CGCGGATCCGCGGCAAA ACAAGATTACTAT-3′；下游引物P113-R：5′-CCGG AATTCCGGTTATTCAAACTCTTTTAG-3′。

以各MO 菌株基因組DNA 為模板， 擴增P113 基因片段。 PCR 反應(yīng)體系：2×高保真PCR Mix 預(yù) 混 液25 μL，P113-F （10 μmol/L）1 μL，P113-R（10 μmol/L）1 μL，基因組DNA 模板1 μL，用無菌無酶水補至50 μL。 PCR 擴增條件為：95℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸80 s，30 個循環(huán)；72 ℃最終延伸10 min；4 ℃保溫。 PCR 陽性對照模板為MO Y98 株基因組DNA，陰性對照模板為超純水。PCR 產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳， 切下目的片段凝膠塊，用PCR 產(chǎn)物膠回收試劑盒回收目的片段， 純化PCR 產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.3 P113 蛋白序列分析

測序獲得的各菌株P(guān)113 基因序列用NCBI 在線BLSAT 軟件進行初步序列比對。 從NCBI 下 載3 株MO 菌 株ATCC 29419 （Gen-Bank 登錄號：KR021380.1）、GZ-QX1（GenBank登 錄 號：KR270152.1）、NCTC 10151 （GenBank登錄號：LR215028.1）的P113 基因DNA 序列，采用DNASTAR 和MEGA 7.0 軟件將各菌株P(guān)113 基因序列翻譯為氨基酸序列并分析其進化關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 P113 基因片段擴增結(jié)果

以不同MO 分離株基因組DNA 為模板擴增P113 基因片段， 各菌株擴增產(chǎn)物大小不完全一致，片段長度介于1 100～1 300 bp（見圖1），提示P113 基因具有一定的多樣性。

圖1 MO 不同分離株P(guān)113 基因片段PCR 擴增結(jié)果

2.2 P113 蛋白序列比對結(jié)果

將測序獲得的不同菌株P(guān)113 基因片段序列翻譯為氨基酸序列進行比對，與NCBI 下載的3 株MO 菌 株ATCC 29419、GZ-QX1、NCTC 10151 的P113 蛋白序列相比，9 株MO 內(nèi)蒙古分離株P(guān)113蛋白序列存在缺失或者插入。 缺失或者插入的序列存在一定的規(guī)律，P113 蛋白序列內(nèi)部存在重復序列，以KKAEGA（S）QNQG 為主要重復序列單元（見圖2）。

圖2 截短P113 蛋白序列比對結(jié)果

不同菌株包含的KKAEGA （S）QNQG 重復序列單元數(shù)量不完全相同。 從NCBI 下載的3 株MO菌株P(guān)113 蛋白序列中， 該重復序列單元含有10個；MO 內(nèi)蒙古分離株NM01-MO、CK-MO、NM03-MO、DMQ-ZM-MO 所含重復序列單元數(shù)量均高于10 個， 其余分離株所含重復序列單元數(shù)量較少，出現(xiàn)序列缺失（見表2）。

表2 MO 內(nèi)蒙古分離株及參考菌株P(guān)113蛋白C 末端氨基酸重復序列單元數(shù)量 單位：個

2.3 P113 蛋白序列進化樹分析

MO 不同分離株P(guān)113 蛋白序列進化樹分析結(jié)果表明，ATCC 29419、GZ-QX1 和NCTC 10151的遺傳距離最近，內(nèi)蒙古分離株DMQ-ZM-MO 和LK-MO 與前述3 株菌的遺傳距離最近，同屬一個分支；D00188-MO、SZW03-MO 和DMQ-BT-MO與其他菌株遺傳距離較遠（見圖3）。

圖3 截短P113 蛋白序列遺傳進化樹

3 討論

黏附蛋白是支原體侵害宿主機體的關(guān)鍵毒力因子之一［12］。 目前已有MO 分子致病機制相關(guān)研究［13-16］，但通過探究MO 關(guān)鍵蛋白功能來解析其分子致病機制方面的研究還十分有限。

由于MO 的P113 蛋白與豬支原體黏附因子P97 蛋白存在較高的同源性， 且C 末端都具有重復序列，因此，推測P113 蛋白是MO 潛在的黏附因子，但是目前缺少其直接影響MO 黏附作用的證據(jù)。已有研究證明MO 的P113 蛋白具有良好的免疫原性，具有開發(fā)為亞單位疫苗的潛力［10，17］。 由于P113部分基因序列較為保守，屬于MO 特異性序列，研究者們已經(jīng)據(jù)此研發(fā)相應(yīng)的檢測方法，例如：制備P113 蛋白單克隆抗體，用于MO 間接免疫熒光檢測和血清抗體檢測［18］；建立基于P113 基因的常規(guī)PCR 檢測方法和熒光定量PCR 檢測方法［19-20］。

該研究通過對2017—2022 年在內(nèi)蒙古地區(qū)分離的MO 菌株P(guān)113 基因片段克隆測序，發(fā)現(xiàn)不同菌株P(guān)113 基因片段長度存在一定差異，這種差異主要是由于C 末端重復區(qū)域的長度不一致而引起。 該研究發(fā)現(xiàn)，MO 內(nèi)蒙古分離株P(guān)113 蛋白C末端重復序列單元為KKAEGA（S）QNQG，不同分離株的重復數(shù)量并不完全相同，但是這種差異與MO分離株分離的時間和地點沒有明顯的相關(guān)性，可能與菌株自身的生物學特性相關(guān)。由于P113 蛋白是潛在的毒力因子，因此，重復序列單元的數(shù)量可能與MO 的毒力強弱有關(guān)，這有待于進一步研究。

4 結(jié)論

成功擴增9 株MO 內(nèi)蒙古分離株的P113 基因片段，這些菌株的P113 蛋白C 末端重復序列單元數(shù)量存在一定差異，該結(jié)果可為后續(xù)研究MO P113蛋白生物學功能以及MO 致病機制提供參考。