宋利文，趙 濛，楊凱鑫，高 民，胡紅蓮

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院動物營養(yǎng)與飼料研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

隨著家畜養(yǎng)殖的集約化進(jìn)程， 自20 世紀(jì)90年代以來抗生素使用量激增， 顯著提升了動物的生長性能并維持動物健康，但是，抗生素的廣泛應(yīng)用導(dǎo)致動物對抗生素的耐藥性增加， 抗生素殘留以及通過食物鏈威脅人類健康［1］。 2020 年7 月1日，我國明確規(guī)定全面禁止飼料中添加抗生素［2］，因此， 研發(fā)抗生素替代品并對其效果進(jìn)行評估，是目前畜牧業(yè)關(guān)注的熱點問題。 飼料添加劑具有提高牲畜免疫力、降低病患、提高采食量與加速生長等功效［3］。 乳酸菌是最常用的飼料添加劑之一，也是反芻動物胃腸道主要菌群之一［4］，可以產(chǎn)生大量消化酶，對于飼料中的粗纖維具有降解功能，有助于飼料營養(yǎng)成分的充分消化吸收［5］。乳酸菌可以促進(jìn)白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子和干擾素等細(xì)胞因子的釋放，使其參與到免疫過程［6］。 目前，關(guān)于益生菌對動物糞便菌群影響的研究多集中在單胃動物［7］。該研究擬以30 日齡犢牛為試驗動物， 在犢牛飲水中添加復(fù)合乳酸菌微生態(tài)制劑， 探討復(fù)合乳酸菌制劑對荷斯坦?fàn)倥ＩL性能、生化指標(biāo)及免疫指標(biāo)等參數(shù)的影響，進(jìn)而評估復(fù)合乳酸菌制劑在犢牛生產(chǎn)中的應(yīng)用效果，為今后在實踐中廣泛推廣這類抗生素替代品提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與分組

選擇體重相近、健康狀況良好的30 日齡荷斯坦?fàn)倥?0 頭，隨機(jī)分為對照組和試驗組，每組10頭。

1.2 復(fù)合乳酸菌制劑

試驗選擇的復(fù)合乳酸菌制劑由云南天騰化工有限公司提供， 主要成分是干酪乳桿菌為主的復(fù)合菌種。 該復(fù)合乳酸菌制劑18 ℃左右避光保存，其活菌數(shù)≥2×108CFU/mL，在使用前需搖勻。

1.3 試驗設(shè)計

對照組與試驗組犢牛飼喂相同的基礎(chǔ)日糧。 對照組正常飲水；試驗組犢牛飲水中添加復(fù)合乳酸菌制劑（從犢牛進(jìn)入試驗基地開始為第1天，連續(xù)添加3 d，從第2 周開始每周二與周五各添加1 次），飲水與復(fù)合乳酸菌制劑調(diào)配比例為50∶1，犢牛飲水量為7～8 L/d，復(fù)合乳酸菌制劑的添加量約為150 mL/（頭·d）。復(fù)合乳酸菌制劑的添加方式為一次性添加，2 h 內(nèi)喝完為最佳。試驗期為90 d。飼料配方由內(nèi)蒙古牧泉元興飼料有限公司提供， 飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.4 主要試劑與儀器

ELISA 試劑盒 （南京建成生物工程研究所）、半自動生化分析儀（A6，北京松上技術(shù)有限公司）、酶標(biāo)儀（華東電子DG5033A）、采血管、離心管與尖嘴吸管。

1.5 樣品采集與測定指標(biāo)

1.5.1 生長性能測定

分別于試驗第1 天與試驗第90 天對晨飼前的犢牛進(jìn)行空腹稱重， 計算犢牛平均日增重（ADG），平均日增重=（試驗?zāi)┲?試驗始重）/試驗天數(shù)。

1.5.2 腹瀉率測定

從試驗第1 天開始每天記錄對照組和試驗組犢牛的腹瀉天數(shù)與腹瀉頭數(shù)， 用于計算對照組和試驗組犢牛腹瀉率，腹瀉率（%）=［（腹瀉頭數(shù)×腹瀉天數(shù)）/（總頭數(shù)×總天數(shù)）］×100。

1.5.3 糞樣采集與指標(biāo)測定

分別于試驗1、30、60、90 d， 從每組隨機(jī)選擇5 頭犢牛，采集新鮮糞樣置于50 mL 離心管中，立即轉(zhuǎn)入-20 ℃冰箱凍存， 用于測定糞便中細(xì)菌總數(shù)、乳酸菌和大腸桿菌數(shù)量，菌群數(shù)量以每克糞便中所含細(xì)菌群落總數(shù)x 的對數(shù)表示［lg（xCFU/g）］，其中CFU（conlony forming unit）為菌落形成單位。

表1飼料組成及營養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）

細(xì)菌總數(shù)測定采用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基， 乳酸菌采用MRS 瓊脂培養(yǎng)基，大腸桿菌采用麥康凱瓊脂培養(yǎng)基。 各取不同時間點5 g 糞便樣品置于三角瓶中，加入45 mL 滅菌生理鹽水并振蕩混勻。吸取1 mL 樣品上清液移入裝有9 mL 滅菌生理鹽水的試管中振蕩混勻，即為10-2稀釋度的樣品處理液，如此進(jìn)行倍比稀釋。 分別吸取1 mL 10-4、10-5和10-6稀釋度的樣品處理液至無菌培養(yǎng)皿中， 每個梯度3 個重復(fù)，然后加入高壓滅菌的瓊脂培養(yǎng)基，充分混勻。 待培養(yǎng)基凝固后放于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h， 用Scan 300 型全自動菌落計數(shù)器進(jìn)行菌落計數(shù)。

1.5.4 血液樣品采集與指標(biāo)測定

從每組隨機(jī)篩選出8 頭犢牛，分別于試驗1、30、60、90 d 采集晨飼前頸靜脈血液10 mL， 用于血液生化、抗氧化與免疫指標(biāo)測定，每次采集時間與順序相同。傾斜放置析出血清后，3 000 r/min離心10 min， 用尖嘴吸管取上層血清， 分裝于1.5 mL 離心管中，立刻轉(zhuǎn)入-20 ℃冰箱凍存。 采用半自動生化分析儀測定葡萄糖 （GLU）、 尿素氮（BUN）、總 蛋 白（TP）、白 蛋 白（ALB）、甘 油 三 酯（TG）、肌 酐（CRE）含 量 與 堿 性 磷 酸 酶（ALP）活性；血清抗氧化指標(biāo)：總抗氧化能力（T-AOC）、丙二醛（MDA）含量，過氧化氫酶（CAT）與超氧化物歧化酶（SOD）活性；血清免疫指標(biāo)：IgA、IgG、IgM含量。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

試驗數(shù)據(jù)通過Excel 2010 初步整理， 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t 檢驗。 試驗結(jié)果表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”，P<0.05 表示差異顯著，P<0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加復(fù)合乳酸菌制劑對犢牛生長性能的影響

對照組和試驗組犢牛初生重、 試驗始重、試驗?zāi)┲嘏c平均日增重均差異不顯著（P>0.05）。 試驗組的平均日增重高于對照組， 增加了9.09%（見表2）。

表2 添加復(fù)合乳酸菌制劑對犢牛生長性能的影響 單位：kg

2.2 添加復(fù)合乳酸菌制劑對犢牛腹瀉率的影響

試驗組與對照組犢牛在試驗期間均出現(xiàn)了不同程度的腹瀉，對照組腹瀉率為32.88%，試驗組腹瀉率為24.00%，試驗組犢牛的腹瀉率低于對照組。

2.3 添加復(fù)合乳酸菌制劑對糞便菌群數(shù)量的影響

由表3 可知，隨著日齡的增加，對照組犢牛大腸桿菌數(shù)隨日齡的增加呈先下降后上升趨勢，試驗組犢牛大腸桿菌數(shù)呈下降趨勢。 對照組大腸桿菌數(shù)在試驗期均顯著（P<0.05）高于試驗組。 隨著日齡的增加，犢牛乳酸菌數(shù)呈上升趨勢，試驗組犢牛乳酸菌數(shù)在試驗1、60、90 d 時顯著 （P<0.05）高于對照組。 隨著日齡的增加，犢牛細(xì)菌總數(shù)呈上升趨勢， 對照組與試驗組差異均不顯著（P>0.05）。

表3 添加復(fù)合乳酸菌對犢牛糞便菌群數(shù)量的影響

2.4 復(fù)合乳酸菌制劑對犢牛血清生化指標(biāo)的影響

由表4 可知， 試驗組和對照組犢牛血清中GLU 含量在試驗期間呈先上升后下降趨勢，30 d 達(dá)到最高值，90 d 達(dá)到最低值， 且30、90 d時試驗組顯著（P<0.05）高于對照組。 試驗組血清中BUN 含量在試驗第1 天顯著 （P<0.05）高于對照組。 試驗90 d 內(nèi)， 試驗組和對照組犢牛血清中TP 含量均存在上升趨勢， 且對照組在60、90 d 顯著（P<0.05）高于試驗組。 2 組犢牛血清中ALB 與TG 含量在試驗各個時期均無顯著（P>0.05）差異。 犢牛血清中CRE 含量在試驗第1 天最高，且試驗組顯著（P<0.05）高于對照組，在30 d 時對照組顯著（P<0.05）高于試驗組。 2組ALP 活性隨著日齡的增加均呈先上升后下降的趨勢。

表4 添加復(fù)合乳酸菌對犢牛血清生化指標(biāo)的影響

2.5 復(fù)合乳酸菌制劑對犢牛血清抗氧化指標(biāo)的影響

由表5 可知，2 組犢牛血清中抗氧化指標(biāo)均無顯著（P>0.05）差異，其中T-AOC 含量在試驗期內(nèi)呈下降趨勢。CAT 活性呈先上升后下降趨勢，在60 d 時達(dá)到最高值， 在90 d 時達(dá)到最低值。 SOD活性呈先上升后下降趨勢。 MDA 含量呈先下降后上升趨勢，在試驗第1 天為最高值，在60 d 時達(dá)到最低值。

表5 復(fù)合乳酸菌制劑對犢牛血清抗氧化指標(biāo)的影響

2.6 復(fù)合乳酸菌制劑對犢牛血清免疫指標(biāo)的影響

由表6 可知， 日糧中添加復(fù)合乳酸菌制劑對血清免疫指標(biāo)無顯著（P>0.05）影響。 隨著日齡的增加， 試驗組與對照組的IgA、IgG 含量呈上升趨勢，在90 d 時達(dá)到最高值，且高于對照組；對照組IgM 含量呈上升趨勢，但試驗組呈下降趨勢，且在90 d 時，對照組的IgM 含量顯著（P<0.05）高于試驗組。

表6 復(fù)合乳酸菌制劑對犢牛血清中IgA、IgG、IgM 含量的影響

3 討論

3.1 添加復(fù)合乳酸菌制劑對犢牛生長性能與腹瀉率的影響

犢牛飼喂乳酸菌制劑可提高飼料的消化和利用效率，以及提高犢牛干物質(zhì)采食量［8］。 Zhao 等［9］通過從犢牛初生到斷奶飼喂益生菌發(fā)現(xiàn)， 益生菌可顯著增加犢牛的體重。 呂利軍等［10］將益生菌添加于犢牛飼料， 發(fā)現(xiàn)育肥前期日增重提高了14.9%，說明益生菌可能通過改變胃腸道的微生物區(qū)系，使胃腸道消化機(jī)能和吸收能力提升，也可能是其自身的產(chǎn)酶與產(chǎn)酸能力， 使?fàn)倥Ａ鑫钢械南傅玫窖a(bǔ)充，進(jìn)而產(chǎn)生積極影響。該研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，飼喂復(fù)合乳酸菌對犢牛的日增重?zé)o顯著影響，但是有增加趨勢。

犢牛代乳粉中添加乳酸菌同樣發(fā)現(xiàn)， 不僅瘤胃、網(wǎng)胃早期發(fā)育明顯，采食量以及犢牛生長性能有所增加，而且降低了腹瀉率［11-12］，乳酸菌可以維持后備牛腸道微生物平衡［13］，并防止腹瀉［14］。有研究顯示，酵母培養(yǎng)物能促進(jìn)動物腸道有益菌群的增殖，并降低致病菌，從而減少動物腹瀉的發(fā)生［15］。該研究與前人研究結(jié)果相似， 犢牛飲水中添加乳酸菌制劑可以降低犢牛腹瀉率。

3.2 添加乳酸菌制劑對犢牛糞便菌群數(shù)量的影響

穩(wěn)定的腸道菌群是犢牛健康的重要保障，因此， 構(gòu)建犢牛腸道菌群環(huán)境對于提高其免疫能力極其重要。 犢牛的健康狀況與其腸道中微生物所構(gòu)成的微生態(tài)平衡存在一定的相關(guān)性。當(dāng)腸道菌群發(fā)生紊亂時， 正常菌群會伴隨著出現(xiàn)異常情況，或者發(fā)生定植部位的轉(zhuǎn)換等，造成不同程度的胃腸道機(jī)能損害，引起犢牛腹瀉率、發(fā)病率和死亡率的提高。 應(yīng)用復(fù)合益生菌調(diào)節(jié)腸道微生物菌群是一種重要手段， 可以有效改善腸道健康、促進(jìn)消化、減少腹瀉［16］。 斷奶仔豬日糧中添加復(fù)合益生菌制劑可以顯著降低糞便中的大腸桿菌含量［17］，對仔豬生產(chǎn)性能有良好促進(jìn)功能。 使用復(fù)合益生菌制劑飼喂梅花鹿能夠顯著降低糞便大腸桿菌， 顯著增加乳酸桿菌數(shù)， 使梅花鹿的生長性能與腸道微生物區(qū)系得到 顯 著 提 升 與 優(yōu) 化［18］。 Collington 等［19］研 究 發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌具有較強(qiáng)的益生效果，可提高動物生長性能， 并且可保持微生物菌群平衡以及提高機(jī)體免疫力。 陳鮮鑫等［20］就生長豬飼喂乳酸菌進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，豬糞中乳酸菌含量顯著提升。李清定等［21］也進(jìn)行了類似的試驗，結(jié)果顯示飼喂生長豬微生物發(fā)酵飼料可提高糞樣中乳酸菌數(shù)量，抑制大腸桿菌數(shù)量。 該研究發(fā)現(xiàn)在犢牛飲水中添加乳酸菌制劑在試驗結(jié)束時可抑制大腸桿菌數(shù)并有效提高糞樣乳酸菌的數(shù)量。 該試驗通過糞便采樣結(jié)果顯示， 飼喂復(fù)合乳酸菌使大腸桿菌數(shù)顯著降低， 且糞便中的乳酸菌數(shù)量顯著升高， 這些結(jié)果說明該試驗使用的復(fù)合乳酸菌對犢牛胃腸道的菌群有改善功效。

3.3 添加乳酸菌制劑對犢牛血清生化指標(biāo)、抗氧化指標(biāo)與免疫指標(biāo)的影響

血清總蛋白指標(biāo)可以說明蛋白質(zhì)的利用率， 大量研究表明飼喂乳酸菌制劑可以幫助動物肝臟合成蛋白質(zhì)，增強(qiáng)機(jī)體免疫力。肖海霞等［22］研究發(fā)現(xiàn)， 血清白蛋白含量增加可幫助增強(qiáng)有機(jī)體的代謝水平和免疫力， 增強(qiáng)肝臟合成蛋白質(zhì)的能力。 該試驗結(jié)果表明，添加復(fù)合乳酸菌后血清中的總蛋白與白蛋白含量差異不顯著，但有減少趨勢。 犢牛血清中尿素氮指標(biāo)降低，則代表著蛋白質(zhì)沉淀增加或分解速度的下降［23］。 血清中尿素氮含量可以反映機(jī)體生長性能以及體內(nèi)蛋白質(zhì)合成等， 尿素氮的減少標(biāo)志著氨基酸狀況良好且動物的蛋白質(zhì)合成正常。 該試驗結(jié)果表明， 添加復(fù)合乳酸菌后雖然犢牛血清中尿素氮的含量處在正常參考值范圍內(nèi)， 但有增加趨勢。 血糖濃度在有機(jī)體的組織器官中發(fā)揮著重要作用， 是生物體內(nèi)新陳代謝不可缺少的營養(yǎng)物質(zhì)，是反映有機(jī)體能量的重要標(biāo)記，同時，血糖的變化反映了機(jī)體所處的生理狀態(tài)。 楊海英等［24］報道，犢牛飼喂乳酸菌制劑對血清指標(biāo)葡萄糖含量無顯著性影響。 動物血糖濃度不應(yīng)超過6.1 mmol/L，該試驗葡萄糖在正常范圍內(nèi)，與前人結(jié)果一致。 堿性磷酸酶主要由造骨細(xì)胞產(chǎn)生［25］，其活性與動物生長速度和生長性能有關(guān)，在應(yīng)激條件下，血清堿性磷酸酶的含量也會增加，表明犢牛飼喂復(fù)合乳酸菌制劑能增強(qiáng)犢 牛 的 抗 應(yīng) 激 能 力［26］。 伍 革 民 等［27］研 究 發(fā) 現(xiàn)，增加血液中堿性磷酸酶的活性， 對動物的生長速度、日增重，細(xì)胞新陳代謝等有增強(qiáng)作用。 殷溪沙等［28］研究發(fā)現(xiàn)，血清中堿性磷酸酶的含量隨著乳酸菌素含量的增加而升高。

該研究發(fā)現(xiàn)添加復(fù)合乳酸菌制劑的犢牛血清中尿素氮、總蛋白、甘油三酯、肌酐均在正常的參考范圍內(nèi)，但是白蛋白有升高的趨勢，表明乳酸菌制劑對犢牛體內(nèi)肝臟的蛋白質(zhì)合成代謝能力與腎臟功能以及脂類代謝有積極影響。 血液中堿性磷酸酶的活性顯著增多， 表明飼喂乳酸菌制劑有利于加強(qiáng)犢牛的非特異性免疫功能及提高動物的生長性能。 血液中的總抗氧化能力為動物抗氧化狀態(tài)是否良好的依據(jù)， 超氧化物歧化酶是動物機(jī)體重要的抗氧化酶，是機(jī)體的主要抗氧化酶，其活性代表了機(jī)體的抗氧化性能， 是生物防御體系的關(guān)鍵酶之一。 抗氧化劑可作為飼料添加劑在動物生產(chǎn)過程應(yīng)用，并且可以提高動物的生長性能，部分乳酸菌可以產(chǎn)生少量過氧化氫， 過氧化氫可以抑制很多病原菌的生長，也可以形成酸性環(huán)境，從而起到殺菌的作用。該研究試驗期結(jié)束時，飼喂復(fù)合乳酸菌的犢牛的總抗氧化能力和丙二醇的活性增高，超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的含量減少，表明復(fù)合乳酸菌制劑可在一定程度上提高犢牛的抗氧化能力。

IgG 是血清中含量最高、 維持時間長的一種免疫球蛋白，參與組織間隙及體表的防御，具有中和毒素、沉淀抗原及激活補(bǔ)體等功能，尤其在體液免疫中發(fā)揮著重要的作用。 IgA 包括血清型和分泌型，血清中含量雖然相對不多，但也具有抗菌、抗病毒和抗毒素等免疫活性［29］。外周血液含有大量具有結(jié)合抗原、激活補(bǔ)體和調(diào)節(jié)作用的免疫球蛋白IgG、IgA 和IgM 等。 免疫球蛋白含量直接反映出機(jī)體對病原的免疫抗性［30］。 董佳琦等［31］就哺乳母豬添加微生態(tài)制劑進(jìn)行了研究，試驗結(jié)果表明免疫球蛋白IgG 含量升高［32］。 反芻動物添加復(fù)合益生菌可以加強(qiáng)血液中的抗體水平，對動物的體液免疫有提高作用［33］。 該試驗研究發(fā)現(xiàn)， 在犢牛飲水中添加復(fù)合乳酸菌制劑對免疫指標(biāo)IgG 影響最大，在試驗結(jié)束時試驗組IgG、IgA 含量高于對照組， 反映出犢牛的免疫能力有所提升。

4 結(jié)論

在飲水中添加復(fù)合乳酸菌制劑可以降低荷斯坦?fàn)倥５母篂a率， 減少糞便中大腸桿菌數(shù)量，增加乳酸菌數(shù)量，對犢牛胃腸道的菌群有改善功效，提高血清中葡萄糖、尿素氮、肌酐、堿性磷酸酶及免疫球蛋白的含量，對犢牛的健康免疫有積極影響。