許蒙蒙，羅 怡，王順洋，張 悅，李夢(mèng)云，霍文穎，牛麗珠，車 龍

（河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，河南 鄭州 450046）

豆粕粗蛋白含量高、氨基酸含量豐富且比例相對(duì)均衡，其中賴氨酸、色氨酸、蛋氨酸等必需氨基酸含量較高，是畜牧養(yǎng)殖業(yè)常用的植物性優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)飼料［1］，但豆粕中含有蛋白酶抑制劑、大豆抗原蛋白、大豆凝集素等抗?fàn)I養(yǎng)因子［2］，不僅不能被動(dòng)物機(jī)體利用，還會(huì)影響其消化吸收和健康水平［3］，因此， 將豆粕中大分子蛋白轉(zhuǎn)變成肽類或氨基酸等小分子物質(zhì)是提高豆粕蛋白質(zhì)利用率的關(guān)鍵。

發(fā)酵豆粕可以將豆粕中的抗?fàn)I養(yǎng)因子降解，并將豆粕中大分子蛋白降解為可溶性蛋白和小肽，產(chǎn)生大量益生菌、乳酸、寡肽等活性物質(zhì)［4］，同時(shí)益生菌發(fā)酵過(guò)程可產(chǎn)生多種有益物質(zhì)， 從而改善豆粕品質(zhì)、增加適口性、提高飼料養(yǎng)分利用率。發(fā)酵豆粕中的微生物還可以改善腸道的微生態(tài)環(huán)境，增加腸道微生物菌群多樣性，提高免疫功能［5］。飼糧中添加適量發(fā)酵豆粕能顯著提高母豬繁殖性能［6］、斷奶仔豬生長(zhǎng)性能［7］、蛋雞產(chǎn)蛋性能［8］、肉雞生長(zhǎng)性能［9］，從而提高生產(chǎn)效率。

目前，基于高料水比、單菌種條件下開(kāi)展的大量研究不斷優(yōu)化發(fā)酵豆粕的生產(chǎn)工藝， 而在低水分條件下發(fā)酵豆粕的研究相對(duì)較少。 微生物在發(fā)酵過(guò)程中可合成蛋白酶降解大分子蛋白產(chǎn)生肽類物質(zhì)， 同時(shí)發(fā)酵產(chǎn)生的有機(jī)酸和芳香味物質(zhì)對(duì)改善飼料適口性有重要意義， 單一的微生物發(fā)酵因蛋白酶產(chǎn)量不足導(dǎo)致發(fā)酵效率較低無(wú)法滿足生產(chǎn)需求［10］，因此，生產(chǎn)中多采用酶解法利用外源蛋白酶將蛋白質(zhì)降解為多肽以提高豆粕中蛋白質(zhì)的利用效率， 但有研究顯示酶解法易產(chǎn)生苦味物質(zhì)從而影響適口性［11］。 采用復(fù)合菌種協(xié)同蛋白酶進(jìn)行豆粕發(fā)酵是改善豆粕品質(zhì)、 提高生產(chǎn)效率的有效途徑。 該研究選擇枯草芽孢桿菌、酵母菌、糞腸球菌作為復(fù)合發(fā)酵菌種， 探討不同發(fā)酵水分及菌酶協(xié)同發(fā)酵對(duì)豆粕品質(zhì)的影響， 確定合適的發(fā)酵水分及蛋白酶添加量， 為發(fā)酵豆粕的生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 發(fā)酵原料

枯草芽孢桿菌（1×1011CFU/g）、糞腸球菌（1×1011CFU/g） 購(gòu)買于河南根源生物科技有限公司；酵母菌（2×1010CFU/g）購(gòu)買于安琪酵母股份有限公司。 中性蛋白酶（50 000 IU/g），購(gòu)買于山東隆科特酶制劑有限公司。豆粕、葡萄糖、稻糠、玉米由河南通洲生物科技有限公司提供。

1.1.2 主要試劑

LB 培養(yǎng)基、MSY 培養(yǎng)基、YPD 培養(yǎng)基購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，乳酸試劑盒（南京建成生物工程有限公司）、硫酸（分析純）、鹽酸（分析純）、 氫氧化鈉（分析純）、0.2%氫氧化鉀溶液、10%三氯乙酸、檸檬酸鈉溶液（0.1 mol/L）混合指示劑（甲基紅乙醇溶液和溴甲酚綠乙醇溶液等體積混合）、硼酸吸收液（20%）、凱氏定氮催化劑片、茚三酮溶液。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

立式壓力蒸汽滅菌鍋（YM100LII，上海三申醫(yī)療器械有限公司）、雙人超凈工作臺(tái)（SW-CJ-2，蘇州凈化設(shè)備有限公司）、 電熱恒溫培養(yǎng)箱 （dhp-9052，上海捷呈試驗(yàn)儀器有限公司）、全自動(dòng)凱氏定氮儀（K9860，山東海能科學(xué)儀器有限公司）、臺(tái)式pH 測(cè)定儀（PB-10，德國(guó)sartorius）、石墨消解儀（SH420F，山東海能科學(xué)儀器有限公司）、紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)（UV-1100，賽默飛世爾科技）、綜合型超純水機(jī)（Master-S15，上海和泰儀器有限公司）、超聲波振蕩器（KQ-500DB，昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活力鑒定

菌種于液體培養(yǎng)基置于37 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)30 min 使其復(fù)蘇，在無(wú)菌操作臺(tái)中倍比稀釋，選擇10-8、10-9、10-10梯度稀釋液，將枯草芽孢桿菌、糞腸球菌、 酵母菌分別涂布在已滅菌的LB 培養(yǎng)基、MSY 培養(yǎng)基、YPD 培養(yǎng)基上， 涂布完成后于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，計(jì)數(shù)并計(jì)算各菌種活力。

1.2.2 豆粕發(fā)酵方法

首先， 采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)分別設(shè)置5 個(gè)不同水分處理組，料水比分別為1∶0.4、1∶0.5、1∶0.6、1 ∶0.7、1 ∶0.8， 發(fā) 酵 料 水 分 含 量 計(jì) 算 值 分 別 為28.6%、33.3%、37.5%、41.2%、44.4%，每個(gè)處理組3個(gè)重復(fù)；其中每個(gè)處理組菌種按枯草芽孢桿菌∶糞腸球菌∶酵母菌=1∶1∶1 的方式添加， 每種菌接種量為5.0×107CFU/g，發(fā)酵底物為95%豆粕+2%稻糠+2%玉米粉+1%葡萄糖。37 ℃恒溫發(fā)酵72 h 后收集發(fā)酵豆粕樣品，保存待測(cè)。 其次，根據(jù)上述方法確定最適料水比，采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，分別設(shè)置5個(gè)不同蛋白酶添加量處理組， 添加量分別為0、100、200、400、800 IU/g， 每個(gè)處理組設(shè)3 個(gè)重復(fù)，菌種添加方式同上，37 ℃恒溫發(fā)酵72 h 后收集發(fā)酵豆粕樣品，保存待測(cè)。

1.2.3 樣品采集

發(fā)酵過(guò)程中每隔24 h 觀察發(fā)酵袋發(fā)酵產(chǎn)氣情況，取發(fā)酵0、72 h 鮮樣約100 g，取樣前搖晃混勻，使所取的樣品均勻分布，取15 g 鮮樣分別測(cè)定水分、pH 值并平板涂布檢測(cè)菌的數(shù)量， 剩余鮮樣65 ℃烘干粉碎后留存待測(cè)。

1.2.4 測(cè)定指標(biāo)及方法

水分測(cè)定：參照中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《飼料中水分測(cè)定方法》（GB/T 6435—2014）。 活菌數(shù)量測(cè)定： 將10 g 樣品與90 mL 無(wú)菌水混合置于搖床上200 r/min 搖動(dòng)20 min 制備成菌懸液，倍比稀釋后用平板涂布法接種于已滅菌的YPD、MRS、LB 培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h 后計(jì)算菌的存活量。 YPD 培養(yǎng)基：培養(yǎng)基中加入青霉素、鏈霉素各50 μg/mL，用于真菌（酵母菌）的培養(yǎng)；MRS 培養(yǎng)基：選擇性培養(yǎng)乳酸菌（糞腸球菌）；LB 培養(yǎng)基：用于枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)， 根據(jù)菌落形態(tài)計(jì)數(shù)枯草芽孢桿菌數(shù)量；培養(yǎng)基的制備參考張亞輝［12］報(bào)道的方法。 pH 值測(cè)定：稱取5.0 g 鮮樣置于燒杯中加入10 mL 蒸餾水， 用玻璃棒攪拌均勻后放置于超聲波振蕩儀處理30 min 后利用臺(tái)式pH 儀測(cè)定pH 值。 乳酸測(cè)定：使用乳酸測(cè)定試劑盒測(cè)定乳酸含量，并用朗伯比爾定律計(jì)算各樣品中乳酸含量。粗蛋白測(cè)定：按照中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《飼料中粗蛋白的測(cè)定》（GB/T 6432—2018）方法進(jìn)行測(cè)定。樣品蛋白質(zhì)濃度及蛋白質(zhì)亞基分布測(cè)定：取烘干粉碎后的樣品0.1 g， 加入2 mL 蛋白質(zhì)裂解液，用漩渦儀振蕩1 h，2 000 r/min 離心10 min， 取上清液于干凈EP 管中備用。 使用BCA 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒（購(gòu)買于碧云天生物科技有限公司）測(cè)定總蛋白濃度后制備電泳樣品。 配制濃縮膠和10%的分離膠，上樣20 μL，在電泳槽中進(jìn)行SDSPAGE 凝膠電泳（70 V 電泳30 min，110 V 電泳1 h），使用考馬斯亮藍(lán)快速染色液（購(gòu)買于碧云天生物科技有限公司）染色并用脫色液脫色，觀察并統(tǒng)計(jì)蛋白質(zhì)分布情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

使用Excel 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理后，使用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析， 用Tukey 法進(jìn)行多重比較， 試驗(yàn)結(jié)果用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤” 表示，P>0.05 表示差異不顯著，P<0.05 表示差異顯著，P<0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵水分對(duì)豆粕表觀及營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)的影響

從圖1 中可知，隨著發(fā)酵水分的增加，發(fā)酵豆粕顏色逐漸變深、水溶液渾濁度逐漸增加。 如表1所示，豆粕發(fā)酵后pH 值隨著發(fā)酵水分的增加而極顯著（P<0.01）降低；乳酸含量隨著水分的增加極顯著（P<0.01）提升，其中1∶0.6、1∶0.7 和1∶0.8 組乳酸含量極顯著（P<0.01）高于1∶0.4 和1∶0.5 組；發(fā)酵后的粗蛋白含量比發(fā)酵前有所增加， 但各處理組間差異不顯著 （P>0.05）， 其中料水比為1∶0.6組粗蛋白含量最高，達(dá)到47.17%，較發(fā)酵前提高了9.39%。

表1 不同發(fā)酵水分對(duì)豆粕營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)的影響 單位：%

圖1 不同發(fā)酵水分條件下豆粕的顏色

2.2 不同發(fā)酵水分對(duì)豆粕菌含量的影響

由表2 可知， 發(fā)酵豆粕中枯草芽孢桿菌、酵母菌、糞腸球菌存活量隨著發(fā)酵水分增加而極顯著（P<0.01）提升，料水比為1∶0.4 和1∶0.5 組3 種菌的存活量極顯著（P<0.01）低于其他組；料水比為1∶0.8 組中3 種菌的存活量顯著（P<0.01）高于其他4 個(gè)處理組，存活總量達(dá)到1.43×109CFU/g。結(jié)合上述試驗(yàn)結(jié)果并考慮工業(yè)化生產(chǎn)條件，選擇料水比為1∶0.6 作為最適發(fā)酵水分開(kāi)展后續(xù)試驗(yàn)。

表2 不同發(fā)酵水分對(duì)豆粕菌含量的影響 單位：×107 CFU/g

2.3 不同蛋白酶添加量對(duì)發(fā)酵豆粕表觀及營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)的影響

如圖2 所示，隨著蛋白酶添加量的增加，發(fā)酵豆粕顏色逐漸變深、水溶液渾濁度逐漸增加。由表3 可知， 各處理組間發(fā)酵72 h 后水分變化無(wú)顯著（P>0.05）差異；與不同料水比發(fā)酵試驗(yàn)相似，粗蛋白含量在蛋白酶添加后有所提高， 但不同組間無(wú)顯著（P>0.05）差異；與未添加蛋白酶組相比，添加蛋白酶組發(fā)酵豆粕的pH 值顯著（P<0.05）增加；同時(shí)，隨著蛋白酶添加量的增加，乳酸含量呈現(xiàn)降低趨勢(shì)， 表明蛋白酶的添加對(duì)豆粕發(fā)酵產(chǎn)酸能力有抑制作用。

圖2 不同蛋白酶添加量對(duì)發(fā)酵豆粕顏色的影響

表3 不同蛋白酶添加量對(duì)發(fā)酵豆粕營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)的影響 單位：%

2.4 不同蛋白酶添加量對(duì)發(fā)酵豆粕菌含量的影響

由表4 可知，3 種菌的存活量隨著蛋白酶添加量的增加而降低，0 IU/g 和100 IU/g 處理組中的枯草芽孢桿菌和糞腸球菌的存活量極顯著 （P<0.01）高于其他3 個(gè)處理組，但2 組存活量無(wú)顯著（P>0.05）差異。 酵母菌的存活量在蛋白酶添加量為100 IU/g 和200 IU/g 處理組極顯著（P<0.01）高于0、400、800 IU/g 處理組。

表4 不同蛋白酶添加量對(duì)發(fā)酵豆粕菌含量的影響 單位：×107 CFU/g

2.5 不同蛋白酶添加量對(duì)發(fā)酵豆粕蛋白質(zhì)亞基分布的影響

由圖3 可知，隨著蛋白酶添加量的增加，大分子蛋白會(huì)被降解成小分子蛋白和小肽。 與益生菌發(fā)酵組相比， 不同劑量的蛋白酶與益生菌協(xié)同發(fā)酵組的豆粕中大分子蛋白被顯著降解，16～30 kDa的條帶顏色隨蛋白酶添加量的增加而加深。 由表5 可知，與未發(fā)酵的豆粕相比，豆粕在菌酶協(xié)同發(fā)酵后，30 kDa 范圍內(nèi)的小分子蛋白顯著增加，并隨著蛋白酶添加量的增加而增加。 100 IU/g 蛋白酶添加組30 kDa 范圍內(nèi)的小分子蛋白達(dá)到46.06%，是未添加蛋白酶組的1.83 倍；800 IU/g 蛋白酶添加組30 kDa 范圍內(nèi)的小分子蛋白達(dá)到65.56%，是未添加蛋白酶組的2.61 倍。

表5 不同蛋白酶添加量對(duì)發(fā)酵豆粕蛋白亞基分布的影響 單位：%

圖3 不同蛋白酶添加量發(fā)酵豆粕蛋白SDS-PAGE 電泳圖

3 討論

3.1 發(fā)酵水分對(duì)豆粕品質(zhì)的影響

豆粕發(fā)酵過(guò)程中， 益生菌會(huì)代謝底物中的碳水化合物等養(yǎng)分， 合成菌體蛋白和蛋白酶等活性物質(zhì)，使發(fā)酵后的粗蛋白含量相對(duì)增加，但該研究發(fā)現(xiàn)不同料水比發(fā)酵組粗蛋白含量無(wú)顯著差異，這與吝常華等［13］研究料水比對(duì)豆粕發(fā)酵的影響結(jié)果相似。料水比為1∶0.6 的處理組中粗蛋白含量最高，達(dá)到47.17%，粗蛋白含量增加了9.39%，但隨著料水比的增加，粗蛋白含量無(wú)顯著差異，可能是。因?yàn)槲⑸锩芏扰c活性變化所導(dǎo)致。 發(fā)酵起始基質(zhì)含水量高，容易導(dǎo)致基質(zhì)多孔性降低，減少基質(zhì)內(nèi)氣體，同時(shí)增加營(yíng)養(yǎng)成分和菌體的流動(dòng)性，因此菌的活性和發(fā)酵效率提高；而含水量低，造成基質(zhì)膨脹程度低，菌體生長(zhǎng)受抑制，酶產(chǎn)量下降，從而影響微生物的生長(zhǎng)［14］。由該試驗(yàn)結(jié)果可知，隨著料水比的增加， 發(fā)酵豆粕中益生菌的存活量呈增加趨勢(shì)，料水比為1∶0.8 處理組中復(fù)合菌存活總量達(dá)到1.43×109CFU/g，這與李龍［15］研究復(fù)合益生菌發(fā)酵飼料的結(jié)果相似， 其含水量為50%的發(fā)酵飼料菌總數(shù)較含水量為30%、40%組顯著提高，但密度和活性的增加導(dǎo)致微生物代謝加快， 增加了對(duì)基質(zhì)中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗量， 從而導(dǎo)致該試驗(yàn)中高料水比組粗蛋白水平有所降低。pH 值和有機(jī)酸含量是衡量發(fā)酵豆粕品質(zhì)的重要指標(biāo)，飼糧pH 值降低可提升飼糧適口性和消化率， 同時(shí)飼糧中酸性物質(zhì)

刺激唾液和酶的分泌，增加動(dòng)物食欲［16］。該試驗(yàn)中隨著料水比的增加乳酸的產(chǎn)生量顯著提升，pH 值顯著降低，對(duì)改善飼糧品質(zhì)有重要意義，但過(guò)高的水分將極大增加烘干所需成本。綜上所述，該試驗(yàn)選擇料水比為1∶0.6 進(jìn)行菌酶協(xié)同發(fā)酵試驗(yàn)。

3.2 菌酶協(xié)同發(fā)酵對(duì)豆粕品質(zhì)的影響

利用復(fù)合益生菌發(fā)酵豆粕時(shí)， 外源添加蛋白酶有效降低大豆球蛋白含量， 同時(shí)抑制有害菌的增殖提高豆粕營(yíng)養(yǎng)價(jià)值［17］。該研究結(jié)果顯示，在選定適宜發(fā)酵水分的基礎(chǔ)上， 添加不同量的蛋白酶進(jìn)行菌酶協(xié)同發(fā)酵， 發(fā)酵后豆粕的顏色加深呈現(xiàn)深棕色， 且隨著蛋白酶添加量的增加水溶液的渾濁程度加深， 表明蛋白酶的添加對(duì)豆粕中小肽的產(chǎn)生有顯著促進(jìn)作用， 與SDS-PAGE 膠電泳分離蛋白結(jié)果一致， 電泳條帶顯示蛋白酶添加組小分子蛋白（<30 kDa）含量隨酶的添加量增加而顯著增加，大分子蛋白（>66 kDa）含量顯著降低，表明酶促水解可以加快大豆發(fā)酵過(guò)程中蛋白質(zhì)的降解，從而提高肽的產(chǎn)量［18］。 張亞輝［12］的研究報(bào)道顯示，發(fā)酵后的大分子蛋白明顯降低，主要集中在<26 kDa 的范圍內(nèi)，是總蛋白的75.25%。在該試驗(yàn)中，隨著蛋白酶添加量的增加，豆粕粗蛋白水平無(wú)顯著差異，但大分子蛋白被酶不同程度地降解，大部分小分子蛋白落在<30 kDa 范圍內(nèi)。當(dāng)?shù)鞍酌柑砑恿繛?00 IU/g 時(shí)，<30 kDa 范圍內(nèi)的小分子蛋白達(dá)到65.56%，是未發(fā)酵豆粕的4.24 倍，是未添加蛋白酶組的2.61 倍，這與前人菌酶協(xié)同發(fā)酵豆粕工藝的優(yōu)化研究結(jié)果相似， 菌酶協(xié)同發(fā)酵時(shí)中性蛋白酶添加量為1 250 IU/g 時(shí)，<31 kDa 的蛋白顯著增多，是未發(fā)酵豆粕的2.23 倍［19］。 綜上所述，菌酶協(xié)同發(fā)酵可有效降解豆粕中的大分子蛋白，改善豆粕的品質(zhì)，且發(fā)酵效果優(yōu)于未添加蛋白酶組。

該試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著蛋白酶添加量的增加，乳酸的含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)， 這與前人在菌酶協(xié)同發(fā)酵豆粕試驗(yàn)中乳酸含量變化結(jié)果不一致［20］，可能由于蛋白酶的添加促進(jìn)蛋白質(zhì)的分解產(chǎn)生胺類物質(zhì)或氨氣使得產(chǎn)物pH 值升高，中和了部分乳酸所致。同時(shí)，菌的存活量隨著蛋白酶添加量的增加而降低， 蛋白酶添加量為800 IU/g 的處理組中的存活總量為4.35×108CFU/g， 顯著低于對(duì)照組（1.34×109CFU/g） 及100 IU/g 的 蛋 白 酶 添 加 組（1.71×109CFU/g），同時(shí)100 IU/g 組枯草芽孢桿菌和糞腸球菌存活量均高于其他處理組， 表明高劑量蛋白酶的添加對(duì)菌的存活有抑制作用。 蛋白酶添加降低乳酸含量和菌的活力， 可能與菌酶之間產(chǎn)生拮抗有關(guān)［21］，因?yàn)榭莶菅挎邨U菌和糞腸球菌代謝將會(huì)產(chǎn)生一定量的蛋白酶， 蛋白酶累積過(guò)多將會(huì)負(fù)反饋抑制枯草芽孢桿菌、糞腸球菌的活力，使菌的存活量減少，導(dǎo)致pH 值及乳酸含量都出現(xiàn)不同程度的變化。

4 結(jié)論

結(jié)合該試驗(yàn)結(jié)果并考慮工業(yè)化生產(chǎn)條件和成本，料水比為1∶0.6（水分含量：37.5%）條件下添加100 IU/g 的中性蛋白酶進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵可有效改善豆粕品質(zhì)。