原磊 ，路曉

（1. 山東省萊州市金城畜牧獸醫(yī)站，山東 煙臺 261441；2.山東省農(nóng)業(yè)科學院家禽研究所 山東省家禽疫病診斷與免疫重點實驗室，山東 濟南 250100；3.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000）

新型鴨呼腸孤病毒主要引起雛鴨發(fā)病死亡，成年鴨感染不表現(xiàn)癥狀，但能垂直傳播，引起后代雛鴨發(fā)病。該病2005年前后在我國南方省份的鴨群中開始出現(xiàn)，后來蔓延至山東、江蘇、河南、河北等北方養(yǎng)鴨集中區(qū)。目前該病在我國已成為常見病、多發(fā)病。發(fā)病日齡一般以7～14日齡居多，發(fā)病率5%～20%，死亡率1%～10%，一般發(fā)病鴨日齡愈小，發(fā)病率和死亡率愈高。該病毒能引起患鴨脾臟壞死、法氏囊損傷，導致免疫抑制，極易繼發(fā)細菌感染，且很難治療，從而造成更高的死亡率，給我國的養(yǎng)鴨業(yè)造成了很大的經(jīng)濟損失[1-4]。

本研究于2022年從山東濰坊地區(qū)9日齡發(fā)病的麻鴨中分離到一株病毒，鑒定為新型鴨呼腸孤病毒，通過回歸試驗確定該病毒為致病病原。

1 材料與方法

1.1 病料來源

山東省濰坊地區(qū)一家較大規(guī)模的麻鴨養(yǎng)殖場，部分9日齡雛鴨前期出現(xiàn)采食下降，精神不振，消瘦，后期趴窩不起，死亡。剖檢死亡雛鴨發(fā)現(xiàn)，脾臟壞死，其它內(nèi)臟器官無明顯病變，故取病變脾臟用于病原分離。

1.2 材料和試劑

櫻桃谷鴨胚和雛鴨購自山東濰坊某種鴨場。

DNA/RNA提取試劑盒、凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量抽提試劑盒購自AXYGEN公司；一步法RT-PCR試劑盒、PCR Mix、pMD18-T載體、受感態(tài)細胞DH5ɑ購自北京全式金公司。

1.3 細菌分離

在無菌條件下，用接種環(huán)從脾臟病料中接種細菌于含3%小牛血清的營養(yǎng)瓊脂，分別在需氧和厭氧條件下培養(yǎng)48 h，觀察有無細菌生長。

1.4 病毒分離

取病變脾臟，加入5倍體積生理鹽水和終濃度500 U/mL的雙抗，用無菌手術剪剪碎后充分研磨，然后反復凍融3次，6 000 r/min離心20 min，取上清用0.22 μm濾器過濾除菌，接種10日齡鴨胚，0.2 mL/枚，共5枚。收集接種24 h后死亡的鴨胚，并觀察死胚的病變情況。利用鴨胚繼續(xù)傳3代后，標記為WF22，-30 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 病毒鑒定

1.5.1 RT-PCR鑒定 參照NCBI中發(fā)表的新型鴨呼腸孤病毒S3基因序列設計一對引物。引物序列為：上游引物 P1：5' TAGAGCGGGTTGGAAGATGA 3'；下游引物 P2：5' CCACGCTCAAATTGACCAG 3'，預期擴增片段大小為315 bp，引物由北京擎科生物科技有限公司（青島）合成。按照DNA/RNA提取試劑盒說明提取病毒核酸，利用上述引物進行RT-PCR擴增。同時進行番鴨呼腸孤病毒（MDRV）、1 型鴨甲肝病毒（DHAV-1）、3 型鴨甲肝病毒（DHAV-3）、鴨瘟病毒（DPV）、鴨坦布蘇病毒（TMUV）、鴨星狀病毒（DASTV）、鴨新型細小病毒（NDPV）、鴨圓環(huán)病毒（DCV）等其它常見鴨病毒病核酸檢測。

1.5.2 對鴨胚的致病性 將分離毒作10倍系列稀釋，取 10-3、10-4、10-5、10-6、10-7五個稀釋度經(jīng)尿囊腔途徑分別接種10日齡鴨胚，0.1 mL/胚，37 ℃繼續(xù)孵育，每天觀察兩次，直至第7天，記錄鴨胚死亡情況，并觀察死胚的病變。按Reed-Muench法計算病毒的半數(shù)致死量（ELD50）。

1.6 雛鴨回歸試驗

將WF22株第3代鴨胚毒經(jīng)腿部肌肉接種5日齡雛鴨，0.2 mL/只，共10只；同時用生理鹽水接種5只相同雛鴨作為對照。每天觀察試驗鴨的癥狀，直至第7天。死亡試驗鴨進行剖檢，未死亡鴨第7天剖殺后，觀察內(nèi)臟病變。采集病變明顯的脾臟組織，按1：5的比例加入生理鹽水，勻漿后凍融兩次，然后離心、過濾，經(jīng)尿囊腔接種10日齡鴨胚，觀察死亡鴨胚的病變情況，并收集死亡鴨胚的尿囊液，進行新型鴨呼腸孤病毒核酸檢測。

1.7 σC 基因測序與進化分析

參考GenBank登錄的新型鴨呼腸孤病毒S1基因序列（KJ879930），設計1對引物（P3/P4），引物序列如下：P3：5' CGAGTATCTTTGT ACGCTACGC 3'；P4：5' TCATCGCGCGCCACAG C 3'，預期片段大小為1 020 bp，引物由北京擎科生物科技有限公司（青島）合成。提取WF22株第3代鴨胚毒的RNA進行擴增，取5 μL反應產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖中電泳進行檢驗。按照DNA凝膠回收試劑盒說明回收PCR產(chǎn)物，與pMD18-T載體連接后，轉(zhuǎn)化DH5ɑ。挑單菌落擴大培養(yǎng)并提取質(zhì)粒進行PCR鑒定，鑒定為陽性的菌落送北京擎科生物科技有限公司（青島）進行測序。利用MEGA軟件，將WF22株的σC基因與GenBank登錄的禽呼腸孤病毒基因序列進行比對分析，并繪制進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌分離

從壞死的脾臟中未分離到細菌。

2.2 病毒分離鑒定

2.2.1 病毒分離 將臨床采集的脾臟組織處理后經(jīng)尿囊腔接種10日齡鴨胚，60 h后鴨胚開始出現(xiàn)死亡，死亡鴨胚全身廣泛性出血、肝壞死（圖1）。

圖1 WF22接種鴨胚出血情況

2.2.2 病毒核酸檢測 提取分離毒株的DNA和RNA，利用PCR或RT-PCR方法對新型鴨呼腸孤病毒等9種常見鴨病病原進行核酸檢測，發(fā)現(xiàn)只有新型鴨呼腸孤病毒為陽性，其它均為陰性（圖2）。

圖2 病毒核酸檢測電泳圖

2.2.3 對鴨胚的致病性 將WF22第3代鴨胚毒接種10日齡櫻桃谷鴨胚，結(jié)果顯示，其毒價為106.00ELD50/0.1 mL。

2.3 雛鴨回歸試驗

將WF22第3代鴨胚毒注射5日齡雛鴨，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，攻毒后第3天部分試驗鴨開始出現(xiàn)精神不振，采食量和飲水量下降等癥狀，第6天發(fā)病鴨恢復正常，至第7天無試驗鴨死亡。剖檢發(fā)現(xiàn)，試驗鴨均出現(xiàn)脾臟壞死的典型病變（圖3）。將試驗鴨的壞死脾臟處理后接種10日齡鴨胚，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，接種后3～6 d內(nèi)鴨胚死亡，死亡鴨胚通體出血，經(jīng)RT-PCR檢測，新型鴨呼腸孤病毒核酸為陽性。

圖3 WF22攻毒后脾臟壞死

2.4 σC基因測序與分析

利用設計的引物對WF22株的σC基因進行擴增、克隆、測序，并利用MEGA軟件繪制進化樹。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其σC基因大小為966 bp，與新型鴨呼腸孤病毒基因序列的進化關系較近，同源性在93.6%~99.7%之間，而與番鴨呼腸孤病毒（MDRV）和雞呼腸孤病毒（CRV）進化關系較遠（圖4）。

圖4 WF22株σC基因遺傳進化分析（黑色三角形表示重點突出本分離株）

3 討論

目前，我國水禽呼腸孤病毒感染日益嚴重，宿主范圍不斷擴大，臨床病變趨于復雜，嚴重危害著我國水禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。水禽呼腸孤病毒病主要分為番鴨呼腸孤病毒病和新型鴨呼腸孤病毒病兩種。由番鴨呼腸孤病毒引起的番鴨或鵝“白點病”，主要表現(xiàn)肝臟有白色或黃白色壞死點，該病毒僅引起番鴨和鵝發(fā)病，對其它品種的水禽不發(fā)病。由新型鴨呼腸孤病毒引起的鴨鵝“脾壞死病”，主要表現(xiàn)脾臟壞死，該病毒宿主廣泛，可感染櫻桃谷鴨、麻鴨、番鴨、半番鴨、野鴨、鵝等多個水禽品種。這兩種呼腸孤病毒無論從流行病學、臨床癥狀和病理變化，還是從基因序列和血清學等方面均表現(xiàn)出較大的差異[5-8]。

自新型鴨呼腸孤病毒病在山東地區(qū)流行以來，主要發(fā)生在櫻桃谷鴨上，其它品種的鴨較為少見。本研究從山東濰坊地區(qū)臨床發(fā)病的麻鴨中分離到一株新型鴨呼腸孤病毒，該病毒在鴨胚上生長良好，引起胚體出血、胚肝壞死等病變；雛鴨攻毒試驗完全能回歸出臨床癥狀與病變；基于σC基因的進化樹分析發(fā)現(xiàn)，本研究分離到的麻鴨源新型鴨呼腸孤病毒與櫻桃谷鴨、綠頭鴨、鵝等來源的毒株無明顯差異，同源性在93.6%~99.7%之間，這說明不同品種水禽來源的新型呼腸孤病毒在主要抗原基因上基本一致。