王奕農(nóng)，蔡尚烜，楊童焜，馮小寧，尉遲瀟涵，韓一唯，孫夢陽，吳靖芳

(河北北方學院形態(tài)學實驗室，河北北方學院,河北 張家口 075000)

三葉因子3(trefoil factor 3，TFF3)首先發(fā)現(xiàn)于大鼠空腸黏膜，存在于哺乳動物的多種組織細胞，常由黏液上皮細胞合成并與粘蛋白結合一起分泌[1]。TFF3具有促進黏膜上皮生長與修復、調(diào)控信號轉(zhuǎn)導、促進血管生成、維持腦組織發(fā)育等作用[2]。頜下腺作為大唾液腺之一，其分泌物占唾液組分的70%，在維持口腔濕潤、殺菌、初步消化食物等方面具有重要意義。人體頜下腺和小唾液腺是口腔TFF3的主要來源[3]。唾液中的TFF3有助于保護口腔黏膜[4-5]。牙齦炎和牙周炎患者唾液中TFF3濃度顯著低于健康人群，牙齦蛋白酶對TFF的水解作用可能是導致慢性牙周炎患者唾液TFF減少的原因[6-7]。牙周炎局部和全身的TFF1和TFF3水平升高并參與牙周組織破壞期的宿主反應，TFF3水平或可用于指導重度牙周炎患者治療策略選擇[8-9]。嚙齒類動物頜下腺能夠分泌多種生物活性物質(zhì)，大鼠頜下腺導管細胞中有TFF3表達[10]，但未見小鼠頜下腺生后發(fā)育及TFF3研究的報道。本實驗旨在通過觀察小鼠頜下腺生后發(fā)育的形態(tài)學變化及TFF3在頜下腺的表達情況，探討其在小鼠頜下腺中的作用。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑

隨機選取性成熟的KM小鼠(北京維通利華實驗動物技術有限公司)，雄性4只，雌性16只。器械：解剖剪、眼科剪、組織鑷、ependoff微量移液器、Leica2235石蠟切片機、北京六一電泳相關設備、Tanon5200凝膠成像系統(tǒng)等。

試劑：硫酸鉻鉀、明膠、蘇木精染液、伊紅染液、過碘酸、Schiff試劑、兔TFF3抗體(武漢博士德生物科技有限公司)、免疫組化ABC試劑盒、預染蛋白Marker、羊抗兔IgG、ECL顯色發(fā)光試劑盒(博奧森生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 取材：取健康小鼠，按照雌雄2∶1于晚18:00進行合籠飼養(yǎng)，次日早7:00點檢查雌性小鼠陰栓，見陰栓之日起為妊娠(gestation day，GD)0 d，并將妊娠母鼠取出，隔離飼養(yǎng)。所有小鼠飼養(yǎng)環(huán)境相同，空氣流通、食物充足，墊料清潔。密切觀察妊娠19 d以上母鼠的生產(chǎn)情況，生后仔鼠記為生后(puerperal，P)1d。選擇P1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31的仔鼠(雌雄不拘)為研究對象。頸椎脫臼法處死，剪開頸部迅速取出小鼠頜下腺，左側置于Bouin’s固定液中固定24 h以上進行石蠟切片制作，厚度5μm，裱貼于涂有鉻礬明膠的載玻片上；右側置于液氮中用于Western blot實驗。

1.2.2 HE染色：石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化至自來水，蘇木精復染細胞核10 min，鹽酸酒精分化，溫水返藍。伊紅染液染細胞質(zhì)，蒸餾水沖洗，梯度酒精脫水、二甲苯透明，中性樹脂封片。

1.2.3 PAS染色：石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化，將過碘酸滴于玻片，使之完全覆蓋組織，室溫氧化10～15 min，自來水沖洗5 min，將玻片置于濕盒中，Schiff試劑避光染色20 min，自來水沖洗約5 min，鏡檢，蘇木精染液染細胞核10 min，蒸餾水清洗，溫箱烘干，二甲苯透明，中性樹脂封片。

1.2.4 免疫組化：石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，0.01M的PBS緩沖液洗滌5 min；pH6.0的枸櫞酸修復液進行抗原修復；3% H2O2浸潤組織20 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶；滴加TFF3(效價1∶100)4 ℃過夜；II抗、III抗37 ℃各孵育30 min(I抗、II抗、III抗孵育結束后，均以0.01M PBS緩沖液清洗5 min×3次)，繼而DAB顯色，蘇木精復染細胞核，常規(guī)脫水、透明、封片。

1.2.5 Western blot：①蛋白質(zhì)提取試劑盒提取不同發(fā)育階段小鼠頜下腺組織總蛋白；②根據(jù)BCA試劑盒說明測定蛋白濃度；③SDS-PAGE電泳：配制12%的分離膠、5%的濃縮膠，上樣30 μg蛋白；④轉(zhuǎn)膜：電泳完畢后取出凝膠，根據(jù)Maker分子量標準裁下相應位置的凝膠；PVDF膜用甲醇浸泡數(shù)秒,在轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡5 min；按照負極→海綿→3層濾紙→凝膠→PVDF膜→3層濾紙→海綿→正極的順序放置，恒壓70 V轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜1 h后取出膜；封閉液(含5%脫脂奶粉的PBST溶液)室溫封閉1 h；TFF3(1∶1 000)4 ℃搖床孵育過夜；PBST洗膜5 min×3次；PBST溶液按1∶5 000稀釋II抗，孵育1 h；PBST洗膜5 min×3次；膜蛋白面滴加ECL發(fā)光液，天能5200化學發(fā)光成像儀成像。目的蛋白與內(nèi)參照β-actin灰度值比值作為蛋白的相對含量。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結 果

2.1 HE染色結果

小鼠頜下腺是以漿液腺泡為主的混合腺，導管包括閏管、顆粒曲管(granular convoluted tubule，GCT)、紋狀管和小葉間導管。生后1 d日齡小鼠頜下腺細胞分裂增殖較為活躍，光鏡可見處于有絲分裂期的細胞(圖1A)，腺泡細胞和導管細胞結構和著色差別小，排列方式也較為接近。7 d腺泡細胞排列緊密，分裂象明顯減少，胞核染色加深，靠近基底面，與導管細胞有較為明顯的形態(tài)差別。導管細胞胞漿嗜酸性略強于腺泡細胞，導管細胞核仁明顯，代謝活躍(圖1B)。15 d腺泡細胞可區(qū)分胞核圓形的、基底部胞漿嗜堿性的漿液性腺泡和胞核呈扁圓形、胞質(zhì)呈泡沫狀的黏液性腺泡，漿液性腺泡數(shù)量多于黏液性腺泡；導管直徑增加，細胞排列緊湊，細胞分界不清，核質(zhì)比較大，胞核位于細胞中央，胞漿呈粉紅色嗜酸性。25 d頜下腺的組織形態(tài)已基本接近成年小鼠(圖1C)，腺泡細胞趨于成熟，細胞核體積進一步縮小，染色加深。導管部可見顆粒曲管結構，細胞間分界不清，胞核位于細胞中央偏向基底部，胞漿呈嗜酸性。

2.2 PAS染色結果

小鼠頜下腺腺泡細胞PAS陽性反應，而導管細胞為弱陽性或陰性。生后1 d日齡時，通過PAS染色即可清楚辨別導管細胞呈藍色，腺泡細胞呈粉紅色(圖1D)。7 d日齡腺泡細胞呈深紅色，陽性反應增強，導管占比升高(圖1E)。15 d日齡時，腺泡細胞PAS陽性細胞增加(圖1F)。

2.3 TFF3免疫組化結果

小鼠頜下腺導管細胞胞漿自1日齡開始呈TFF3弱陽性。陽性信號位于導管上皮細胞和肌上皮細胞胞漿，腺泡細胞陰性(圖1G)。生后7 d頜下腺組織即可觀察到TFF3聚集在導管游離緣，TFF3信號中等強度，腺泡細胞呈陰性(圖1H)。15 d后小鼠下頜下腺中導管上皮細胞TFF3表達明顯增強，各級導管游離面可觀察到TFF3的陽性表達，大導管腔有TFF3陽性分泌物(圖1I)。

圖1 小鼠頜下腺生后P1、P7、P15形態(tài)學變化A～C(HE染色)、D～F(PAS染色)、G～I(IHC)400(bar=20 μm)

2.4 Western blot結果

生后1 d小鼠頜下腺組織中已表達TFF3，但含量相對較低，3～5 d組織中TFF3表達逐漸上升。7 d開始，小鼠頜下腺TFF3含量明顯增加，25 d以后頜下腺組織中TFF3保持在相對穩(wěn)定狀態(tài)，表達水平相較于小日齡有明顯提升(圖2A、2B)。

注：與1～5 d比較*P<0.05,**P<0.01。

3 討 論

本研究以生后1～31 d日齡的仔鼠頜下腺為標本，通過多種染色方法對其生后發(fā)育進行觀察。1 d日齡仔鼠頜下腺中細胞體積較小，細胞分裂象多見，提示頜下腺處于生長發(fā)育旺盛階段，PAS染色發(fā)現(xiàn)腺泡細胞內(nèi)已開始大量合成糖蛋白，而導管內(nèi)僅有少量糖蛋白存在，該時期腺泡和導管細胞胞漿的嗜色性較為接近，HE染色差別較小。7 d日齡細胞有絲分裂減少，腺泡細胞基底部胞漿嗜堿性增強，導管和腺泡在HE染色下出現(xiàn)較明顯的差別，腺泡細胞PAS陽性反應增強，合成糖蛋白增加，與1 d日齡相比，此時頜下腺中導管所占比例增加，管徑變粗。15 d左右腺泡和導管比例逐漸穩(wěn)定，漿液性腺泡和黏液性腺泡區(qū)別明顯，漿液性腺細胞基底部堿性顆粒累加，胞漿頂端嗜酸性增強，而黏液性腺細胞胞漿內(nèi)粘蛋白含量增加，胞漿著色變淺，腺泡PAS染色陽性信號增強，提示頜下腺發(fā)育日趨成熟。仔鼠一般于21 d左右斷奶，頜下腺發(fā)育成熟，在仔鼠斷奶前就開始適應固體食物，上述結構變化已為積極進食奠定了基礎。25 d日齡開始，仔鼠頜下腺功能已基本完善，鏡下觀察該時段仔鼠頜下腺HE和PAS染色切片，同成年小鼠并無明顯區(qū)別，因此至25 d仔鼠頜下腺發(fā)育基本完成。25 d小鼠頜下腺HE染色切片可以觀察到顆粒曲管的存在，其中顆粒曲管粗、長而彎曲，可分泌多種生物活性物質(zhì)，由國內(nèi)學者對小鼠頜下腺顆粒曲管上皮生長因子的免疫組化實驗可知，雄性小鼠頜下腺顆粒曲管于生后20～35 d不斷變粗，功能逐漸完善[11-12]，與本實驗結果基本一致。

本研究免疫組織化學結果顯示小鼠頜下腺組織TFF3主要表達于頜下腺導管，這與大鼠頜下腺TFF3表達部位一致[10]，而與Jagla[13]報道的人頜下腺TFF3由漿液性腺泡合成有所不同，推測可能與二者的種屬不同有關。頜下腺組織中TFF3的Western blot結果顯示生后1 d頜下腺導管細胞內(nèi)已存在13 kD左右的TFF3條帶，1～5 d頜下腺TFF3含量處于較低水平，但從7 d開始至25 d頜下腺組織內(nèi)TFF3表達水平明顯增加。國外學者通過蛋白質(zhì)液相色譜和蛋白質(zhì)組學研究發(fā)現(xiàn)人類唾液中TFF3存在高分子量和低分子量形式[14]。研究顯示TFF3通過與受體跨膜蛋白CD147、CXCR4/CXCR7結合促進細胞遷移、抑制凋亡和失巢凋亡，對黏膜有效重建至關重要[15-16]。同時有研究表明TFF3可以通過活化PI3K/Akt通路促進胃黏膜上皮細胞增殖[17]。IHC結果顯示生后7d頜下腺組織免疫組化切片中即可觀察到TFF3聚集在導管游離緣，15 d即能觀察到導管管腔內(nèi)TFF3陽性信號增強(圖I)，表明頜下腺具有外分泌TFF3的能力。有報道顯示TFF3是人類唾液的重要組成成分[14]，頜下腺導管中的TFF3可同唾液一起進入口腔和胃腸道，發(fā)揮其對口腔黏膜和消化道黏膜的保護作用[10,18]。重組人三葉因子3可通過降低二胺氧化酶活性，減輕腸道損傷，從而降低腸黏膜通透性，改善嚴重燒傷引起的強烈腸黏膜屏障損傷[19]。小鼠從21 d開始自主覓食，逐漸脫離母乳喂養(yǎng)，外分泌的TFF3可以直接作用于口腔及消化道黏膜細胞表面，促進黏膜細胞的生長和修復。

本研究對小鼠頜下腺組織的生后發(fā)育進行了初步形態(tài)學觀察，為今后深入研究奠定了基礎。