陳楓 岳霖琳 張燕萍 劉金平 劉海金 曾林山 陳俊敏

1.贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院小兒外科，江西贛州 341000；2.贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，江西贛州 341000；3.廣東省人民醫(yī)院贛州醫(yī)院（贛州市立醫(yī)院）檢驗(yàn)科，江西贛州 341000

腎母細(xì)胞瘤為兒童群體常見腎臟惡性腫瘤類型，對患兒生命健康及成長發(fā)育造成了極大影響[1]。因此，早期對腎母細(xì)胞瘤進(jìn)行準(zhǔn)確評(píng)估具有重要意義。但當(dāng)前臨床用于評(píng)估腎母細(xì)胞瘤的指標(biāo)缺乏良好的特異性及敏感性，故需尋找新的指標(biāo)對疾病進(jìn)行診斷評(píng)估[2]。隨著臨床研究深入，載脂蛋白CI 在多種疾病診療評(píng)估中的應(yīng)用價(jià)值逐漸引起關(guān)注，研究發(fā)現(xiàn)，載脂蛋白CI 可參與不同病理、生理反應(yīng)，甚至和惡性腫瘤發(fā)病及進(jìn)展具有密切關(guān)聯(lián)性[3-4]。但當(dāng)前關(guān)于載脂蛋白CI 與腎母細(xì)胞瘤疾病分期關(guān)聯(lián)性的研究較少，基于此，本研究擬選取腎母細(xì)胞瘤患兒50 例，通過設(shè)置對照組，探討上述內(nèi)容。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2010 年8 月至2022 年2 月贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院收治的腎母細(xì)胞瘤患兒50 例設(shè)為研究組，另選取門診體檢健康兒童20 名設(shè)為對照組。研究組中，男27 例，女23 例；年齡3～10歲，平均（6.23±3.11）歲；疾病分期（COG 分期）：Ⅰ期10例，Ⅱ期10 例，Ⅲ期10 例，Ⅳ期10 例，Ⅴ期10 例。對照組中，男11 名，女9 名；年齡2～10 歲，平均（6.05±3.24）歲。兩組患兒的一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。納入標(biāo)準(zhǔn)：①研究組均經(jīng)病理檢查確診；②研究組既往未采取放化療治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①存在其他良惡性腫瘤者；②存在血液系統(tǒng)、代謝系統(tǒng)及自身免疫系統(tǒng)疾病者；③存在全身性感染性疾病者；④存在精神系統(tǒng)疾病者。患兒家屬知曉本研究，簽署同意書，且本研究經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批通過（倫理審批號(hào)：LLSC-2022041801）。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 兩組均在晨起時(shí)空腹采集外周靜脈血置于血清分離管中，4℃條件下過夜，離心處理（1000×g，15 min），分別置于不同EP 管，置于-80℃環(huán)境保存；研究組瘤體標(biāo)本均為手術(shù)切除或穿刺活檢的新鮮標(biāo)本，分裝至不同凍存管，液氮速凍處理，置于-80℃環(huán)境或液氮罐儲(chǔ)存，經(jīng)甲醛固定標(biāo)本，石蠟包埋。

1.2.2 血清載脂蛋白CI 檢測①樣本準(zhǔn)備：血清樣本取出后置于4℃環(huán)境溶解，4℃離心（1000×g，10 min），取10 μl 稀釋，加入PBS（490 μl），終體積500 μl；反復(fù)顛倒混勻，充分稀釋；取稀釋液（10 μl）加入PBS（390 μl），終體積400 μl，置于4℃環(huán)境儲(chǔ)存。②試劑準(zhǔn)備：將試劑包括前期稀釋后血清樣本緩慢升至室溫；首先實(shí)施標(biāo)準(zhǔn)品稀釋，取1 ml 稀釋液加入標(biāo)準(zhǔn)品內(nèi)，室溫靜置10 min，輕輕搖晃混勻，避免起泡；依據(jù)說明書稀釋，隨后依次成倍稀釋標(biāo)本品，獲取不同濃度樣本，以0 ng/ml 作空白孔；A、B 檢測液快速離心，按1∶100 將對應(yīng)稀釋液配為工作液。③實(shí)驗(yàn)步驟：設(shè)立空白孔、血清樣本孔、標(biāo)準(zhǔn)孔共3 大組；將8 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品加入板孔，100 μl/孔；空白孔加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液100 μl，其余各孔加入100 μl 血清樣本，孔板蓋上覆膜，37℃條件下孵育60 min；廢液去除、甩干，各孔加入100 μl 檢測溶液A 工作液，繼續(xù)孵育60 min；廢液去除，各孔加入洗滌液350 μl，室溫孵育1 min，甩干，重復(fù)洗板3 次，末次將孔板扣于濾紙，吸干孔內(nèi)殘留液體；各孔加入100 μl 檢測溶液B 工作液，37℃環(huán)境下孵育0.5 h；孔內(nèi)廢液去除，甩干，洗板5 次，步驟同上；各孔加入90 μl TMB 底物溶液，37℃環(huán)境下15 min 避光顯色，各孔加入終止液50 μl，輕敲孔板混勻；檢測孔無氣泡，孔板底無水滴，于酶標(biāo)儀450 nm 波長下測定各孔OD 值。

1.2.3 瘤體組織載脂蛋白CI 檢測（免疫組化SP 法）取腫瘤組織新鮮樣本，經(jīng)中性甲醛（10%）固定，石蠟包埋，常規(guī)切片；置于烤箱于60℃條件下孵育60 min，避免脫片；經(jīng)酒精、二甲苯脫蠟，PBS 洗滌5 min/次，共3 次；檸檬酸鹽緩沖液抗原修復(fù)15 min，降至室溫，經(jīng)PBS 浸泡5 min/次，共3 次；室溫下經(jīng)H2O2（3%）孵育20 min，內(nèi)源性過氧化物酶封閉，PBS 洗滌5 min/次，共3 次；加入山羊血清封閉液，50 μl/片，室溫封閉0.5 h，甩干加入一抗，50 μl/片，放入濕盒，于4℃環(huán)境下過夜；采取PBS 浸泡5 min/次，共3 次；加入偶聯(lián)生物素二抗，50 μl/片，于37℃環(huán)境下孵育0.5 h，經(jīng)PBS 洗滌，流程同上；加入鏈霉卵白素（標(biāo)記辣根過氧化物酶），50 μl/片，于37℃環(huán)境下孵育0.5 h，經(jīng)PBS洗滌，流程同上；DAB 工作液顯色，反應(yīng)時(shí)間5 min，以自來水沖洗，終止顯色反應(yīng)；蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，50 μl/片，2 min，自來水沖洗，終止染色；經(jīng)酒精梯度脫水，以二甲苯透明，采取中性樹膠封片，經(jīng)顯微鏡觀察拍照。

1.3 觀察指標(biāo)

①比較兩組血清及組織載脂蛋白CI 表達(dá)水平。②比較研究組不同疾病分期患者血清及組織載脂蛋白CI 表達(dá)水平。③分析血清及組織載脂蛋白CI 表達(dá)水平與腎母細(xì)胞瘤疾病分期的關(guān)聯(lián)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)，多重比較采用LSD-t 檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布者轉(zhuǎn)換為正態(tài)分布后行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；計(jì)數(shù)資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Spearman 進(jìn)行相關(guān)性分析，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者載脂蛋白CI 水平的比較

研究組血清載脂蛋白CI 水平為（52.35±10.63）μg/ml，高于對照組的（32.61±9.05）μg/ml，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.305，P＜0.001）；研究組的瘤體組織載脂蛋白CI 為（49.79±7.81）μg/ml。

2.2 研究組不同疾病分期患兒載脂蛋白CI 水平的比較

研究組不同疾病分期患兒血清及瘤體組織載脂蛋白CI 水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Ⅱ期患兒血清及瘤體組織載脂蛋白CI 水平高于Ⅰ期患兒，Ⅲ期患兒血清及瘤體組織載脂蛋白CI 水平高于Ⅱ期患兒，Ⅳ期患兒血清及瘤體組織載脂蛋白CI 水平高于Ⅲ期患兒，Ⅴ期患兒血清及瘤體組織載脂蛋白CI 水平高于Ⅳ期患兒，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。

表1 研究組不同疾病分期患兒載脂蛋白CI 水平的比較（μg/ml，）

表1 研究組不同疾病分期患兒載脂蛋白CI 水平的比較（μg/ml，）

2.3 疾病分期與載脂蛋白CI 的相關(guān)性分析

血清及瘤體組織載脂蛋白CI 水平與腎母細(xì)胞瘤疾病分期呈正相關(guān)（P＜0.05）（表2）。

表2 疾病分期與載脂蛋白CI 的相關(guān)性分析

3 討論

腎母細(xì)胞瘤為小兒群體常見腎臟惡性腫瘤類型，疾病早期缺乏特異性臨床表現(xiàn)及癥狀，因此早期漏診及誤診率較高[5-7]。同時(shí)，不同分期腎母細(xì)胞瘤患者生存期限存在顯著差異，且其影響因素較多，包括疾病分期、早期診斷與治療時(shí)機(jī)等，其中早期診斷對確?；颊呒霸绲玫接行е委煛⒁源吮ＷC疾病治療效果具有積極意義[8-10]。目前，臨床多通過循環(huán)miRNAs、促血管生成素-2、缺氧誘導(dǎo)因子-1 等對腎母細(xì)胞瘤進(jìn)行診斷評(píng)估，但其血清表達(dá)水平易受環(huán)境等因素影響，導(dǎo)致其臨床應(yīng)用存在局限性[11-13]。

載脂蛋白CI 在惡性腫瘤中的檢測價(jià)值逐漸得到廣泛關(guān)注，當(dāng)前臨床已經(jīng)蛋白組學(xué)技術(shù)自腎母細(xì)胞瘤患者血清內(nèi)提取出載脂蛋白CI，但關(guān)于其在腎母細(xì)胞瘤患兒血清內(nèi)表達(dá)情況的報(bào)道研究尚未得到廣泛證實(shí)[14]。載脂蛋白CI 為載脂蛋白家族中最小可溶性蛋白類型，主要于肝臟內(nèi)合成，僅少部分于小腸等器官內(nèi)合成，為循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)陽離子含量最豐富的蛋白[15]。載脂蛋白CI 可參與高密度脂蛋白與富含甘油三酯的脂蛋白的組建，通過結(jié)合于低密度脂蛋白及極低密度脂蛋白受體，發(fā)揮抑制功能。王磊等[16]研究指出，載脂蛋白CI 為肝臟生成的含83 個(gè)氨基酸殘基的一種水溶性低分子蛋白質(zhì)，具備體內(nèi)脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)等多種作用，且載脂蛋白CI 和多種惡性腫瘤間具有密切關(guān)聯(lián)性，主要表現(xiàn)為在胃癌、子宮內(nèi)膜癌、前列腺癌及其他惡性腫瘤中均表現(xiàn)為載脂蛋白CI 表達(dá)水平異常，表明載脂蛋白CI 在諸多類型惡性腫瘤中均為異常高表達(dá)狀態(tài)，可能是因惡性腫瘤細(xì)胞高代謝狀態(tài)對能量具備更多需求，促進(jìn)機(jī)體更多地動(dòng)員脂蛋白，上調(diào)血清內(nèi)脂蛋白與其組成成分載脂蛋白CI 的表達(dá)，但由于載脂蛋白CI 相關(guān)的多種類型腫瘤通常發(fā)生于成年人群，而在兒童中發(fā)病率相對較低，故不影響將載脂蛋白CI 作為腎母細(xì)胞瘤重要的診斷評(píng)估標(biāo)志物。

目前，關(guān)于載脂蛋白CI 在惡性腫瘤中的表達(dá)水平及檢測價(jià)值已得到臨床證實(shí)，如Shi等[17]研究證實(shí)，在非小細(xì)胞肺癌患者中，載脂蛋白CI 呈高表達(dá)狀態(tài)，且隨著疾病分期的增高，其水平呈逐漸增高趨勢，故可用于疾病病情程度的評(píng)估，且其在疾病預(yù)后預(yù)測中具有較高應(yīng)用價(jià)值。Kiebish等[18]研究顯示，在早期前列腺惡性腫瘤、激素抵抗性前列腺惡性腫瘤中，患者載脂蛋白CI 血清表達(dá)水平呈逐漸增高狀態(tài)，且自正常前列腺組織至高分化前列腺惡性腫瘤，再至低分化及激素抵抗性前列腺惡性腫瘤組織內(nèi)，載脂蛋白CI蛋白表達(dá)也逐漸增高，表明在前列腺惡性腫瘤患者中，載脂蛋白CI 水平越高，則預(yù)后越差。本研究結(jié)果顯示，研究組血清載脂蛋白CI 水平高于對照組，且不同疾病分期腎母細(xì)胞瘤患者血清、瘤體組織載脂蛋白CI 水平存在明顯差異，經(jīng)相關(guān)性分析證實(shí)兩者呈正相關(guān)（P＜0.05），提示載脂蛋白CI 檢測在腎母細(xì)胞瘤中存在較高應(yīng)用價(jià)值，可準(zhǔn)確用于評(píng)估疾病分期，對指導(dǎo)臨床采取針對性治療具有重要意義。

綜上所述，腎母細(xì)胞瘤患者載脂蛋白CI 呈高表達(dá)狀態(tài)，通過檢測其水平可對疾病分期予以評(píng)估，可為臨床制訂或調(diào)整干預(yù)方案提供一定參考依據(jù)，利于保證疾病良好轉(zhuǎn)歸。但本研究存在一定局限性，即本研究為單中心小樣本研究，因此研究結(jié)果是否存在廣泛效力仍需擴(kuò)大樣本選取范圍、增加樣本量進(jìn)一步探究證實(shí)。