陳鵬飛 謝金標(biāo) 楊天寶 王 武 陳 豪 黃國(guó)忠

莆田學(xué)院附屬醫(yī)院心胸外科，福建莆田 351100

據(jù)中國(guó)國(guó)家癌癥中心（ChinaNationalCancerCenter，NCC）公布的最新癌癥數(shù)據(jù)[1]，我國(guó)常見(jiàn)的癌癥類(lèi)型包括肺癌、結(jié)直腸癌、胃癌、肝癌和乳腺癌，占比超過(guò)總癌癥類(lèi)型的50%。肺癌是中國(guó)最常見(jiàn)的癌癥，如果在早期發(fā)現(xiàn)并進(jìn)行手術(shù)切除，預(yù)后良好，5 年生存率達(dá)到70%～90%。然而，大多數(shù)患者（約75%）在確診時(shí)已是晚期（Ⅲ/Ⅳ期）[2]。因此，對(duì)肺癌患者盡早實(shí)施診斷和治療對(duì)患者的預(yù)后尤為關(guān)鍵。目前，肺部結(jié)節(jié)良、惡性的臨床診斷方法是血液學(xué)檢測(cè)（腫瘤標(biāo)志物）、影像學(xué)檢查（胸部CT）等。其中，化驗(yàn)?zāi)[瘤標(biāo)志物的指標(biāo)在肺癌和癌前病變中，癌胚抗原、腫瘤相關(guān)糖類(lèi)抗原、細(xì)胞角蛋白片段等的表達(dá)率均不高，從而對(duì)臨床診斷的準(zhǔn)確性產(chǎn)生一定的影響。影像學(xué)檢查如發(fā)現(xiàn)肺部小結(jié)節(jié)，患者對(duì)手術(shù)治療的態(tài)度不明確，未能按時(shí)治療，患者常常會(huì)錯(cuò)失最佳手術(shù)時(shí)機(jī)[3]。循環(huán)腫瘤細(xì)胞為患者機(jī)體的腫瘤細(xì)胞自發(fā)從原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移灶或者侵入性操作導(dǎo)致釋放入血，腫瘤細(xì)胞在循環(huán)中聚集，形成微小的瘤栓，在適宜條件下形成轉(zhuǎn)移灶[4]。葉酸受體在肺癌細(xì)胞中表達(dá)率高，本研究探討早期肺癌患者葉酸受體陽(yáng)性的臨床療效。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019 年9 月至2021 年12 月莆田學(xué)院附屬醫(yī)院收治的100 例疑似肺癌患者作為研究對(duì)象，其中男57 例，女43 例；年齡44～79 歲，平均（62.16±2.51）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①臨床表現(xiàn)不典型，只有咳嗽、胸悶、低熱等呼吸道表現(xiàn)，胸部CT 表現(xiàn)為疑似肺癌的單一肺結(jié)節(jié)（最大直徑＜3 cm），沒(méi)有縱隔淋巴結(jié)腫大或其他轉(zhuǎn)移；②所有患者知情且自愿參與本研究，臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①CT 顯示肺部多個(gè)結(jié)節(jié)，并伴發(fā)轉(zhuǎn)移；②包括外科和放射治療患者，或者是肺部腫瘤復(fù)發(fā)患者[5]。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意（2019090），患者和家屬均簽署研究知情同意書(shū)。

1.2 方法

所有患者抽取3 ml 肘前靜脈血，含有EDTA 的試管用于靜脈血的保存，儲(chǔ)存溫度：4℃，檢測(cè)時(shí)間：葉酸受體陽(yáng)性的循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)在24 h 后進(jìn)行。首先采用3 ml 血液中的免疫磁性微球負(fù)向富集方法，采用配體PCR 技術(shù)對(duì)其進(jìn)行定量檢測(cè)，上海格諾思博生物技術(shù)有限公司為其提供的檢測(cè)試劑盒，并嚴(yán)格按照試驗(yàn)試劑盒的使用方法進(jìn)行操作[6]，用4 倍于3 ml 的紅細(xì)胞溶解液，于4℃溶解15 min，除去紅細(xì)胞，再加入150 μl 抗CD45 微球，于4℃培養(yǎng)30 min，除去白細(xì)胞；將抗CD14 微粒50 μl 于4℃培養(yǎng)30 min，將巨噬細(xì)胞剔除；將采集到的循環(huán)腫瘤細(xì)胞添加10 μl的具有腫瘤特異性的葉酸配體-寡核苷酸偶合物的探針標(biāo)記液，在室溫孵育40 min，然后添加1 ml 的清洗緩沖溶液，在4℃下進(jìn)行10 min 的離心，以1500 r/min 的速度，離心半徑15 cm，反復(fù)3 次，以除去未結(jié)合的探頭；最后，添加120 μl 的洗脫緩沖溶液，4℃培養(yǎng)2 min，將結(jié)合的探頭洗脫出來(lái)，離心收集，加入中和緩沖液24 μl，進(jìn)行熒光PCR 擴(kuò)增，利用ABI7300 儀器（美國(guó)愛(ài)普拜斯公司）采集PCR 信號(hào)和數(shù)據(jù)[7-8]。在此基礎(chǔ)上，ABI7300 儀器在95℃變性2 min、40℃退火30 s、72℃延長(zhǎng)30 s、8℃5 min 完成；40 次熱處理后，95℃變性10 s、35℃退火30 s、72℃延伸10 s。在3 ml 的血液中，發(fā)現(xiàn)1 個(gè)循環(huán)中的葉酸受體陽(yáng)性細(xì)胞，即1 FU[9]。

1.3 觀察指標(biāo)

記錄100 例患者中的早期肺癌、肺良性結(jié)節(jié)患者的例數(shù)，葉酸受體陽(yáng)性循環(huán)腫瘤細(xì)胞計(jì)數(shù)及該檢測(cè)方法在臨床診斷的靈敏度、特異度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線并采用Kappa 一致性檢驗(yàn)分析診斷價(jià)值，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 早期肺癌患者和肺良性病變患者葉酸受體陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的比較

結(jié)合患者的病理診斷結(jié)果，有75 例早期肺癌患者，25 例肺良性病變患者，早期肺癌患者的葉酸受體陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞為（11.38±1.37）FU/3 ml，高于肺良性病變患者的（8.10±1.83）FU/3 ml，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.495，P＜0.05）。

2.2 葉酸受體陽(yáng)性循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)診斷早期肺癌的價(jià)值

以術(shù)后病理結(jié)果作為診斷肺癌的金標(biāo)準(zhǔn)，Kappa一致性檢驗(yàn)顯示葉酸受體陽(yáng)性循環(huán)腫瘤診斷早期肺癌具有一定的準(zhǔn)確性（Kappa=0.683，P＜0.05）；以葉酸受體陽(yáng)性循環(huán)腫瘤細(xì)胞作為肺癌的診斷指標(biāo)，ROC曲線下面積為0.810（95%CI=0.648～1.000），最佳截?cái)嘀禐?.7 FU/3 ml，靈敏度為87.7%，特異度為76.9%（圖1）。

圖1 葉酸受體陽(yáng)性循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)診斷價(jià)值的ROC 曲線

3 討論

肺癌患者的人數(shù)越來(lái)越多，病情嚴(yán)重，具有很高的死亡率，嚴(yán)重威脅患者的生命安全。因此，對(duì)肺癌患者做到早診斷和早治療尤為重要。隨著居民對(duì)體檢意識(shí)認(rèn)知性的提高，肺結(jié)節(jié)的臨床診斷率越來(lái)越高，但結(jié)節(jié)的性質(zhì)、能否手術(shù)影響著患者及家屬的決定[10]。

腫瘤標(biāo)記物在早期肺癌的診斷中，臨床參考價(jià)值較小，診斷意義不大。而外周血中腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)在臨床上也有一定的局限性，目前，尚沒(méi)有一種標(biāo)準(zhǔn)的方法來(lái)進(jìn)行檢測(cè)[11]。早期的循環(huán)腫瘤細(xì)胞可以顯示出腫瘤細(xì)胞的形狀，而循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)則是基于不同的細(xì)胞形態(tài)，對(duì)腫瘤各項(xiàng)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，而不需要對(duì)細(xì)胞表面的信息進(jìn)行檢測(cè)，其優(yōu)勢(shì)在于不依賴(lài)于循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞表面抗原，且其形態(tài)和活性保持不變，但其純度非常低，容易失去直徑較小的循環(huán)腫瘤細(xì)胞[12-14]。

葉酸受體在肺癌細(xì)胞的表達(dá)性很高，因此，葉酸受體陽(yáng)性的循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)是最理想的檢測(cè)手段。通過(guò)保真放大、實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR 分子，實(shí)現(xiàn)雙層次放大，最終完成對(duì)3 ml 血液樣本中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)的靈敏度有很大的改善[15]。在本研究中，通過(guò)對(duì)100 例疑似肺癌患者實(shí)施檢測(cè)，比較早期肺癌的臨床診斷中早期肺癌及良性肺結(jié)節(jié)患者的葉酸受體陽(yáng)性循環(huán)腫瘤細(xì)胞，結(jié)果顯示，葉酸受體陽(yáng)性循環(huán)腫瘤細(xì)胞更高，早期肺癌患者的葉酸受體陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞含量高于肺良性病變細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.495，P＜0.05），同時(shí)檢測(cè)Kappa 值為0.683，AUC為0.810，最佳截?cái)嘀禐?.7 FU/3 ml，靈敏度為87.7%，特異度為76.9%，具有一定的臨床診斷價(jià)值。本研究結(jié)果與唐興等[16]的研究結(jié)果一致，具有參考價(jià)值。

綜上所述，葉酸受體陽(yáng)性循環(huán)腫瘤細(xì)胞在早期肺癌的臨床診斷中靈敏度較高，能夠作為診斷早期肺癌的有效標(biāo)記物，明確肺癌患者的具體情況，在臨床上具有較高的應(yīng)用價(jià)值，值得臨床推廣應(yīng)用。