張 欣，鄧 巍，朱婭佼，楊曉燕，肖 文，李 娜*

（1.大理大學(xué)東喜瑪拉雅研究院，云南大理 671003；2.云南省高校洱海流域保護(hù)與可持續(xù)發(fā)展研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南大理 671003）

微生物多樣性分布與生態(tài)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)過(guò)程、生態(tài)系統(tǒng)功能、生態(tài)系統(tǒng)恢復(fù)關(guān)系密切，因此微生物分布格局及其維持機(jī)制一直是生態(tài)學(xué)研究的熱點(diǎn)〔1-3〕。早期的微生物學(xué)家認(rèn)為微生物的分布與地理隔離無(wú)關(guān)，微生物在環(huán)境中呈隨機(jī)分布模式〔4-5〕。近年來(lái)，隨著生態(tài)學(xué)研究的不斷發(fā)展，越來(lái)越多的證據(jù)表明微生物與地理歷史關(guān)系密切〔6〕。在多種影響因素的共同作用下，微生物存在著復(fù)雜的空間分布格局〔7-8〕。如季節(jié)變化、氣候條件、海拔、微生物特性以及人為干擾等因素均會(huì)影響微生物的空間分布〔9-11〕。自然界中的微生物不僅與非生物環(huán)境相互作用〔12〕，還受動(dòng)植物分布〔13〕、研究區(qū)域環(huán)境異質(zhì)性〔14〕的影響，因此微生物多樣性分布格局的研究相較動(dòng)植物更為困難，而選擇一個(gè)合適的研究區(qū)域開(kāi)展相關(guān)研究也尤為重要。

流域是一個(gè)具有清晰邊界和相對(duì)獨(dú)立的生態(tài)系統(tǒng)〔15〕，在分隔陸地系統(tǒng)的同時(shí)也驅(qū)動(dòng)了物質(zhì)和能量在水陸生境和上下游的分布。有學(xué)者提出微生物多樣性在流域視角下是不均勻分布的〔16〕，隨機(jī)過(guò)程在河流微生物群落形成中起著更重要的作用〔17〕。河流的地理阻隔和連通性也會(huì)塑造微生物空間分布格局〔18〕。在流域視角下可更好地預(yù)測(cè)微生物多樣性〔19〕。目前關(guān)于微生物多樣性分布格局等研究多集中在海洋和湖泊環(huán)境〔20-21〕，在流域生態(tài)系統(tǒng)的研究相對(duì)較少?；诹饔蜷_(kāi)展微生物空間分布格局的研究，必須關(guān)注空間尺度，如流域內(nèi)的上下游、水陸生境、干支流等各個(gè)流域單元內(nèi)微生物的空間分布差異。研究〔16〕表明，微生物在大的流域尺度下具有明顯的空間地理分布特征，也有研究〔22-23〕證明了微生物在流域的水陸生境間具有異質(zhì)性分布格局，且同一條流域干支流上的微生物具有相似的水陸分布格局。因此，選擇在一條小型河流的上下游初步探究微生物的空間地理分布是逐步明晰流域視角下微生物空間分布格局的關(guān)鍵。然而微生物種類眾多，且大多為人類未知，盡管高通量測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展能夠幫助人們獲得更多的微生物群落信息，但也仍然沒(méi)有辦法理解整個(gè)微生物類群的空間異質(zhì)性分布〔24〕。而結(jié)合純培養(yǎng)手段，選擇一類物種和分類信息相對(duì)完善、生態(tài)功能明確的微生物類群來(lái)開(kāi)展相關(guān)研究也為微生物生態(tài)學(xué)研究提供了一種新的思路。

捕食線蟲真菌（nematode-trapping fungi，NTF）是一類水陸兩棲并廣泛分布的真菌類群。該類群既可以營(yíng)腐生生活又可以通過(guò)營(yíng)養(yǎng)菌絲特化形成捕食器官來(lái)捕捉線蟲，目前僅有116種〔25-31〕，容易鑒別，是利用純培養(yǎng)手段開(kāi)展微生物生態(tài)學(xué)研究的理想類群。因此，該類群是研究微生物分布格局的理想對(duì)象〔27〕。本研究選擇生物多樣性豐富、環(huán)境異質(zhì)性強(qiáng)的大盈江作為研究區(qū)域，以NTF為研究對(duì)象，探究NTF在流域上下游的空間分布格局，同時(shí)驗(yàn)證水流對(duì)微生物分布具有匯聚作用的假說(shuō)。研究結(jié)果將為在流域視角下開(kāi)展微生物空間分布格局研究提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域 大盈江又稱大車江，全長(zhǎng)約204.5 km，流域面積約5 636 km2，是云南六大水系之一的伊洛瓦底江一級(jí)支流，具有云南重要的河流濕地類型，地處熱帶和南亞熱帶的過(guò)渡地帶〔32〕。其特殊的地理位置和氣候條件以及復(fù)雜的地形地貌，孕育了大盈江的生物多樣性。本研究選擇大盈江為研究區(qū)域，沿著其河流流向進(jìn)行樣區(qū)布設(shè)，根據(jù)河流長(zhǎng)度將其劃分為上、中、下游。

1.2 樣品采集 研究區(qū)域內(nèi)，共布設(shè)3個(gè)樣區(qū)，每個(gè)樣區(qū)處以河流交匯點(diǎn)為支點(diǎn)，在支點(diǎn)及支點(diǎn)上、下游10、20 m處設(shè)置樣點(diǎn)，每個(gè)樣點(diǎn)處對(duì)稱采集水體底泥和河岸陸地土壤樣品，共獲得3個(gè)樣區(qū)、30個(gè)樣點(diǎn)處的30份樣品。陸地土壤樣品采集方法：按5點(diǎn)采樣法采集土壤表層以下0～10 cm的土壤約50 g，將得到的樣品充分混勻；水中底泥采集方法：選用自制取樣設(shè)備采集立下0～10 cm的底泥約50 g，每份樣品通過(guò)5點(diǎn)采樣法混勻得到。將采集到的樣品分別置于一次性無(wú)菌自封袋中，做好樣品信息標(biāo)記，帶回實(shí)驗(yàn)室，1周內(nèi)完成所有樣品的處理。

1.3 培養(yǎng)基配制 參照文獻(xiàn)〔27〕，配制玉米粉瓊脂培養(yǎng)基（corn meal agar medium，CMA），用于分離純化NTF；配制馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar medium，PDA），用于NTF的菌絲富集；配制燕麥培養(yǎng)基，用于誘餌線蟲的培養(yǎng)。

1.4 誘餌線蟲的培養(yǎng)和懸浮液的制備 將全齒復(fù)活線蟲接入燕麥培養(yǎng)基放恒溫培養(yǎng)箱（26.5±1.0）℃培養(yǎng)1周，觀察到線蟲爬壁，取出備用或放4℃冰箱保存。采用貝爾曼漏斗法〔27〕制備線蟲懸浮液。

1.5 NTF的分離純化 分離純化采用誘餌平板法〔27〕：用5點(diǎn)撒樣法在CMA上撒入1.5 g土樣，加入線蟲懸浮液2 mL（約5 000條）以誘導(dǎo)NTF生長(zhǎng)，每份樣品設(shè)置3個(gè)平行，將平板放置于常溫下培養(yǎng)4周，用體視顯微鏡鏡檢。觀察到NTF后，用無(wú)菌牙簽將NTF單個(gè)分生孢子轉(zhuǎn)接到CMA上，將接種好的CMA置于恒溫培養(yǎng)箱中26.5℃培養(yǎng)，培養(yǎng)出的NTF純化3～5次。

1.6 NFT物種鑒定NFT形態(tài)特征觀察：用無(wú)菌刀在CMA上挖取1個(gè)2 cm×2 cm的觀察室，在觀察室邊緣45°角斜插入潔凈的蓋玻片，待分生孢子和菌絲鋪滿蓋玻片，用小鑷子夾出蓋玻片，在一片潔凈的載玻片上（靠正中間位置）滴加1滴無(wú)菌水，覆上蓋玻片，制成臨時(shí)裝片，在顯微鏡（40×）下觀察〔33〕，用奧林巴斯BX53微分干涉顯微成像系統(tǒng)拍取分生孢子、孢子梗、厚垣孢子等形態(tài)特征。

NFT捕食器官誘導(dǎo)：待菌絲長(zhǎng)滿觀察室，即可滴加誘餌線蟲懸液（約200條線蟲），12～24 h后，用體式顯微鏡（10×或40×）觀察培養(yǎng)皿上形成的各種捕食器官類型；結(jié)合菌株形態(tài)特征及捕食器官類型進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定〔27〕。

NFT的分子鑒定：在PDA上進(jìn)行NFT菌絲富集培養(yǎng)后，參照文獻(xiàn)〔34〕進(jìn)行DNA的提取，以真菌通用引物ITS1/ITS4〔35〕和RPB1-DF2asc〔36〕/RPB1-G2R〔37〕分別擴(kuò)增核糖體RNA上的非轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)和RNA聚合酶Ⅱ核心亞基編碼基因序列。獲得測(cè)序結(jié)果后，在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中通過(guò)上述序列同源性比對(duì)進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，結(jié)合菌株形態(tài)特征進(jìn)行最終的物種鑒定。

1.7 數(shù)據(jù)處理 計(jì)算物種的檢出率，檢出率（occurrence frequency，OF）=（物種出現(xiàn)的樣品數(shù)/總的樣品數(shù)）×100%〔33〕。

采用香農(nóng)-維納多樣性指數(shù)（Shannon Wiener's diversity index，H′）計(jì)算上、中、下游各樣區(qū)的物種多樣性：，式中，S為物種數(shù)目，N為物種的個(gè)體數(shù)之和，Ni為第i個(gè)物種個(gè)體數(shù)量。

采用Jaccard指數(shù)計(jì)算各樣區(qū)間的群落相似性，Jaccard指數(shù)=a/（a+b+c）。式中，a表示2個(gè)樣點(diǎn)均出現(xiàn)的物種數(shù)，c表示僅在樣點(diǎn)1出現(xiàn)的物種數(shù)，b表示僅在樣點(diǎn)2出現(xiàn)的物種數(shù)。Jaccard指數(shù)值越大，表示物種相似度越高。

2 結(jié)果

2.1 大盈江NTF物種分布 大盈江30份樣品中共分離鑒定出1屬9種19株NTF，檢出率為43.33%，物種多樣性指數(shù)為1.91。其中上游1屬3種，中游1屬4種，下游1屬6種。彎孢節(jié)叢孢Arthrobotrys.musiformis在上、中、下游均有分布；秀麗單頂孢A.oudemansii分布在上、中游；爪哇節(jié)叢孢A.javanica分布在中、下游；而少孢節(jié)叢孢A.oligospora僅在上游有分布；厚皮單頂孢A.eudermata僅分布在中游；奇妙單頂孢A.thaumasium、中華單頂孢A.sinensis、狂帶單頂孢A.rutgeriense和圓錐節(jié)叢孢A.conoides僅在下游有分布。見(jiàn)圖1。

圖1 大盈江上、中、下游樣區(qū)NTF物種分布圖

2.2 大盈江上、中、下游NTF物種檢出率和多樣性對(duì)大盈江上、中、下游的NTF檢出率和香農(nóng)-維納多樣性指數(shù)進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果顯示，下游NTF的檢出率最高，中、上游檢出率相同；香農(nóng)-維納多樣性指數(shù)為下游最高，中游次之，上游最低。見(jiàn)表1。

表1 大盈江上、中、下游樣區(qū)NTF檢出率和香農(nóng)-維納多樣性指數(shù)

2.3 大盈江各樣區(qū)間的NTF群落相似性 分別對(duì)大盈江上中游、中下游、上下游的水體底泥和陸地土壤的Jaccard指數(shù)進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：NTF在上中游、中下游、上下游的水體中物種相似性均高于陸地。見(jiàn)表2。

表2 大盈江各樣區(qū)間NTF Jaccard指數(shù)

3 討論

在一個(gè)通過(guò)水流進(jìn)行聯(lián)通的流域生態(tài)系統(tǒng)中，微生物在流域內(nèi)的分布在理論上應(yīng)該是均質(zhì)的。但本研究結(jié)果顯示，NTF在大盈江流域內(nèi)存在上下游異質(zhì)性空間分布格局。在大盈江分離到的NTF中，只有彎孢節(jié)叢孢A.musiformis在各個(gè)樣區(qū)均有分布，其余物種僅在局部樣區(qū)分布，且沿著河流的方向，區(qū)域特有物種逐漸增多，NTF物種多樣性從上游至下游依次增加。說(shuō)明NTF在大盈江流域內(nèi)是非均質(zhì)分布的。在生態(tài)學(xué)研究中，多樣性是衡量群落穩(wěn)定性的一個(gè)重要指標(biāo)，常用于反映群落結(jié)構(gòu)的復(fù)雜程度和穩(wěn)定性〔38〕。王佳等〔39〕發(fā)現(xiàn)渾河不同河段底泥中微生物多樣性指數(shù)隨水期的變化存在差異，但不僅水期會(huì)影響微生物分布，水流、氣候等環(huán)境條件也都可能會(huì)導(dǎo)致微生物分布出現(xiàn)差異〔38〕。本研究選擇在一年中微生物群落結(jié)構(gòu)最穩(wěn)定的時(shí)期（3～4月）進(jìn)行樣品的采集，結(jié)果仍發(fā)現(xiàn)大盈江上、中、下游的物種多樣性存在差異，這可能是因?yàn)樵谒鞯膮R聚作用下，上游的有機(jī)物、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等匯入下游，而下游海拔較低、水流速度較慢、底泥更容易沉積，所以下游的NTF檢出率和多樣性高于上游。

整體上，大盈江陸地土壤中檢出的NTF物種數(shù)比水體底泥中更多，這與之前的研究結(jié)果一致〔22-23〕，說(shuō)明在流域生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)，陸地土壤是微生物棲息、繁殖、演化的主要場(chǎng)所，而流域內(nèi)微生物的物種多樣性可能主要由其臨近的陸地土壤貢獻(xiàn)。在大盈江的陸地土壤中，僅只有上游和中游間的NTF物種組成存在一定的相似性，中游與下游、上游與下游間的物種組成完全不同。有研究〔40〕表明，土壤樣品之間的地理位置相隔越遠(yuǎn)，微生物群落之間的差異就越明顯。在本研究中，由于各樣區(qū)的陸地土壤間距離較遠(yuǎn)，且有山脈阻隔，群落間的差異性也就更大；在水體底泥中，整個(gè)研究區(qū)域內(nèi)水體底泥間的NTF均存在一定的相似性，并且各樣區(qū)水體底泥間物種相似性均高于陸地土壤，說(shuō)明水流的均一性在整條河流的物種分布中具有重要的作用，水流對(duì)于NTF在流域內(nèi)的傳播非常關(guān)鍵。盡管水流的聯(lián)通和均一性使得各樣區(qū)的水體底泥間NTF物種組成存在一定的相似性，但也具有較大的差異性，這表明流域的上下游間仍然具有較大的環(huán)境異質(zhì)性而使微生物在流域內(nèi)形成差異性分布。

研究區(qū)域內(nèi)，NTF在上下游存在空間分布格局，水流的匯聚作用是流域內(nèi)微生物傳播的主要驅(qū)動(dòng)力之一。在流域生態(tài)系統(tǒng)中，除水流對(duì)微生物的傳播作用以外，還存在河流自身產(chǎn)生的屏障對(duì)微生物形成擴(kuò)散限制，河流沿岸的陸地土壤間的物種組成還受山脈阻隔的影響。因此，在流域視角下開(kāi)展微生物空間分布格局研究時(shí)，應(yīng)該兼顧水陸和上、下游等流域特征，將更有助于探索流域內(nèi)水流的擴(kuò)散作用和環(huán)境異質(zhì)性在微生物群落演化過(guò)程中的相對(duì)貢獻(xiàn)。