謝敏敏 王亞坤 魏成清 陳 辰 劉曉莉 李 偉 洪孝友 朱新平

(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點實驗室, 廣州 510380)

微衛(wèi)星DNA也稱為簡單串聯(lián)重復(fù)序列 (Simple Sequence Repeats, 簡稱SSRs), 是由1—6個核苷酸為重復(fù)單位而多次串聯(lián)的 DNA 序列, 它在水產(chǎn)動物的研究領(lǐng)域利用最為普遍、并且十分有效, 可以將它應(yīng)用于各類經(jīng)濟物種、瀕危物種的遺傳多樣性檢測、遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位、群體遺傳結(jié)構(gòu)分析及種群的親緣鑒定、種質(zhì)資源保護等方面的研究[1—9]。

黿(Pelochelys cantorii)屬于龜鱉目(Testudines)、鱉科(Trionychidae)、黿屬(Pelochelys), 是我國地區(qū)體型最大的水生龜鱉動物之一, 也是整個珠江流域,乃至我國南部地區(qū)水系生態(tài)系統(tǒng)健康的重要指示物種[10]。并且, 由于黿的種族延續(xù)歷史源遠流長[11],因此它在對歷史環(huán)境變化的研究以及生物進化方面的研究都具有十分重要的科學(xué)價值。但是, 由于不正當(dāng)?shù)馁Q(mào)易、人類的濫捕濫殺及水利工程等, 黿的生存環(huán)境不斷惡化, 其群數(shù)量大幅減少。如今,黿已成為極端瀕危物種, 2020年9月, 據(jù)我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示, 我國目前僅人工保圈養(yǎng)條件下保有13只性成熟的黿[12,13]。國外黿種群數(shù)量也在20世紀(jì)迅速減少[14—16], 黿在全球范圍內(nèi)的物種延續(xù)都面臨著嚴(yán)酷的挑戰(zhàn)。因此, 為了加強對黿的保護, 我國在早在1989年就將黿定為國家一級重點水生野生保護動物[17,18]。2014年7月至2021年6月, 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所人工馴養(yǎng)保護的4只親黿(2雌2雄)已產(chǎn)下孵育了800多只不同規(guī)格的子一代黿[19,20], 但其遺傳信息還未知。為了保證圈養(yǎng)群體的遺傳多樣性處于適于中高度的水平、避免近交危害黿人工保種群體的健康, 并在未來實現(xiàn)對自然群體的增殖, 本論文擬探究人工馴養(yǎng)條件下子一代黿的遺傳信息并建立親子鑒定技術(shù), 意在為瀕危動物黿人工保種工作提供科學(xué)理論基礎(chǔ)和方法。

1 材料與方法

1.1 實驗對象

實驗用子一代黿包含2021年生產(chǎn)的56個個體。56只子一代黿均來自高明黿繁育保護基地人工馴養(yǎng)的4只親本(2♀, 2♂)。收集同年但不同窩次的受精卵在人工控溫控濕條件下孵化, 待稚黿孵出后收集其脫落的臍帶, 浸泡于無水乙醇中并做好標(biāo)記, ?20℃保存。其每窩包含的個體數(shù)量如表1, 按所屬窩次編號, 若為第1窩則編號為“1-x”, 屬第2窩則編號為“2-x”。

表1 孵出子代黿臍帶采樣數(shù)量Tab.1 Number of hatching progenitor turtles umbilical cord samples

1.2 基因組DNA提取

剪臍帶約10 μL, 按照說明書的方法, 使用MicroElute Genomic DNA Kit試劑盒(OMEGA)提取基因組DNA, 使用NanoQTM微型分光光度計(博奧)檢測所提取DNA的OD值及濃度, 并使用1%瓊脂糖凝膠電泳測試其完整性, 隨后轉(zhuǎn)入–20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 微衛(wèi)星引物設(shè)計與篩選

利用本實驗室測得的黿的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(未公布), 采用MISA軟件挖掘黿轉(zhuǎn)錄組序列中的微衛(wèi)星標(biāo)記(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/), 再通過引物設(shè)計軟件PrimerPremier5.0進行三、四核苷酸重復(fù)及核苷酸重復(fù)微衛(wèi)星序列的篩選。進行PCR擴增前, 將所有引物稀釋至10 μmol/L, 再將每對引物按照上下游1﹕40的比例進行混合, 3種熒光接頭均稀釋至20 μmol/L。建立10 μL多重PCR反應(yīng)體系:AB Multiplex PCR Master Mix 5 μL, 混合引物(含上下游)2 μL, 熒光接頭0.2 μL, 去離子水1.8 μL。30—150 ng/L的DNA 1 μL。擴增程序為: 94℃預(yù)變性5min; 94℃變性30s, 60℃退火45s, 72℃延伸70s(24個循環(huán)); 94℃變性30s, 53℃退火40s, 72℃延30s(8個循環(huán)); 72℃再延伸10min。在 ABI3730 自動測序儀上進行熒光信號的收集, 利用毛細(xì)管電泳方法進行基因型檢測(測序過程由廣州天一輝遠基因科技有限公司完成)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Popgene軟件[21]計算各微衛(wèi)星位點的等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Shannon指數(shù)。用CERVUS3.0軟件[22]計算微衛(wèi)星位點的多態(tài)性信息含量(PIC)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)。

本實驗以孟德爾遺傳定律為判定親子關(guān)系的理論依據(jù)。由于進行實驗的所有子代個體均知曉其屬于當(dāng)年產(chǎn)出的第幾窩, 因此母本均為確定母本,父本為疑似父本, 可以采用排除法進行父權(quán)鑒定。根據(jù)SSR擴增產(chǎn)物建立0、1數(shù)據(jù)矩陣, 即記錄每個個體在相同的遷移位置上的條帶狀況, 有條帶的記為1, 反之則記為0。再利用 NTSYS軟件[23], 基于Nei’s 遺傳相似系數(shù)對遺傳數(shù)據(jù)的 UPGMA(非加權(quán)類平均)進行聚類分析。

2 結(jié)果

2.1 DNA的提取與質(zhì)檢

本實驗用1%瓊脂糖凝膠電泳來檢測DNA的完整性, 根據(jù)結(jié)果可知DNA完整性較好、條帶明亮;接著使用NanoQTM微型分光光度計(博奧)測定A260/A280, 結(jié)果顯示每個個體的DNA值分布于1.82—1.92, 表明其純度較高。即DNA質(zhì)量可滿足后續(xù)實驗的要求。

2.2 微衛(wèi)星引物設(shè)計及多態(tài)性篩選

搜索轉(zhuǎn)錄組序列中的SSR, 并進行引物設(shè)計, 成功設(shè)計出3萬余對三核苷酸及四核苷酸重復(fù)的微衛(wèi)星引物序列, 其中三核苷酸重復(fù)微衛(wèi)星引物序列67.73%, 其中(AAT)n數(shù)目最多, 占6.00%; 四核苷酸重復(fù)微衛(wèi)星引物序列32.27%, 其中(AAAG)n數(shù)目最多, 占6.67%。隨機挑選其中230對引物, 經(jīng)第一次篩選出153對能擴增出穩(wěn)定條帶的引物, 再挑選子代個體DNA進行二次篩選, 發(fā)現(xiàn)僅有10對引物具多態(tài)性,占比為6.53%。10對微衛(wèi)星標(biāo)記引物相關(guān)信息見表2,引物在個體中PCR擴增產(chǎn)物的毛細(xì)管電泳圖譜效果如圖1及圖2所示。在使用ABI3130多功能基因遺傳分析儀進行遺傳分型時, 為降低基因型測序的成本,將帶有不同熒光基團的PCR產(chǎn)物分組, 進行混合測序。本試驗將10個微衛(wèi)星標(biāo)記分為2組(表3)。

表3 衛(wèi)星標(biāo)記分組情況Tab.3 The grouping of microsatellite markers

圖1 引物Xm86在隨機個體中的PCR擴增產(chǎn)物的毛細(xì)管電泳圖譜Fig.1 Capillary electrophoresis of PCR amplification products of primer Xm86 in random individuals

圖2 引物Xm86在隨機個體中的PCR擴增產(chǎn)物的毛細(xì)管電泳圖譜Fig.2 Capillary electrophoresis of PCR amplification products of primer Xm86 in random individuals

表2 黿微衛(wèi)星引物序列及擴增信息Tab.2 Primers and amplification information of Pelochelys cantorii microsatellite

2.3 群體遺傳多樣性分析

2個PCR組合所包含的10個微衛(wèi)星標(biāo)記均能夠在黿的56個個體中擴增出穩(wěn)定、清晰的DNA條帶,每個位點檢測到的等位基因數(shù)為2—4; PIC為0.306—0.684; 群體內(nèi)近交系數(shù)(Fis)為–0.6970—0.1418。有效等位基因數(shù)(Ne)為1.2800—3.0521, 觀測雜合度(Ho)為0.250—0.929, 平均為0.6305; 期望雜合度(He)為0.221—0.678, 平均為0.4767; 香農(nóng)多樣性指數(shù)(I)為0.3768—1.0290, 平均為0.7182。每個微衛(wèi)星位點雙親基因型均未知時單個微衛(wèi)星位點的非排除概率(NE-1P), 已知單親基因型時單個微衛(wèi)星位點的非排除概率(NE-2P), 兩個親本基因型已知時的非排除概率(NE-PP)如表4所示。并且, 排除概率會隨著微衛(wèi)星位點數(shù)的增多而增大。10個微衛(wèi)星位點的累積排除概率分別為73.14%(NE-1P)、90.98%(NE-2P)和98%(NE-3P)。

表4 子一代黿在10對微衛(wèi)星位點的多樣性指數(shù)Tab.4 Diversity index of subgeneration Soft-shelled turtles at 10 pairs of microsatellite loci

2.4 聚類分析比較

NTSYS聚類結(jié)果如圖3所示, 根據(jù)每個個體實際所屬的窩次推斷軟件分析所得親本的親本是否正確。經(jīng)過計算, 若只考慮母本, 推演正確率為89.29%; 若同時考慮父母本, 則正確率為80.36%。

圖3 NTSYS 軟件聚類分析Fig.3 Cluster analysis of NTSYS software

2.5 親本后代數(shù)的比較

統(tǒng)計結(jié)果顯示實驗群體中每個雌黿與雄黿都育有后代, 但每個親本的后代數(shù)都不同。結(jié)合當(dāng)年繁殖季節(jié)的觀察記錄, 可知兩只母本分別誕下共2窩(第1與第5窩)與4窩(第2、3、4及第6窩)子代(表5),母本的后代數(shù)在群體總后代中貢獻率分別為33.93%和66.07%。

表5 每個子代個體的親緣關(guān)系Tab.5 Genetic relationship of each progeny

3 討論

3.1 子一代黿的遺傳信息

本研究使用10個微衛(wèi)星位點進行遺傳參數(shù)分析, 位點多態(tài)信息含量為0.306—0.6840, 其均值為0.3829。Schultz等[24]認(rèn)為PIC>0.5為高多態(tài)性信息含量, 0.5>PIC>0.25的信息含量為中等適度, 而PIC<0.25為低信息含量, 本實驗所選用的標(biāo)記位點,包含高度多態(tài)標(biāo)記2個(PIC≥0.5), 中度多態(tài)標(biāo)記8個, 無低信息含量位點。由10個位點分析可得, 黿2021年子一代群體的觀測雜合度(Ho)為0.250—0.929, 平均為0.6305; 期望雜合度(He)為0.221—0.678, 平均為0.4767。金鈴等[25]同樣利用10個微衛(wèi)星位點對兩個紅螯螯蝦(Cherax quadricarinatus)群體進行遺傳多樣性參數(shù)分析, 其平均Ho為0.464, 平均He為0.557。相比之下, 可見2021年的黿子一代群體的遺傳多樣性處于中度水平。同時與瀕危龜鱉類比較, 荊勝利等[26]用18對引物對黃緣盒龜(Cuora flavomarginata)的4個群體進行觀測雜合度測定, 其He為0.032—0.936, 平均值為0.329; 人工圈養(yǎng)條件下黃喉擬水龜(Mauremys mutica)的觀測雜合度(Ho)介于0.364—0.921, 平均值為 0.687[27]。相比之下, 可見黿子一代群體遺傳多樣性處于較豐富的水平。

3.2 親子鑒定

通過上述微衛(wèi)星位點進行親子鑒定, 得出累積排除概率分別為73.14% (NE-1P)、90.98%(NE-2P)和98%(NE-3P)。與同樣以少數(shù)親本進行圈養(yǎng)繁殖的揚子鱷(Alligator sinensis)[28]比較: 當(dāng)雙親的基因型均在未知的情況下, 揚子鱷13個位點累積排除概率為 0.7763; 已知單親基因型時的累積排除概率為0.9414。這說明本實驗中所選用的微衛(wèi)星位點可滿足黿親子鑒定的要求。

本實驗還通過NTSYS軟件對整個子代群體進行聚類, 結(jié)果基本均顯示其可分為2個亞群, 符合實際圈養(yǎng)觀察為兩個母本參與生產(chǎn)的真實情況。并且, 結(jié)果表明其可進一步分為4個亞群, 也與實際養(yǎng)殖中4只親黿均參與生殖活動的理論子代群體構(gòu)成相映照(♀1×♂1、♀1×♂2、♀2×♂1和♀2×♂2)。由此可見, 基于微衛(wèi)星所建立的親子分析技術(shù)的結(jié)果較為可靠。

3.3 親本繁殖力分析

經(jīng)統(tǒng)計, 母本的后代數(shù)在群體總后代中貢獻率分別為33.93%和66.07%。后代數(shù)在親本中表現(xiàn)差異的現(xiàn)象十分常見, 如文萍等[26]利用 89 只雌龜進行子代統(tǒng)計, 經(jīng)親子鑒定可明確分配 258 只子代到60 個母本中, 有29個母本沒有被分配子代, 這表明不同母本具有不同的繁殖力?？稍谖磥碜哟庇? 以個體繁殖力作為選擇母本的重要參考條件。

經(jīng)過遺傳聚類分析, 還可發(fā)現(xiàn)每對親本組合對子代的貢獻率存在顯著差異。對于雌性爬行動物來說, 一妻多夫制可減小近交衰退和遺傳不相容性[29],還可以為同一種群中的所有成熟雄性提供交配的機會, 以此增加種群的遺傳多樣性[30,31]。例如, 多父性在胎生巖魚(Sebastesspp.)[32]的多重父權(quán)的繁殖策略, 可以作為一種基因上的緩沖方式來擴大該種的適應(yīng)幅度, 以應(yīng)對自然選擇的壓力, 更利于種群的延續(xù)和散布。

而黿子一代的4個子代亞群所擁有子代個體數(shù)不同, 其原因可能是雄性在交配活動中競爭力的優(yōu)劣, 諸如雌性選擇偏好, 即能夠提供更多更好物質(zhì)利益的雄性會被雌性優(yōu)先選擇, 以便將這些優(yōu)勢直接轉(zhuǎn)化為產(chǎn)卵的適宜效應(yīng); 精子濃度與活力差異對受精結(jié)果的影響; 雌性個體與雄性個體之間的固定搭配; 時間上最后進行交配的個體由于在雌性生殖器中貢獻的精子損失量少、能夠去除前任雄性的精子占比、精子在雌性生殖器中的存放位置等使其更占優(yōu)勢。諸如此類因素, 都可能造成父權(quán)分配不均的結(jié)果。

然而, 優(yōu)勢個體的出現(xiàn)可能會造成子代群體內(nèi)遺傳多樣性的偏移和減少。在將來F2的育種中, 可利用分子遺傳手段挑選種黿, 保護稀有等位基因,通過兩兩個體之間的親緣分析, 隔離或遷出親緣關(guān)系對較多的繁殖雌雄個體, 進而提高黿種群遺傳多樣性的維持能力, 進一步改進瀕危物種的人工飼養(yǎng)繁殖管理和保護策略。