劉 婭 于 躍 魯子怡 丁 洋 樊啟學(xué),2 沈志剛

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水生物繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 教育部長(zhǎng)江經(jīng)濟(jì)帶大宗水生生物產(chǎn)業(yè)綠色發(fā)展工程研究中心, 池塘健康養(yǎng)殖湖北省工程實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430070; 2.湖北黃優(yōu)源漁業(yè)發(fā)展有限公司, 武漢 430299)

水產(chǎn)養(yǎng)殖是“藍(lán)色食品”的主要來(lái)源[1], 是人類(lèi)蛋白質(zhì)可持續(xù)發(fā)展的重要組成部分, 也是全世界增長(zhǎng)速度最快的食品生產(chǎn)領(lǐng)域[2]。眾多水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物在生長(zhǎng)速度與最終規(guī)格、繁殖行為與性腺價(jià)值、肉質(zhì)與口味、形態(tài)與觀賞價(jià)值等方面表現(xiàn)出明顯的性別二態(tài)性(Sexual dimorphism)[3,4]。這些表現(xiàn)是水產(chǎn)動(dòng)物非常重要的養(yǎng)殖性能, 因此, 水產(chǎn)養(yǎng)殖對(duì)性別控制具有重大需求。性別控制育種是水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種中最重要的育種方式之一, 單性種群養(yǎng)殖能提高魚(yú)體規(guī)格整齊度, 減少不必要的能量消耗, 降低養(yǎng)殖成本, 滿(mǎn)足人民對(duì)于特定性別性腺的需求, 解決親本短缺等問(wèn)題[5]。全世界淡水養(yǎng)殖品種產(chǎn)值前80位的魚(yú)類(lèi)中, 超過(guò)三分之二的種類(lèi)對(duì)單性種群有需求, 包括鮭鱒類(lèi)、四大家魚(yú)、羅非魚(yú)(Oreochromis niloticus)、鱖(Siniperca chuatsi)、鯰類(lèi)、加州鱸(Micropterus salmoides)等[6,7]。在這其中, 部分種類(lèi)單性種群已經(jīng)實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn), 包括全雌虹鱒、全雄羅非魚(yú)、全雌鱖、全雄黃顙魚(yú)等[8],推動(dòng)了養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

黃顙魚(yú)(Tachysurus fulvidraco)屬于鯰形目、鲿科、黃顙魚(yú)屬, 在我國(guó)分布廣泛, 除西部高原及新疆外, 廣布于各個(gè)水系, 野外資源豐富。其無(wú)肌間刺、肉質(zhì)鮮嫩、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高, 養(yǎng)殖地區(qū)已覆蓋全國(guó)27個(gè)省份, 2020年產(chǎn)量達(dá)到56.5×107kg, 全國(guó)淡水魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖產(chǎn)量排名第10位(2021中國(guó)漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒)。在過(guò)去20余年的規(guī)?；B(yǎng)殖過(guò)程中, 2010年認(rèn)定的 “全雄1號(hào)” (黃顙魚(yú)T.fulvidraco♀×YY超雄黃顙魚(yú)T.fulvidraco♂)和2019年認(rèn)定的雜交黃顙魚(yú)“黃優(yōu)1號(hào)” (黃顙魚(yú)T.fulvidraco♀×瓦氏黃顙魚(yú)T.vachelli♂)兩個(gè)國(guó)家審定新品種極大推動(dòng)了黃顙魚(yú)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的穩(wěn)步增長(zhǎng), 是過(guò)去10年時(shí)間內(nèi)產(chǎn)量增長(zhǎng)最快(15.0%)的兩個(gè)淡水養(yǎng)殖種類(lèi)之一(另一個(gè)是加州鱸)。但是目前, 一方面黃顙魚(yú)雌性親本養(yǎng)殖量極度縮減, 另一方面野生種群不可再作為繁殖親本,第三是在黃顙魚(yú)人工繁殖過(guò)程中, 雌性親本死亡率一般高達(dá)30%。這三方面的因素, 導(dǎo)致我國(guó)黃顙魚(yú)雌性親本嚴(yán)重不足。因此, 黃顙魚(yú)母本的短缺, 已成為制約黃顙魚(yú)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展的最重要因素之一。

當(dāng)前黃顙魚(yú)母本的獲得, 是通過(guò)人工繁殖獲得XX雌魚(yú)和XY雄魚(yú)混合群體, 在養(yǎng)殖達(dá)到50 g左右規(guī)格時(shí), 將XY雄魚(yú)通過(guò)生殖突挑出, 留下XX雌魚(yú)繼續(xù)培育至性成熟。這種生產(chǎn)方式效率低下, 浪費(fèi)大量池塘、人力和飼料資源, 也不利于新品種選育工作的開(kāi)展[9,10], 亟須建立黃顙魚(yú)全雌種群的生產(chǎn)體系。黃顙魚(yú)性別決定方式屬于遺傳-環(huán)境共同決定類(lèi)型, 或者更準(zhǔn)確地說(shuō), 是遺傳型性別決定[11,12]同時(shí)受環(huán)境應(yīng)激影響[6,13]。因此, 進(jìn)行全雌黃顙魚(yú)規(guī)模化生產(chǎn), 首先是要誘導(dǎo)XX遺傳型個(gè)體性逆轉(zhuǎn),批量獲得功能性的XX偽雄魚(yú)。早在2013年,Shen等[14,15]發(fā)現(xiàn), 來(lái)曲唑(Letrozole, LZ)處理可以增加黃顙魚(yú)群體的雄性比例, 推測(cè)有XX遺傳型個(gè)體成功性逆轉(zhuǎn)為XX雄魚(yú); 而17α-甲基睪丸酮(17αmethyltestosterone, MT)處理沒(méi)有顯著改變雄性比例, 而是誘導(dǎo)了大量間性個(gè)體的產(chǎn)生。但是在這個(gè)階段, 黃顙魚(yú)性別特異性分子標(biāo)記還未見(jiàn)報(bào)道, 并不能完全確定性逆轉(zhuǎn)的比例及鑒定出性逆轉(zhuǎn)的個(gè)體。此后, 借助黃顙魚(yú)性別特異性分子標(biāo)記[12], 楊天毅等[16]進(jìn)一步確認(rèn)了MT處理導(dǎo)致精巢發(fā)育異常,但LZ能誘導(dǎo)XX個(gè)體雄性化, 并且部分XX偽雄魚(yú)具備繁殖能力。本研究團(tuán)隊(duì)前期發(fā)現(xiàn), 黃顙魚(yú)性別分化關(guān)鍵時(shí)期用33.5℃高溫處理, 能誘導(dǎo)39.1%的XX遺傳型個(gè)體雄性化[6]。這些前期工作, 為黃顙魚(yú)性別控制奠定了重要基礎(chǔ), 但全雌黃顙魚(yú)種群的規(guī)?；庇捌湫韵侔l(fā)育情況還未見(jiàn)報(bào)道。

為了滿(mǎn)足黃顙魚(yú)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)對(duì)母本的大量需求,本研究使用高溫、LZ和MT共同作用誘導(dǎo)黃顙魚(yú)性逆轉(zhuǎn), 獲得了具有繁殖能力的XX偽雄魚(yú), 將其與正常XX母本進(jìn)行規(guī)?；斯し敝? 獲得了57萬(wàn)尾仔魚(yú); 利用性別特異性分子標(biāo)記, 鑒定該群體全部為XX遺傳型; 組織學(xué)結(jié)果表明, XX全雌魚(yú)群體91.9%個(gè)體卵巢發(fā)育正常, 8.1%個(gè)體可能受到池塘高水溫影響而性逆轉(zhuǎn)為XX雄魚(yú)。研究結(jié)果將為黃顙魚(yú)產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展奠定重要基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 XX偽雄魚(yú)制備

普通黃顙魚(yú)雌魚(yú)與雄魚(yú)來(lái)自湖北黃優(yōu)源漁業(yè)發(fā)展有限公司選育群體。選取規(guī)格一致, 無(wú)病無(wú)傷且體質(zhì)健壯的親本進(jìn)行人工繁殖, 受精卵出膜后帶回華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院科研基地進(jìn)行養(yǎng)殖。從3日齡開(kāi)始用豐年蟲(chóng)進(jìn)行投喂, 隨后逐步馴食微粒飼料(山東升索漁用飼料研究中心, 主要成分: 粗蛋白質(zhì)≥50.0%, 粗脂肪>8.0%, 粗纖維≤3.0%, 灰分≤16.5%, 水分≤12.0%, 鈣≤5.0%, 總磷≥1.0%,賴(lài)氨酸≥2.0%)。

為了誘導(dǎo)雌魚(yú)雄性化, 基于實(shí)驗(yàn)室前期研究[6,14,15],我們采取LZ、MT和高溫共同處理黃顙魚(yú)幼魚(yú)。處理?xiàng)l件為300 mg/kg LZ、5 mg/kg MT和33.5℃高溫, 處理時(shí)間為12至65日齡, 覆蓋了整個(gè)黃顙魚(yú)性別分化關(guān)鍵時(shí)期。高溫處理通過(guò)加熱棒實(shí)現(xiàn), 白天每隔6h測(cè)定一次水溫, 以保證高溫的維持和穩(wěn)定。激素飼料的制備是通過(guò)將LZ與MT溶于95%乙醇溶液, 再將配制好的酒精均勻地噴灑在微粒飼料表面,放入通風(fēng)櫥中使酒精自然晾干, 從而將激素有效配制至飼料中; 對(duì)照組飼料同樣用乙醇溶液處理, 所有制備好的飼料均置于4℃條件下備用。對(duì)照組養(yǎng)殖水溫為(26±2)℃。飼料與乙醇的比例參照實(shí)驗(yàn)室之前的配制比例[14,15], 略有調(diào)整, 每100 g飼料使用10—30 mL乙醇溶液。實(shí)驗(yàn)分處理組與對(duì)照組兩個(gè)組, 每組3個(gè)重復(fù), 每個(gè)重復(fù)500尾魚(yú)。

實(shí)驗(yàn)期間魚(yú)苗飼養(yǎng)在360 L的圓形養(yǎng)殖桶中,12—35日齡期間每天投喂3—5次, 35日齡后每日投喂2次, 每天清理殘餌糞便并及時(shí)換注清水。所有實(shí)驗(yàn)魚(yú)65日齡后投喂未經(jīng)處理的黃顙魚(yú)商品飼料,利用加熱棒將水溫維持在(26±2)℃。越冬期間(12月至次年2月)自然降溫, 水溫隨自然水溫波動(dòng),之后利用加熱棒將水溫逐步升至(26±2)℃。此后,在300日齡至330日齡期間, 利用黃顙魚(yú)性別特異分子標(biāo)記, 將XX與XY遺傳型個(gè)體分開(kāi), 轉(zhuǎn)移至1600 L圓形養(yǎng)殖桶飼養(yǎng), 直至性成熟。

1.2 XX偽雄魚(yú)與XX雌魚(yú)人工繁殖及其子代苗種培育

在黃顙魚(yú)繁殖季節(jié), 挑選規(guī)格較大、腹部不膨大的XX偽雄魚(yú)作為后備父本; 解剖后將性腺中有乳白色精巢的個(gè)體作為繁殖父本。為了避免雌性親本中Y染色體的摻入, 我們對(duì)雌性親本進(jìn)行逐尾遺傳性別鑒定, 將XY雌魚(yú)篩選剔除, 保證雌性親本基因型全部為XX。解剖上述獲得的XX偽雄魚(yú), 取乳白色、發(fā)育良好的精巢組織進(jìn)行碾磨; 將達(dá)到效應(yīng)時(shí)間的XX雌魚(yú)進(jìn)行人工擠卵, 按照1.0 g精巢組織與1.5 kg魚(yú)卵的比例人工授精, 在0.3%鹽水條件下混合受精, 加滑石粉脫黏, 轉(zhuǎn)入流水孵化桶進(jìn)行孵化。受精12h后統(tǒng)計(jì)受精率(受精卵數(shù)/總卵粒數(shù)×100%), 出膜后估算孵化率(孵出仔魚(yú)數(shù)/受精卵數(shù)×100%)。

將出膜后的XX全雌魚(yú)水花轉(zhuǎn)移至水泥池, 暫養(yǎng)3d, 待魚(yú)苗平游后轉(zhuǎn)移至面積為4000 m2、深2.0 m的池塘中進(jìn)行苗種培育, 下塘7d開(kāi)始馴食人工配合飼料, 下塘20d時(shí)投喂黃顙魚(yú)商品飼料, 開(kāi)展大規(guī)格苗種培育及成魚(yú)養(yǎng)殖。

1.3 遺傳型性別鑒定

普通黃顙魚(yú)雌雄親本及其子代、偽雄魚(yú)及與其繁殖的雌性親本均利用黃顙魚(yú)性別特異性分子標(biāo)記進(jìn)行遺傳型性別鑒定。采用異丙醇沉淀法快速提取背鰭DNA[17]。利用Dan等[12]研發(fā)的性別特異分子標(biāo)記(XY-F: 5′-GATTGTAGAAGCCATCT CCTTAGCGTA-3′; XY-R: 5′-CATGTAGATCACTG TACAATCCCG-3′)鑒定每尾魚(yú)的遺傳型性別。PCR反應(yīng)體系為10 μL: 上下游引物各0.5 μL; 模板DNA 1.0 μL; 2×TaqPCR Master Mix 5.0 μL(康為世紀(jì)); ddH2O 3.0 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)? 94℃預(yù)變性3min, 34個(gè)循環(huán)(94℃變性30s, 59℃退火30s, 72℃延伸40s), 72℃延伸5min。擴(kuò)增完成后, 取PCR產(chǎn)物3 μL, 以DL2000 marker(康為世紀(jì))作為參照, 利用凝膠成像系統(tǒng)依據(jù)片段長(zhǎng)度鑒別出XX(一條帶,955 bp)與XY(2條帶, 分別為826和955 bp)基因型。

1.4 表型性別鑒定與性腺組織學(xué)觀察

取實(shí)驗(yàn)組XX基因型個(gè)體繁殖季節(jié)(300日齡)性腺組織, 從外觀上區(qū)分雌性、雄性與間性(性腺中同時(shí)具有精巢和卵巢組織的個(gè)體), 雄性與雌性組織分別取精巢、卵巢部分, 間性性腺組織取卵巢、精巢與連接部分; 隨機(jī)取池塘養(yǎng)殖XX全雌魚(yú)60日齡和120日齡個(gè)體性腺組織, 保存于Bouin’s液中固定, 48h后轉(zhuǎn)入70%乙醇常溫保存。性腺組織學(xué)處理及樣品拍攝參照齊飄飄的處理方法[18], 樣品通過(guò)梯度乙醇脫水、二甲苯透明和石蠟包埋后, 連續(xù)切片(切片厚度5—6 μm), 用蘇木精-伊紅染色(HE染色), 中性樹(shù)膠封片, 自然晾干。使用連接成像系統(tǒng)(MShot Image Analysis System)的光學(xué)顯微鏡進(jìn)行性腺組織的觀察與拍攝, 結(jié)合性腺外觀, 鑒定個(gè)體表型性別, 判斷性腺發(fā)育狀態(tài)。各發(fā)育階段性腺中生殖細(xì)胞的鑒別參照本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)黃顙魚(yú)性別分化及性腺發(fā)育的組織學(xué)觀察研究[6,9,13—15]。

1.5 XX偽雄魚(yú)與XY雄魚(yú)精子活力比較分析

麻醉后解剖XX偽雄魚(yú)與對(duì)照組XY雄魚(yú), 取精巢, 將其剪開(kāi)后收集精液樣本, 用Hank’s平衡液稀釋。XX偽雄魚(yú)與XY雄魚(yú)各取3尾, 每尾魚(yú)的精液樣本進(jìn)行3次技術(shù)性重復(fù)。通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助精子分析系統(tǒng)(Computer-Aided Sperm Analysis, CASA)對(duì)精子活力進(jìn)行檢測(cè), 拍攝精子運(yùn)動(dòng)過(guò)程, 統(tǒng)計(jì)第2s、4s、6s、8s、10s和12s時(shí)3個(gè)常用的精子活力運(yùn)動(dòng)參數(shù), 即平均路徑速度(Average Path Velocity,VAP)、直線運(yùn)動(dòng)速度(Velocity Straight Line, VSL)和曲線運(yùn)動(dòng)速度(Curvilinear Velocity, VCL), 記錄每次運(yùn)動(dòng)中不同運(yùn)動(dòng)類(lèi)型精子的比例。

1.6 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS (IBM SPSS Statistics 26)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析, 用單因素方差分析(Oneway ANOVA)進(jìn)行體指標(biāo)和精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)的差異顯著性檢驗(yàn), 用t檢驗(yàn)進(jìn)行受精率和孵化率的差異顯著性檢驗(yàn), 分析前進(jìn)行數(shù)據(jù)正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn), 利用Duncan’s多重比較確定組間差異的顯著性,P<0.05時(shí)表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。文中的數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)表示。

2 結(jié)果

2.1 LZ、MT與高溫共同處理對(duì)XX個(gè)體雄性化的影響

通過(guò)性別特異分子標(biāo)記、性腺外部形態(tài)與組織學(xué), 我們將實(shí)驗(yàn)處理組XX遺傳型中性別發(fā)生逆轉(zhuǎn)和具備繁殖能力的個(gè)體分為三種表型, 即完全逆轉(zhuǎn)型(性腺完全逆轉(zhuǎn)為精巢, XX偽雄魚(yú))、多精少卵型(XX間性個(gè)體, 精巢面積≥50%)與少精多卵型(XX間性個(gè)體, 精巢面積＜50%)。XX偽雄魚(yú)的性腺指數(shù)(GSI)顯著低于XY雄魚(yú)(P＜0.05), 但三種XX偽雄魚(yú)之間GSI差異不顯著(表1)。實(shí)驗(yàn)處理組XY與XX遺傳型比例分別為48.0%和52.0%, 其中完全逆轉(zhuǎn)型XX比例為8.0%, XX間性個(gè)體比例為14.0%。對(duì)照組XY與XX遺傳型比例分別為46.0%與54.0%, 沒(méi)有觀察到性別發(fā)生逆轉(zhuǎn)或性腺發(fā)育異常的個(gè)體。

表1 黃顙魚(yú)性別逆轉(zhuǎn)XX個(gè)體與XY雄魚(yú)體指標(biāo)比較分析Tab.1 Comparative analysis of body index of XX pseudo-male and XY male

黃顙魚(yú)繁殖季節(jié)期間, 對(duì)照組XY雄魚(yú)精巢發(fā)育至Ⅳ期(圖1A), 呈乳白色, 具有鯰形目魚(yú)類(lèi)精巢典型的分枝狀結(jié)構(gòu), 分枝狀結(jié)構(gòu)中精液充盈, 剪開(kāi)精巢有白色精液流出; 通過(guò)組織切片可觀察到大量精小囊結(jié)構(gòu), 其中存在大量精子細(xì)胞(圖1A1和圖1A1′)。完全性逆轉(zhuǎn)的XX偽雄魚(yú)精巢發(fā)育稍滯后, 精巢分枝結(jié)構(gòu)較少, 發(fā)育至Ⅳ期, 乳白色精巢組織中有精液存在(圖1B), 通過(guò)組織學(xué)切片觀察到精巢中存在大量成熟精子和不同發(fā)育時(shí)期的精原細(xì)胞, 精小葉結(jié)構(gòu)異常(圖1B1和圖1B1′)。兩種類(lèi)型XX間性個(gè)體中(多精少卵型和少精多卵型), 精巢部分有少量分枝狀結(jié)構(gòu), 剪開(kāi)精巢有白色精液流出,通過(guò)組織學(xué)切片觀察到精巢結(jié)構(gòu)中存在大量成熟精子; 卵巢部分發(fā)育正常, 肉眼可見(jiàn)成熟卵粒, 卵母細(xì)胞中觀察到大量卵黃顆粒(圖1C和圖1D)。

圖1 黃顙魚(yú)XX偽雄魚(yú)與XY雄魚(yú)性腺形態(tài)及組織學(xué)比較Fig.1 Gonadal morphology and histology of XX male and XY male in yellow catfish

2.2 XX偽雄魚(yú)生殖能力鑒定

為了評(píng)估XX雄魚(yú)的生殖能力, 我們對(duì)發(fā)生逆轉(zhuǎn)的XX個(gè)體與XY雄魚(yú)的精子活力進(jìn)行了比較分析(圖2)。結(jié)果顯示, 完全逆轉(zhuǎn)型的XX雄魚(yú)與XY雄魚(yú)在不同精子運(yùn)動(dòng)類(lèi)型、VAP(平均路徑速度, Average Path Velocity)、VSL(直線運(yùn)動(dòng)速度, Straight Line Velocity)和VCL(曲線運(yùn)動(dòng)速度, Curvilinear Velocity)方面均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。XY雄魚(yú)與完全逆轉(zhuǎn)型XX雄魚(yú)的運(yùn)動(dòng)型精子比例顯著高于少精多卵型XX個(gè)體 (P＜0.05)。前進(jìn)型精子[19](Progressive, 精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)符合VAP＞50 μm/s, 前進(jìn)型ASL/VAP＞80%)中, 完全逆轉(zhuǎn)型XX雄魚(yú)顯著高于少精多卵型XX個(gè)體, 而慢速型運(yùn)動(dòng)精子[19](Slow, 精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)符合0

圖2 黃顙魚(yú)XX偽雄魚(yú)與XY雄魚(yú)精子活力比較分析Fig.2 Comparative analysis of sperm motility between XX pseudo-male and XY male in yellow catfish

2.3 全雌黃顙魚(yú)規(guī)模化繁育

利用上述具有繁殖能力的XX偽雄魚(yú)共開(kāi)展了兩個(gè)批次的全雌黃顙魚(yú)規(guī)?；庇ぷ? 共孵出57萬(wàn)尾黃顙魚(yú)仔魚(yú)(表2)。以XX偽雄魚(yú)為父本的人工繁殖, 其受精率和孵化率平均分別為58.8%與69.6%, 與正常XY雄魚(yú)為父本的人工繁殖相比, 受精率與孵化率在統(tǒng)計(jì)學(xué)上均無(wú)顯著性差異 (圖3A和圖3B)。

圖3 黃顙魚(yú)XX偽雄魚(yú)和XY雄魚(yú)作為父本的人工繁殖受精率與孵化率比較Fig.3 Comparison of fertilization rate and hatching rate between XX pseudo-male and XY male as male parents in yellow catfish

表2 全雌黃顙魚(yú)規(guī)?；敝趁骷?xì)Tab.2 Breeding details of the all-female yellow catfish population

為觀察夏季自然高溫條件下全雌黃顙魚(yú)種群性別分化和性腺發(fā)育情況, 我們記錄了培育池塘6—9月份每日最高氣溫, 及幼魚(yú)0至60日齡期間池塘水深1m處的水溫。圖4A顯示, 在黃顙魚(yú)0—60日齡期間, 池塘平均水溫為30.6℃, 有8d時(shí)間水溫超過(guò)33.5℃。在幼魚(yú)60日齡和120日齡時(shí), 我們對(duì)隨機(jī)采樣所獲的共計(jì)172尾幼魚(yú)進(jìn)行了遺傳型性別鑒定, 部分結(jié)果如圖4B所示, 所有幼魚(yú)基因型性別均為XX(圖4B)。

圖4 池塘養(yǎng)殖溫度記錄及全雌黃顙魚(yú)種群基因型性別鑒定Fig.4 Pond temperature records and genotypic sex identification of the all-female yellow catfish population

對(duì)全雌黃顙魚(yú)幼魚(yú)60日齡和120日齡分別進(jìn)行了取樣觀察, 發(fā)現(xiàn)在60日齡時(shí), 97.2%的個(gè)體性腺發(fā)育正常, 呈透明棒狀, 組織切片觀察可發(fā)現(xiàn)大量初級(jí)卵母細(xì)胞, 細(xì)胞核與核仁明顯(圖5)。剩余2.8%的XX個(gè)體發(fā)生了性逆轉(zhuǎn), 精巢組織中可見(jiàn)精原細(xì)胞和初級(jí)精母細(xì)胞, 也能觀察到精小囊結(jié)構(gòu)。至120日齡時(shí), 100尾幼魚(yú)中88.0%的個(gè)體卵巢發(fā)育正常, 部分個(gè)體可觀察到黃色卵粒, 組織學(xué)結(jié)果顯示,卵母細(xì)胞中充滿(mǎn)卵黃顆粒, 處在卵黃積累期。剩余12.0%的XX個(gè)體發(fā)生了性逆轉(zhuǎn), 其中少部分個(gè)體精巢呈典型的分枝狀, 組織學(xué)觀察到大量的精小囊結(jié)構(gòu), 精巢中觀察到精原細(xì)胞、精母細(xì)胞及非常少量稀疏的精子細(xì)胞, 精巢發(fā)育異常; 大部分個(gè)體精巢呈透明狀、無(wú)分枝, 組織學(xué)觀察到精小囊結(jié)構(gòu)異常,并且存在少量卵母細(xì)胞。黃顙魚(yú)幼魚(yú)60日齡時(shí),XX雌魚(yú)全長(zhǎng)與體重顯著低于XX雄魚(yú), 但養(yǎng)殖至120日齡時(shí), 兩者差異不顯著(圖5)。

3 討論

為了解決全國(guó)黃顙魚(yú)雌性親本短缺問(wèn)題, 我們利用XX雄魚(yú)與XX雌魚(yú)進(jìn)行全雌黃顙魚(yú)規(guī)?；庇芯? 獲得了57萬(wàn)尾基因型全部為XX的黃顙魚(yú)仔魚(yú), 并將其成功培育成大規(guī)格魚(yú)種, 研究結(jié)果同時(shí)將為雜交黃顙魚(yú)的遺傳育種提供豐富的選育材料。

3.1 黃顙魚(yú)XX遺傳型個(gè)體雄性化

魚(yú)類(lèi)的性別具有很強(qiáng)的可塑性, 性別分化關(guān)鍵時(shí)期易受到外源激素, 包括雌激素、雄激素、性激素合成酶抑制劑、性類(lèi)固醇受體拮抗劑及具有類(lèi)似功能的物質(zhì)的影響, 也易受到環(huán)境應(yīng)激條件, 包括應(yīng)激性溫度(包括高溫與低溫)、高密度、低溶氧和環(huán)境背景色等的影響[3,4,6,20]。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì), 為了直接或間接獲得單性種群, 全世界有超過(guò)27種性逆轉(zhuǎn)藥物在超過(guò)100種魚(yú)類(lèi)中使用, 其中在多種經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)中都成功獲得了單性種群[4]。黃顙魚(yú)的性別決定方式主要是遺傳型性別決定, 性別決定類(lèi)型為雄性個(gè)體異形, 即XX/XY[21], 同時(shí)明顯受到高溫等極端環(huán)境因素的影響[6]。因此, 生產(chǎn)全雌黃顙魚(yú)的關(guān)鍵在于成功誘導(dǎo)XX個(gè)體雄性化, 以及性逆轉(zhuǎn)XX雄魚(yú)具備正常繁殖能力。

早在2013年, Shen等[14]首次報(bào)道了一種芳香化酶抑制劑LZ(Letrozole, 來(lái)曲唑)在黃顙魚(yú)性別分化關(guān)鍵時(shí)期(10—59日齡)能顯著提高群體雄性率, 并且雄性率與LZ濃度呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系。隨后, Shen等[15]又報(bào)道了人工合成的雄激素MT(17α-methyltestosterone, 17α-甲基睪丸酮)并不能顯著提高黃顙魚(yú)雄性率, 但是誘導(dǎo)了大量間性個(gè)體的產(chǎn)生, 精巢呈現(xiàn)大量空腔結(jié)構(gòu), 生殖細(xì)胞稀疏。在這兩項(xiàng)研究開(kāi)展過(guò)程中, 黃顙魚(yú)的性別特異分子標(biāo)記還未開(kāi)發(fā), 只能通過(guò)性別比例和組織學(xué)初步判斷性逆轉(zhuǎn)的效果。此后, 楊天毅等[16]也嘗試了用MT和LZ對(duì)黃顙魚(yú)幼魚(yú)進(jìn)行處理, 得到了相似的結(jié)論。結(jié)合黃顙魚(yú)性別特異分子標(biāo)記[12], 楊天毅等[16]發(fā)現(xiàn), 各濃度MT處理的XX個(gè)體性腺為空腔狀精小囊結(jié)構(gòu), 沒(méi)有精子生成, 而LZ能將XX個(gè)體誘導(dǎo)為正常XX雄魚(yú),具有較好繁殖能力。此外, Yu等[6]發(fā)現(xiàn), 黃顙魚(yú)性別分化關(guān)鍵時(shí)期經(jīng)3.5周的高溫處理(33.5℃)能誘導(dǎo)39.1%的XX個(gè)體雄性化, 但大部分XX雄魚(yú)精巢發(fā)育異常, 未觀察到精小囊結(jié)構(gòu), 推測(cè)大部分個(gè)體不具備生殖能力。但是溫度處理作為一種環(huán)境友好型的性逆轉(zhuǎn)方法, 為魚(yú)類(lèi)性別控制提供了新的思路,有望建立環(huán)境友好型性別控制方法。

因此, 基于以上前期研究結(jié)果, 本實(shí)驗(yàn)利用三種雄性化因素(包括MT、LZ和高溫)進(jìn)行聯(lián)合處理, 獲得了完全逆轉(zhuǎn)型XX和XX間性個(gè)體, 其中完全逆轉(zhuǎn)型XX占XX基因型的8.0%, 比例偏低, 但其精巢發(fā)育較好, 組織學(xué)切片能觀察到大量精子細(xì)胞, 推測(cè)其具有繁殖能力。到目前為止, 所有研究表明, 用激素單獨(dú)處理或聯(lián)合處理誘導(dǎo)黃顙魚(yú)XX個(gè)體性逆轉(zhuǎn)并產(chǎn)生具有正常繁殖能力的XX雄魚(yú)比例仍然偏低, 這可能與黃顙魚(yú)遺傳型性別決定機(jī)制較穩(wěn)定有關(guān)。楊天毅等[16]利用LZ處理黃顙魚(yú)幼魚(yú), 發(fā)現(xiàn)1000 mg/kg處理組正常發(fā)育精巢比例為35.7%, 這個(gè)處理劑量對(duì)于魚(yú)類(lèi)性逆轉(zhuǎn)的研究來(lái)說(shuō)是非常高的處理濃度[8]。此外, 上述提到, Yu等[6]利用高溫誘導(dǎo)了39.1%的XX個(gè)體雄性化, 但性成熟階段時(shí), 絕大部分XX雄魚(yú)精巢發(fā)育異常。這些結(jié)果表明, 黃顙魚(yú)雌性性別決定基因非常強(qiáng)大, 大部分個(gè)體都對(duì)雄性化因素處理有抵抗作用, 即便本研究將3種雄性化因素聯(lián)合進(jìn)行處理, 完全性逆轉(zhuǎn)的比例也不高。需要特別指出的是, MT作為一種人工合成的雄激素, 可能不適合誘導(dǎo)黃顙魚(yú)XX個(gè)體雄性化。這在多數(shù)魚(yú)類(lèi)中都有相似報(bào)道, 包括大西洋鮭(Salmo salar)[22]、石斑魚(yú)(Epinephelus coioides)[23]和雌核發(fā)育的鯽[24]等, 可能是因?yàn)镸T在魚(yú)體內(nèi)代謝過(guò)程中被芳構(gòu)化, 從而產(chǎn)生雌激素和雌性化效應(yīng)[25,26], 也可能是因?yàn)橥庠葱奂に氐膽?yīng)用導(dǎo)致內(nèi)源雄激素合成減少[25,27]。因此應(yīng)當(dāng)將MT替換成不能被芳構(gòu)化的雄激素, 比如17α-methyldihydrotestosterone。后續(xù)研究需要同時(shí)考慮降低雌性分化相關(guān)基因表達(dá)或雌激素水平, 同時(shí)提高雄性分化相關(guān)基因表達(dá)或雄激素水平, 從而提高XX完全雄性化效率。

3.2 XX偽雄魚(yú)個(gè)體的繁殖能力

黃顙魚(yú)性別特異分子標(biāo)記未報(bào)道時(shí), Shen等[14,15]發(fā)現(xiàn)LZ處理可以增加黃顙魚(yú)群體雄性比例, 推測(cè)有XX遺傳型個(gè)體成功性逆轉(zhuǎn)為XX偽雄魚(yú); 此后, 齊飄飄等[13]借助性別特異性分子標(biāo)記, 發(fā)現(xiàn)黃顙魚(yú)在高溫或皮質(zhì)醇處理后, 部分XX偽雄魚(yú)表現(xiàn)出雄性第二性征, 性腺出現(xiàn)典型精小葉結(jié)構(gòu), 少數(shù)能觀察到精子細(xì)胞。楊天毅等[16]利用高濃度LZ投喂黃顙魚(yú)可誘導(dǎo)XX個(gè)體雄性化, 部分XX偽雄魚(yú)具備繁殖能力。以上研究為黃顙魚(yú)的雄性化奠定了重要基礎(chǔ), 但未曾對(duì)性逆轉(zhuǎn)所得XX偽雄魚(yú)的繁殖能力做出評(píng)估。

精子運(yùn)動(dòng)速度、持續(xù)時(shí)間和運(yùn)動(dòng)類(lèi)型是判斷精液質(zhì)量和受精率高低的主要參數(shù)[28], 運(yùn)動(dòng)精子和前進(jìn)型運(yùn)動(dòng)精子百分比可以說(shuō)明精子樣本質(zhì)量總體概況[29]。Senior等[30]對(duì)激素誘導(dǎo)的偽雄魚(yú)(基因型雌魚(yú))和正常雄魚(yú)之間精子特征進(jìn)行了系統(tǒng)綜述,經(jīng)大量數(shù)據(jù)分析后發(fā)現(xiàn), 偽雄魚(yú)與正常雄魚(yú)在排精量、運(yùn)動(dòng)精子百分比或持續(xù)時(shí)間等方面無(wú)顯著差異, 推測(cè)在不同性別決定類(lèi)型魚(yú)類(lèi)中, 偽雄魚(yú)可能具備與遺傳型雄魚(yú)相當(dāng)?shù)姆敝衬芰? 這對(duì)于全雌種群生產(chǎn)至關(guān)重要。例如, 七帶石斑魚(yú)(Epinephelus septemfasciatus)和橙點(diǎn)石斑魚(yú)(Epinephelus Coioides)在MT誘導(dǎo)性逆轉(zhuǎn)后, 運(yùn)動(dòng)精子百分比與對(duì)照雄魚(yú)無(wú)異, 精子濃度相似, 最終受精率與孵化率也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[31—34]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與前人描述相似,完全性逆轉(zhuǎn)的XX偽雄魚(yú)與XY雄魚(yú)不同精子運(yùn)動(dòng)類(lèi)型間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05), XX偽雄魚(yú)的完全逆轉(zhuǎn)型中, 前進(jìn)型精子運(yùn)動(dòng)能力甚至略高于XY雄魚(yú)(圖2), 說(shuō)明黃顙魚(yú)偽雄魚(yú)可能與遺傳型雄魚(yú)的生殖性能相當(dāng)[30]。需要特別指出的是, 本實(shí)驗(yàn)中,激素誘導(dǎo)的性逆轉(zhuǎn)個(gè)體中存在大量XX間性個(gè)體,這表明誘導(dǎo)效率未達(dá)到理想狀態(tài), 但是這些個(gè)體的精巢部分也具備授精能力。總之, 開(kāi)展全雌黃顙魚(yú)規(guī)?；庇暮诵氖侨绾胃咝Й@得完全性逆轉(zhuǎn)的,具備授精能力的XX偽雄魚(yú)。

3.3 XX全雌黃顙魚(yú)規(guī)?；庇?/h3>

黃顙魚(yú)2020年全國(guó)產(chǎn)量達(dá)56.5×107kg, 屬于小型魚(yú)類(lèi), 產(chǎn)量的持續(xù)增長(zhǎng)對(duì)親本數(shù)量的需求不斷增長(zhǎng)。黃顙魚(yú)屬于分批產(chǎn)卵魚(yú)類(lèi), 為了提高產(chǎn)卵率和產(chǎn)卵量, 通常催產(chǎn)劑的劑量較其他魚(yú)類(lèi)高, 且腹部擠壓力度較大, 對(duì)雌性親本損傷大, 死亡率達(dá)50%以上, 即便是操作規(guī)范的繁殖場(chǎng), 母本催產(chǎn)后死亡率也通常高達(dá)30%。加上全雄黃顙魚(yú)和雜交黃顙魚(yú)養(yǎng)殖的普及, 雌性親本嚴(yán)重缺乏。按照當(dāng)前黃顙魚(yú)產(chǎn)量和苗種存活率估算, 全國(guó)每年黃顙魚(yú)母本需求量達(dá)1×106kg。因此, 開(kāi)展全雌黃顙魚(yú)規(guī)模化繁育對(duì)黃顙魚(yú)產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展意義深遠(yuǎn), 也對(duì)黃顙魚(yú)新品種選育至關(guān)重要。

本研究首次利用MT、LZ和高溫誘導(dǎo)的XX偽雄魚(yú)為父本開(kāi)展全雌黃顙魚(yú)規(guī)?；庇? 其受精率和孵化率分別為58.8%與69.6%, 獲得了基因型為XX的全雌黃顙魚(yú)仔魚(yú)57萬(wàn)尾。全雌黃顙魚(yú)苗種在池塘中生長(zhǎng)情況良好, 對(duì)60日齡和120日齡共計(jì)172尾魚(yú)隨機(jī)取樣分析發(fā)現(xiàn), 92%XX雌魚(yú)性腺發(fā)育正常。120日齡時(shí), 卵巢已發(fā)育至卵母細(xì)胞成熟期,卵巢呈黃棕色, 肉眼可見(jiàn)大量顆粒狀卵粒(圖5C)。組織學(xué)結(jié)果顯示, XX雌魚(yú)的卵粒中卵黃物質(zhì)持續(xù)增加, 卵黃顆粒相互融合。這一卵巢發(fā)育水平比齊飄飄等[13]在黃顙魚(yú)雌魚(yú)120日齡時(shí)觀察到的初級(jí)卵母細(xì)胞發(fā)育更快, 與王凌宇等[9]報(bào)道的300日齡黃顙魚(yú)卵巢呈現(xiàn)的結(jié)果相似, 預(yù)計(jì)在良好池塘培育條件下, 該批次全雌黃顙魚(yú)中較大個(gè)體在來(lái)年繁殖季節(jié)能作為母本開(kāi)展繁殖和選育工作。以上結(jié)果表明,通過(guò)性逆轉(zhuǎn)的XX偽雄魚(yú)與正常XX雌魚(yú)進(jìn)行人工繁殖, 可實(shí)現(xiàn)全雌黃顙魚(yú)的規(guī)?；a(chǎn)。本研究結(jié)果為全雌黃顙魚(yú)繁育體系的建立提供了重要基礎(chǔ)。

3.4 環(huán)境應(yīng)激對(duì)黃顙魚(yú)全雌種群性別分化的影響

在本研究中, 由于XX偽雄魚(yú)在室內(nèi)養(yǎng)殖系統(tǒng)中養(yǎng)殖, 生長(zhǎng)速度較池塘慢, 導(dǎo)致全雌黃顙魚(yú)繁育工作延后, 水花下塘?xí)r正值湖北地區(qū)高溫期, 全雌黃顙魚(yú)性別分化期間(12—45日齡)水溫較高。在60日齡和120日齡時(shí)取樣發(fā)現(xiàn), 分別有2.8%和12.0%的個(gè)體發(fā)生了不同程度的雄性化, 與此前Yu等[6]報(bào)道的33.5℃高溫誘導(dǎo)XX個(gè)體性逆轉(zhuǎn)相似,性逆轉(zhuǎn)個(gè)體的組織學(xué)結(jié)構(gòu)也與Yu等[6]報(bào)道的極為相似。在全雌黃顙魚(yú)0—60日齡期間, 池塘平均水溫為30.6℃, 期間有8d時(shí)間水溫超過(guò)33.5℃, 推測(cè)黃顙魚(yú)幼魚(yú)受高溫影響而發(fā)生性逆轉(zhuǎn)。因此, 要獲得基因型和遺傳型為雌魚(yú)的全雌黃顙魚(yú)群體, 應(yīng)當(dāng)避免池塘高溫期間開(kāi)展苗種培育。另一方面, 也可能是XX偽雄魚(yú)后代性逆轉(zhuǎn)的臨界溫度閾值降低, 從而在池塘高溫條件下發(fā)生了雄性化。在羅非魚(yú)和半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)中, 與遺傳雄性的后代相比, 由溫度反轉(zhuǎn)偽雄魚(yú)繁殖的后代在高溫下表現(xiàn)出更高的轉(zhuǎn)雄率, 其后代在常溫狀態(tài)下也可能會(huì)發(fā)生自然性逆轉(zhuǎn)[35,36]。當(dāng)然, 也可能是兩方面共同作用的結(jié)果。因此需要更深入研究XX偽雄魚(yú)子代發(fā)生性逆轉(zhuǎn)的遺傳學(xué)與表觀遺傳學(xué)機(jī)制, 從而更有效地開(kāi)展全雌黃顙魚(yú)繁育工作。

從另一方面來(lái)講, 溫度誘導(dǎo)的雄性化, 為環(huán)境友好型性別控制技術(shù)體系的建立提供了基礎(chǔ)。全世界重要經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)的單性種群生產(chǎn)體系中, 絕大部分要使用性類(lèi)固醇激素或類(lèi)似物, 其殘留或代謝產(chǎn)物對(duì)自然環(huán)境存在潛在的負(fù)面影響, 這種生產(chǎn)方式不符合水產(chǎn)養(yǎng)殖綠色發(fā)展的大方向。因此, 環(huán)保型單性種群的生產(chǎn)方法亟待建立。后續(xù)我們將進(jìn)一步研究池塘高溫培育條件下產(chǎn)生的XX偽雄魚(yú), 分析其繁殖能力, 為黃顙魚(yú)環(huán)境友好型性別控制技術(shù)體系的建立提供依據(jù)。