劉麗丹, 蔣先明, 應(yīng)茜茜, 樂曉偉, 尤光賢

臺州市腫瘤醫(yī)院放療科(浙江臺州 317502)

臨床醫(yī)學(xué)將原發(fā)于機(jī)體胃黏膜上皮組織的惡性腫瘤定義為胃癌，因其高發(fā)病率、高病死率的特點(diǎn)而位居十大惡性腫瘤之首[1-2]。據(jù)相關(guān)流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，我國胃癌癥狀發(fā)病具有明顯的性別、地域差異性，中老年男性為胃癌癥狀高發(fā)群體，近年來，隨著社會發(fā)展，人們生活習(xí)慣、壓力的變化，我國胃癌發(fā)病率連年上升，并呈現(xiàn)年輕化趨勢，引起廣大專家學(xué)者的關(guān)注[3-4]。胃癌癥狀早期并無特異性臨床表現(xiàn)，致使胃癌早期診斷率較低，隨著胃癌癥狀不斷發(fā)生演進(jìn)，病情不斷惡化，對患者臨床治療、預(yù)后造成嚴(yán)重影響，因此在發(fā)病早期對胃癌進(jìn)行及時的診斷、治療對患者病情恢復(fù)、預(yù)后改善具有重要意義[5-6]。本研究中對胃癌患者手術(shù)切除癌組織標(biāo)本中miR-451、miR-133a-3p、miR-96表達(dá)水平進(jìn)行檢測，旨在探究三者表達(dá)變化與胃癌病理特征之間的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年11月至2020年11月于我院進(jìn)行手術(shù)治療的胃癌患者93例，包括男51例，女42例，年齡53～68歲，平均(60.5±5.9)歲。其中包括淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移49例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移44例；浸潤情況：黏膜層浸潤66例，漿膜層浸潤27例；病理分期：Ⅰ期患者42例，Ⅱ期患者28例，Ⅲ期患者17例，Ⅳ期患者6例；癌組織分化程度：高分化62例，中分化19例，低分化12例。本研究所有患者及家屬均知情同意，并獲我院倫理委員會批準(zhǔn)(編號：2019-XM-3)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：均符合中華醫(yī)學(xué)會對胃癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]，首次確診，病歷資料齊全。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)接受放化療等治療者；(2)重度高血壓、心臟病患者；(3)肝腎功能障礙者；(4)手術(shù)禁忌證患者；(5)并發(fā)其他惡性腫瘤患者；(6)精神異常者。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集、免疫組化染色 收取患者手術(shù)切除癌組織、距癌組織5 cm癌旁組織制作標(biāo)本進(jìn)行固定、石蠟包埋處理，3 μm厚度連續(xù)切片，切片脫蠟、水化后清洗3次，3 min/次，之后使用100℃枸櫞酸緩沖液(0.01 mol/L)浸泡修復(fù)，15 min后取出冷卻，PBS液清洗。滴加POD阻斷劑，室溫培養(yǎng)0.5 h后PBS清洗3次，滴加山羊血清，26℃環(huán)境中培養(yǎng)0.5 h，滴加一抗后過夜孵育，取出后PBS液清洗，滴加二抗，常溫孵育，30 min后使用PBS清洗，添加鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液后再次培養(yǎng)30 min，PBS液清洗，滴加DAB溶液后蘇木精染核，反藍(lán)、脫水處理后封片。

1.2.2 miR-451、miR-133a-3p、miR-96表達(dá)檢測 RT-PCR檢測miR-451、miR-133a-3p、miR-96表達(dá)。提取細(xì)胞總RNA并對純度、含量進(jìn)行檢測，逆轉(zhuǎn)錄處理，2-ΔΔCt方法計(jì)算，內(nèi)參U6。U6引物序列：上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。miR-451引物序列：上游引物：5′-CCGCTCGAGCCGGCCTTC-CAACCTTTGTC-3′,下游引物：5′-GAATGCGGCCGCTCCCATCATCAAT-ATTTATTGAGCATTTAC-3′。miR-133a-3p引物序列：上游引物：5′-CGAGCCTTTGGTCCCCTTCAAC-3′,下游引物：5′-TCAACTGCTGGTGTCGTGGAGTCGGC-3′。miR-96引物序列：上游引物：5′-AATGCGGGGCTAGGGCTA-3′,下游引物：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。

2 結(jié)果

2.1 癌組織、癌旁組織中miR-451、miR-133a-3p、miR-96表達(dá)水平比較 癌組織中miR-451、miR-133a-3p表達(dá)水平低于癌旁組織，miR-96表達(dá)水平高于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見表1和圖1～2。

表1 癌組織、癌旁組織中miR-451、miR-133a-3p、miR-96表達(dá)比較

注：A:miR-451; B:miR-133a-3p; C:miR-96

注：A:miR-451; B:miR-133a-3p; C:miR-96

2.2 不同性別、年齡胃癌患者miR-451、miR-133a-3p、miR-96表達(dá)比較 不同性別(男、女)、年齡(>60歲、≤60歲)患者癌組織中miR-451、miR-133a-3p、miR-96表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 不同性別、年齡胃癌患者miR-451、miR-133a-3p、miR-96表達(dá)比較

2.3 不同病理特征患者miR-451、miR-133a-3p、miR-96表達(dá)比較 有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者miR-451、miR-133a-3p表達(dá)水平低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，miR-96表達(dá)水平高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與黏膜層浸潤患者相比，漿膜層浸潤患者miR-451、miR-133a-3p表達(dá)水平較低，miR-96表達(dá)水平較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Ⅲ、Ⅳ期胃癌患者miR-451、miR-133a-3p表達(dá)水平低于Ⅰ、Ⅱ期患者，miR-96表達(dá)水平高于Ⅰ、Ⅱ期患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與高分化患者相比，中、低分化胃癌患者miR-451、miR-133a-3p表達(dá)水平較低，miR-96表達(dá)水平較高，與中分化患者相比，低分化胃癌患者miR-451、miR-133a-3p表達(dá)水平較低，miR-96表達(dá)水平較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 miR-451、miR-133a-3p、miR-96表達(dá)與胃癌患者病理特征的關(guān)系

2.4 胃癌癌組織中miR-451、miR-133a-3p、miR-96表達(dá)相關(guān)性 胃癌組織中miR-451、miR-133a-3p表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.262，P=0.011)；miR-451、miR-96表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.228，P=0.028)；miR-133a-3p、miR-96表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.301，P=0.003)。見圖3。

圖3 胃癌癌組織中miR-451、miR-133a-3p、miR-96表達(dá)相關(guān)性

3 討論

據(jù)世衛(wèi)組織調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，胃癌發(fā)病率、病死率在所有惡性腫瘤中排名居于前兩位，因其較高的惡性程度導(dǎo)致治療難度大、患者預(yù)后差[8-9]。中老年男性為胃癌癥狀高發(fā)群體，并逐漸出現(xiàn)年輕化趨勢，胃癌發(fā)病前期無特異性表現(xiàn)，隨著病情進(jìn)展，患者大多表現(xiàn)為消化道出血、上腹部疼痛等，嚴(yán)重影響患者健康和預(yù)后[10-11]。胃癌癥狀發(fā)病的常見病因包括生活飲食習(xí)慣、遺傳、癌前病變等，但是目前臨床醫(yī)學(xué)尚未將胃癌病理機(jī)制研究透徹，越來越多的專家學(xué)者開始通過分子生物學(xué)、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)等途徑對胃癌發(fā)病機(jī)制進(jìn)行研究[12-13]。

微小RNA(miRNA)廣泛存在于多數(shù)生物體之中，miRNA表達(dá)變化與微生物感染、炎癥反應(yīng)及機(jī)體免疫狀態(tài)等病理學(xué)改變均具有一定相關(guān)性。大量研究結(jié)果表明，miRNA家族成員與細(xì)胞凋亡、增殖、神經(jīng)元發(fā)育等生物學(xué)行為具有密切聯(lián)系。因miRNA具有組織特異性、穩(wěn)定性、保守性的特點(diǎn)，具有一定的促癌、抑癌特性，在腫瘤組織發(fā)生演進(jìn)過程中具有重要作用，因此許多專家學(xué)者通過檢測miRNA表達(dá)對惡性腫瘤進(jìn)行診斷[14-15]。

miR-451是一個多功能且雙順反子的miRNA基因位點(diǎn)，是在紅細(xì)胞進(jìn)行發(fā)育過程中呈現(xiàn)特異高表達(dá)的miRNA分子,而miR-451基因簇高度保守，其存在的區(qū)域位于組織內(nèi)較為脆弱的區(qū)域，其中涵蓋的miRNA分子之間存在緊密相關(guān)性[16]。據(jù)行相關(guān)研究表明[17]，miR-451在消化道疾病中以低表達(dá)狀態(tài)存在。由此可認(rèn)為，miR-451可能與胃癌、食管癌等消化道疾病之間具有緊密關(guān)聯(lián)，可能參與該疾病發(fā)生、發(fā)展的全過程。在此基礎(chǔ)上，本研究發(fā)現(xiàn)，miR-451在胃癌中呈現(xiàn)低表達(dá)狀態(tài)，能夠?qū)δ[瘤的發(fā)展產(chǎn)生重要影響。而本文所得出的這一結(jié)果與上述相關(guān)研究結(jié)果保持一致。分析原因，miR-451可能通過對某種信號通路的活性進(jìn)行調(diào)控，從而導(dǎo)致胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲的情況出現(xiàn)異常，從而造成胃癌病情的惡性進(jìn)展。可見，上調(diào)miR-451表達(dá)可能是控制胃癌進(jìn)一步發(fā)展的關(guān)鍵。

miR-133a-3p以一種機(jī)體肌肉特異性的miRNA形態(tài)存在，分別位于6p12.2、18q11.2和20q13.33這3個不同的染色體上，miR-133a-3p的存在能夠?qū)\(yùn)動相關(guān)基因產(chǎn)生靶向調(diào)控作用，有利于骨骼肌受損后的再生，以及肌肉的再生[18]。據(jù)行相關(guān)研究表明[19]，miR-133a-3p在多種腫瘤疾病中呈現(xiàn)出異常低表達(dá)，并且能夠?qū)C(jī)體多種SGC7901等多種腫瘤細(xì)胞進(jìn)行靶向調(diào)控，促進(jìn)腫瘤疾病的進(jìn)一步發(fā)展，與腫瘤疾病之間具有緊密關(guān)聯(lián)。在此基礎(chǔ)上，本研究發(fā)現(xiàn)，miR-133a-3p在胃癌中呈現(xiàn)低表達(dá)狀態(tài)，能夠?qū)τ谀[瘤疾病的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生重要促進(jìn)作用。而本文所得出的這一結(jié)果與上述相關(guān)研究結(jié)果保持一致。分析原因，可能是因?yàn)閙iR-133a-3p能夠抑制阻斷細(xì)胞自噬介導(dǎo)谷氨酰分解，從而對胃癌細(xì)胞 的增殖和侵襲進(jìn)行抑制，從而造成疾病的進(jìn)一步發(fā)展。

miR-96位于染色體7q32.2上，miR-96分子為PTPN9的上游分子，能夠促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移，起到靶向調(diào)控的作用[20]。據(jù)相關(guān)研究指出[21]，miR-96能夠與K-ras癌基因進(jìn)行直接靶向結(jié)合，從而對胰腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移進(jìn)行抑制，縮減腫瘤細(xì)胞的生長速度。還有研究表明[22]，在腫瘤疾病中，miR-96呈現(xiàn)出異常高表達(dá)，由此可認(rèn)為，miR-96可能與胃癌等多種腫瘤等疾病的發(fā)生具有緊密關(guān)聯(lián)，可能參與疾病病情發(fā)展的全過程。在此基礎(chǔ)上，本研究發(fā)現(xiàn)，miR-96在胃癌中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，對腫瘤的發(fā)展產(chǎn)生重要影響。與該上述相關(guān)研究結(jié)果保持一致。分析原因，miR-96能夠?qū)ξ赴┘?xì)胞的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)水平進(jìn)行增強(qiáng)，并且增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的惡性增殖以及侵襲，促進(jìn)胃癌的進(jìn)一步發(fā)展，從而嚴(yán)重影響患者預(yù)后情況。

綜上所述，miR-451、miR-133a-3p、miR-96在胃癌組織中呈現(xiàn)異常表達(dá)，且miR-451、miR-133a-3p、miR-96表達(dá)變化與胃癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、浸潤程度、TNM分期、分化程度相關(guān)，三者表達(dá)之間具有一定相關(guān)性，共同參與胃癌發(fā)展演進(jìn)過程。但因本文研究樣本量較小，并且未對胃癌患者的相關(guān)預(yù)后進(jìn)行分析，缺乏對相關(guān)性的深入研究，需進(jìn)一步增加樣本量進(jìn)行多方研究證實(shí)。

利益相關(guān)聲明：所有作者均聲明不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說明：劉麗丹、尤光賢：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過程，論文撰寫；蔣先明：提出研究思路，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文審核；應(yīng)茜茜、樂曉偉：實(shí)施研究過程，資料搜集整理，論文修改。