許匯娟, 李珍

1南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院血液科(廣東廣州 510515)； 2南方醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)與生物技術(shù)學(xué)院(廣東廣州 510515)

急性髓細(xì)胞白血病(acute myeloid leukemia，AML)是髓系造血干/祖細(xì)胞惡性疾病，通常以骨髓和外周血中原始和(或)幼稚髓性細(xì)胞異常增生為主要特征，大多數(shù)病例病情急重，預(yù)后兇險(xiǎn)，如不及時(shí)治療?？晌＜吧黐1]。因此，尋找白血病治療靶點(diǎn)，開發(fā)有特異性的靶向藥物具有重要的臨床意義。微小RNA (microRNA，miRNA)是一類大約22個(gè)堿基長的非編碼RNA。miRNA通過特異性抑制或降解靶基因的翻譯，調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)[2]。越來越多的證據(jù)表明，miRNA參與人體內(nèi)生理和病理的過程，比如miRNA在細(xì)胞分化、新陳代謝以及腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用[3-4]。在人類癌癥中，miRNA的功能可根據(jù)靶基因的不同，作為調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展的癌基因或抑癌基因[5]。miR-361被認(rèn)為是多種腫瘤的致癌因子。研究[6]報(bào)道，通過比較14種腫瘤共5727例患者樣本與589例正常人樣本，發(fā)現(xiàn)miR-361在9種腫瘤組織中有高表達(dá)。另有研究通過miRNA/mRNA網(wǎng)絡(luò)分析表明miR-361與白血病存在密切相關(guān)性[7]，并且miR-361在急性白血病患者骨髓中也有顯著上調(diào)[8]。盡管有很多研究提示miR-361是一種腫瘤因子，在多種惡性腫瘤中有高表達(dá)，并且在白血病患者體內(nèi)表達(dá)上調(diào)，與白血病密切相關(guān)，但是，miR-361-3p 對(duì)急性髓系白血病細(xì)胞系HL-60細(xì)胞增殖的影響，及其靶向分子機(jī)制尚鮮見報(bào)道。2018年4月至2021年4月，本研究采用了熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)等技術(shù)驗(yàn)證miR-361-3p和靶基因之間的關(guān)系，為闡明miR-361-3p調(diào)節(jié)白血病細(xì)胞HL-60增殖和凋亡的分子機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 HEK-293和HL-60細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，T4連接酶、限制性內(nèi)切酶 XhoⅠ和NotⅠ購自Thermo公司。雙熒光素酶報(bào)告基因載體(pmirGLO載體)和LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司。大腸桿菌DH5α，Phanta?Max Super-Fidelity DNA Polymerase購自南京諾唯贊生物科技有限公司。DL2000bp Marker，DMEM培養(yǎng)基，Gel Extraction膠回收試劑盒，胎牛血清和Plasmid Mini KitI 質(zhì)粒提取試劑盒購自美國OMEGA公司，miR-361-3p和PCR引物購自上海生工生物技術(shù)有限公司，雙熒光素酶報(bào)告基因熒光檢測(cè)試劑盒購自美國Promega公司。CCK-8和細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自日本Dojindo公司，GAPDH、二抗：caspase-3、caspase-7、P53、Bcl-2、survive 等抗體均購自美國abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HEK-293和HL-60細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，加入1%雙抗(100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素)，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.2.2 靶基因預(yù)測(cè) 通過靶基因預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫starbase(http://starbase.sysu.edu.cn)預(yù)測(cè)miR-361-3p的靶基因，綜合文獻(xiàn)分析選定與細(xì)胞增殖凋亡相關(guān)的基因，包括B細(xì)胞遷移基因2抗體(B-cell translocation gene 2，BTG2)，胞漿多聚元件結(jié)合蛋白1(cytoplasmic polyadenylation element binding protein 1，CPEB1)和髓磷脂轉(zhuǎn)錄因子1(myelin transcription factor，MYT1)作為miR-361-3p的候選靶基因。

1.2.3 miR-361-3p靶基因熒光報(bào)告載體的構(gòu)建 設(shè)計(jì)合成BTG2， CPEB1 和MYT1上下游特異性同源引物，如表1。以HL-60細(xì)胞cDNA為模板，分別用 BTG2、CPEB1 和MYT1上下游特異性引物擴(kuò)增BTG2， CPEB1 和MYT1的 3′UTR序列。分別取BTG2， CPEB1 和MYT1基因Polymerase Chain Reaction(PCR)回收產(chǎn)物和psiCHECK-2載體，用XhoⅠ與NotⅠ進(jìn)行雙酶切。酶切產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，回收純化。按照Plasmid Mini Kit Ⅰ質(zhì)粒提取試劑盒說明書進(jìn)行目的片段與載體連接，于大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中加入10 μL連接產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化、挑取單菌落擴(kuò)增，再進(jìn)行雙酶切、鑒定和測(cè)序(上海生物生工有限公司廣州分公司)。

表1 BTG2、CPEB1 和MYT1引物序列

1.2.4 HEK-293細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 將HEK-293細(xì)胞接種在24孔板中(8×105·mL-1)，培養(yǎng)過夜，用于共轉(zhuǎn)染試驗(yàn)。將細(xì)胞隨機(jī)分組為：野生型+miR-361-3p mimic組、野生型+空質(zhì)粒組、突變型+miR-361-3p mimic、突變型+空質(zhì)粒組，每組分別設(shè)3個(gè)復(fù)孔。每孔用無血清培養(yǎng)基稀釋，加入 lipofectamine 2000 2 μL，總體積為125 μL；另取每孔各加入8 μg不同質(zhì)粒，加入DMEM培養(yǎng)基至總體積125 μL；然后將兩種稀釋液混合，室溫下靜置20 min；每孔加入250 μL轉(zhuǎn)染復(fù)合液，混勻；在 5% CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h，去除含有轉(zhuǎn)染復(fù)合物的培養(yǎng)基后，加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.5 雙熒光素酶報(bào)告基因活性檢測(cè) HEK-293細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，去除培養(yǎng)基，用PBS(phosphate buffer saline)清洗2次，每孔加入100 μL的PBL(Passive Lysis Buffer)，振搖，收集細(xì)胞裂解液。在發(fā)光板中每孔加入20 μL細(xì)胞裂解液，100 μL LARⅡ工作液，混勻，檢測(cè)熒光素酶活性值；每孔再加入100 μL終止液，檢測(cè)熒光素酶活性值，計(jì)算前后的比值。

1.2.6 細(xì)胞增殖和凋亡檢測(cè) 使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，在HL-60細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染miR-361-3p mimics/mimic-NC、miR-361-3pinhibitor/inhibitor-NC或si-BTG2/si-NC后，培養(yǎng)24、48和72 h。然后加入CCK-8(Cell Counting Kit-8)，37℃孵育1 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定波長450 nm下的吸光度。48 h后，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)HL-60細(xì)胞的凋亡情況。

1.2.7 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)miR-361-3p和BTG2基因表達(dá)量 用Trizol法提取各組HL-60細(xì)胞中的總RNA，然后根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的使用說明書獲得cDNA。取cDNA和引物，按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR說明書配制反應(yīng)體系。U6為miR-361-3p的內(nèi)參，GAPDH為BTG2的內(nèi)參。采用2-ΔΔCt法計(jì)算其相對(duì)表達(dá)。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30 s，40個(gè)循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)(94℃ 30 s，65℃ 30 s，94℃ 30 s)，miR-361-3p引物序列為5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAAATCAGA-3′(正向)、5′-ACACTCCAGCTGGGTCCCCCAGGTGTGATTCTG-3′(反向)，BTG2引物序列為5′-ACGGGAAGGGAACCGACAT-3′(正向)、5′-CAGTGGTGTTTGTAGTGCTCTG-3′(反向)，U6引物序列為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′(正向)、5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′(反向)，GAPDH引物序列為5′-TGTTCGTCATGGGTGTGAAC-3′(正向)、5′-ATGGCATGGACTGTGGTCAT-3′(反向)。

1.2.8 免疫印跡(Western blotting，WB)檢測(cè)蛋白表達(dá) 收集各組HL-60細(xì)胞進(jìn)行裂解，提取蛋白，將蛋白溶液和緩沖溶液按 4∶1 的比例混合，煮沸10 min，等到細(xì)胞總蛋白樣品。隨后進(jìn)行上樣、電泳和轉(zhuǎn)膜，加脫脂奶粉封閉1 h。加入一抗，4℃條件下過夜，TTBS漂洗3次×10 min，加入二抗，室溫封閉 2 h。取出 PVDF 膜，TTBS漂洗，DAB 顯色后照相。

2 結(jié)果

2.1 重組載體質(zhì)粒的構(gòu)建 靶基因以HL-60細(xì)胞DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，在200～250 bp左右有 DNA 條帶，與預(yù)期的片段大小一致，見圖1-A、1-C和1-E。將雙酶切后的重組質(zhì)粒進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖1-B、1-D和1-F所示，證實(shí)BTG2、CPEB1和MYT1基因3′UTR已擴(kuò)增出來。雙酶切后野生型質(zhì)粒和突變型質(zhì)粒片段大小一致、分子量一致，說明兩種載體構(gòu)建成功。將篩選出的陽性克隆測(cè)序，測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果100%匹配。基因BTG2、CPEB1和MYT1已成功在目的突變區(qū)域?qū)崿F(xiàn)突變，BTG2、CPEB1和MYT1基因3′UTR突變型部分測(cè)序圖如圖1-G、H。

注：A：BTG2基因 PCR產(chǎn)物電泳圖；B：BTG2基因雙酶切電泳圖；C：CPEB1基因 PCR產(chǎn)物電泳圖；D：CPEB1基因雙酶切電泳圖； E：MYT1基因 PCR產(chǎn)物電泳圖；F：MYT1基因雙酶切電泳圖； G：BTG2基因3′UTR突變型部分測(cè)序圖；H：CPEB1基因3′UTR突變型部分測(cè)序圖；I：MYT1基因3′UTR突變型部分測(cè)序圖

2.2 雙熒光素報(bào)告基因系統(tǒng)分析miR-361-3p與靶基因的作用關(guān)系 通過Starbase檢索發(fā)現(xiàn)，BTG2、CPEB1和MYT1 3′UTR與miR-361-3p存在結(jié)合位點(diǎn)。如表2所示，與 NC對(duì)照組相比，共轉(zhuǎn)染突變型BTG2 3′UTR載體和miR-361-3p mimic組的熒光素酶活性變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與此相反，共轉(zhuǎn)染野生型BTG2 3′UTR載體和miR-361-3p mimic組的熒光素酶活性顯著降低(P<0.001)。另外，與NC對(duì)照組相比，共轉(zhuǎn)染突變型CPEB1和MYT1 3′UTR載體和miR-361-3p mimic組的熒光素酶活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；共轉(zhuǎn)染野生型CPEB1和MYT1 3′UTR載體和miR-361-3p mimic組的熒光素酶活性降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 熒光酶活性

2.3 miR-361-3p/BTG2軸調(diào)控HL-60細(xì)胞增殖和凋亡 與NC對(duì)照組相比，在HL-60細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-361-3pmimic后，細(xì)胞中miR-361-3p的表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)；在HL-60細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-361-3pinhibitor，細(xì)胞中miR-361-3p的表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)，見表3。并且，在HL-60細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-361-3pmimic，細(xì)胞中BTG2的表達(dá)水平顯著降低，反之，在HL-60細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-361-3pinhibitor，細(xì)胞中BTG2的表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)，見表4。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-361-3p mimics能促進(jìn)細(xì)胞增殖，與NC對(duì)照組相比，24、48和72 h的細(xì)胞增殖明顯(P<0.01)；與此相反，miR-361-3p inhibitor可抑制細(xì)胞增殖。同時(shí)，沉默BTG2也能促進(jìn)HL-60細(xì)胞增殖(表4)。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示(表4和圖2)，與NC對(duì)照組相比，miR-361-3p mimic組和si BTG2組HL-60細(xì)胞凋亡比值下降，而miR-361-3p inhibitor組，細(xì)胞凋亡比值顯著升高了(P<0.01)。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組HL-60細(xì)胞中細(xì)胞凋亡圖

表3 各組HL-60細(xì)胞中miR-361-3p表達(dá)水平

表4 各組HL-60細(xì)胞中BTG2 mRNA表達(dá)水平、細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡值

2.4 miR-361-3p/BTG2軸調(diào)控P53信號(hào)通路 與NC對(duì)照組相比，沉默BTG2后，HL-60細(xì)胞中P53、促凋亡因子caspase3/7蛋白表達(dá)水平均顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。反之，凋亡抑制因子Bcl-2、survive的蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3和表5。

表5 各組HL-60細(xì)胞中caspase-3、caspase-7、P53、Bcl-2和survivine蛋白表達(dá)水平

圖3 Western blot 檢測(cè)HL-60細(xì)胞中caspase 3、caspase 7、p53、Bcl2和survivine蛋白的表達(dá)

3 討論

MiRNA是指一大類負(fù)調(diào)控基因表達(dá)的非編碼蛋白質(zhì)的小RNA。它們?cè)谠S多生物功能中起著至關(guān)重要的作用，如細(xì)胞生長、增殖、分化和凋亡[2-3]。人類多種惡性腫瘤(包括AML)的發(fā)生和發(fā)展與miRNAs的表達(dá)異常密切相關(guān)。一個(gè)miRNA能夠靶向調(diào)控多個(gè)靶基因，從而發(fā)揮多種生物學(xué)功能。miR-361-3p在多種惡行腫瘤中表達(dá)顯著性上調(diào)，起著癌基因的作用。2013年，Du等[9]首次報(bào)道了miR-361-3p是一種新的促癌基因。之后，相繼有研究表明，miR-361-3p可調(diào)節(jié)人肺腫瘤細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞和口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)的增殖和遷移[10]。例如，miR-361-3p通過負(fù)調(diào)控雙特異性磷酸酶2(DUSP2)促進(jìn)EMT，激活胰腺癌細(xì)胞中的ERK信號(hào)，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖[11]。這項(xiàng)研究還提供了臨床證據(jù)，表明高水平的miR-361-3p與腫瘤晚期和較短的存活率有關(guān)。miR-361在新診斷的 AML 患者的血漿中顯著增加(與健康對(duì)照組相比)，經(jīng)化療后顯著降低[12]。因此，我們推測(cè)miR-361-3p可能是一種AML 潛在的治療靶點(diǎn)，它的靶向分子機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。為了探究miR-361-3p的靶基因，本研究通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)和相關(guān)文獻(xiàn)分析，選取增殖凋亡相關(guān)的3個(gè)基因。進(jìn)一步通過靶基因的3′UTR克隆至雙熒光酶報(bào)告基因載體上，然后將構(gòu)建成功的報(bào)告基因與miR-361-3p mimics 共轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞中，雙熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-361-3p與BTG2有直接的靶向作用關(guān)系。

BTG2是BTG/TOB基因家族中第一個(gè)識(shí)別的基因，屬于抗增殖基因家族[13]。BTG2通過幾個(gè)重要的信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、死亡、遷移、凋亡。同時(shí)，大量文獻(xiàn)報(bào)道了在多種不同類型的癌細(xì)胞中存在BTG2 基因表達(dá)水平降低甚至缺失，與之相反，在其相應(yīng)的正常細(xì)胞中 BTG2 基因表達(dá)水平明顯較高，由此推測(cè)BTG2基因的表達(dá)異常與腫瘤具有密切關(guān)系，這提示了腫瘤的形成可能與 BTG2 基因表達(dá)相關(guān)[13-14]。在淋巴血液惡性腫瘤中，也發(fā)現(xiàn)存在BTG1/BTG2基因的缺失[15]。多項(xiàng)研究報(bào)道了，在HL-60細(xì)胞中，BTG2的高水平表達(dá)與抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡和分化相關(guān)[16-17]。為了探究miR-361-3p對(duì)白血病細(xì)胞增長的影響是否由BTG2介導(dǎo)，我們用miR-361-3p mimics/inhibitor或si-BTG2轉(zhuǎn)染HL-60細(xì)胞后進(jìn)行細(xì)胞增殖或凋亡的檢測(cè)，結(jié)果證實(shí)了miR-361-3p/BTG2軸可調(diào)控白血病細(xì)胞的增殖和凋亡。

P53通路是重要的抑癌信號(hào)通路，它可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程和(或)細(xì)胞凋亡等發(fā)揮抑癌作用[18]。我們進(jìn)一步在蛋白水平驗(yàn)證沉默BTG2是否影響P53及其下游相關(guān)因子的表達(dá)。研究結(jié)果提示了miR-361-3p/BTG2軸在白血病HL-60細(xì)胞中可調(diào)控P53信號(hào)通路。綜上所述，miR-361-3p通過BTG2調(diào)控P53通路影響白血病細(xì)胞的增殖和凋亡。這進(jìn)一步為miR-361-3p/BTG2作為潛在的靶點(diǎn)被用于臨床AML的診斷和治療，提供更多的研究資料和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

利益相關(guān)聲明：論文的全部作者聲明，在課題研究和論文撰寫過程中不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說明：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及論文撰寫由李珍完成；實(shí)驗(yàn)實(shí)施，數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計(jì)及論文撰寫由許匯娟完成。