郝韻寒，靳亞忠

（黑龍江八一農(nóng)墾大學園藝園林學院，大慶 163319）

綠豆（Vigna radiata（Linn.）），一種重要的藥食同源作物[1]，富含有豐富的優(yōu)質(zhì)蛋白、氨基酸、多種維生素、礦物質(zhì)和多糖、黃酮類物質(zhì)、苯丙氨酸解氨酶、超氧化歧化酶、胰蛋白酶抑制劑、抗性淀粉、抗真菌蛋白等多種活性物質(zhì)[2-4]，被廣泛應用于醫(yī)藥業(yè)、釀造業(yè)和食品業(yè)等[4]。綠豆是中國重要的小雜糧作物之一，種植面積達到75萬hm2,主要分布在東北與華北等地[5]，且隨著綠豆種植面積的擴大，連年重茬栽培易導致綠豆根腐病、枯萎病以及葉斑等病害的發(fā)生[1]，而生產(chǎn)中多采用化學藥劑進行綠豆全生育期的病害預防或防治[6-7]。此外，在我國的綠豆生產(chǎn)中，過量使用化學肥料也導致了系列環(huán)境問題[8]，但綠豆的產(chǎn)量并沒呈現(xiàn)最高[5,9-11]。因此，如何降低化肥以及化學農(nóng)藥的投入量，已經(jīng)引起廣大研究者的廣泛關(guān)注；必須實行適宜的農(nóng)業(yè)生物技術(shù)手段干預有限耕地下生產(chǎn)最大量的糧食作物，而以微生物的干預作為一種生產(chǎn)中減肥減藥的方式逐漸被種植者接受。

木霉菌（Trichoderma spp.)是一類絲狀子囊菌類、綠色孢子真菌，廣泛存在于自然界中,已經(jīng)作為一種生物菌在農(nóng)業(yè)上廣泛應用。木霉菌能與植物和諧共生，對植物的生長和養(yǎng)分吸收、系統(tǒng)抗逆性以及病害防治具有重要的影響[12]。然而，木霉菌的使用方式（如種子包衣、根系和土壤處理）、接種量大小、土壤環(huán)境條件、木霉菌種類等都影響著植物的生長發(fā)育[13]。木霉菌與植物互作中，木霉菌對植物的促生調(diào)節(jié)與木霉菌分泌的微粒物質(zhì)或木霉菌對植株根際土壤微生物環(huán)境的調(diào)節(jié)和對土壤營養(yǎng)元素有效性的調(diào)節(jié)等相關(guān)[14]。在辣椒研究中，化肥減量30%和50%配施木霉菌有機肥提高了根際土壤中土壤蔗糖酶、多酚氧化酶、脫氫酶、脲酶、堿性磷酸酶活性以及土壤中有效氮磷鉀的含量[15]；在生菜和高叢越橘的研究中，等氮量條件下，木霉菌有機肥的使用也促進了對土壤酶活性的升高[16-17]。但是，木霉菌菌劑接種于植物根部對土壤中酶活性的影響報道較少。本課題組前期在綠豆和蔬菜育苗研究中，木霉菌種子包衣能促進植株生長[18-19]，是否與木霉菌種子包衣參與調(diào)節(jié)土壤酶活性相關(guān)，還不清楚。因此，研究分析不同用量木霉菌孢子粉進行綠豆種子包衣對綠豆根際土壤酶活性的影響，所得結(jié)果對綠豆栽培及綠色防控具有重要意義，同時也為木霉菌的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

栽培試驗品種為黑龍江八一農(nóng)墾大學國家雜糧工程技術(shù)研究中心提供的小明綠，木霉菌劑由黑龍江田力保生物科技有限公司提供。

1.2 試驗設計

該試驗采用基質(zhì)栽培方式進行，在直徑為40 cm、高度為30 cm的桶中栽培，基質(zhì)為混合基質(zhì)，以沙子、草炭土，按照1∶2混配而成。試驗設置5個處理，菌劑與綠豆種子按照質(zhì)量比進行拌種，分別為：0%（CK）、0.5%（A）、1%（B）、2%（C）、3%（D），每個處理3次重復。播種前一天對已裝有基質(zhì)的塑料桶進行澆水，將挑選的顆粒飽滿、大小一致的綠豆種子浸泡后，控水至種皮濕潤，可進行木霉菌劑拌種，每盆點播7粒顆粒飽滿的種子。待出苗整齊后間苗，每盆留3株長勢均勻的植株進行培養(yǎng)。間苗后，一次性定量施入20 g氮磷鉀復合肥（N-P2O5-K2O=20-20-20）/桶（黑龍江牧康牧業(yè)有限責任公司提供）；后期栽培過程中，進行常規(guī)的栽培管理。

表1 供試基質(zhì)基本理化形狀Table 1 Principal physical and chemical properties of tested substrates

1.3 測定指標與方法

利用小鐵鏟挖出綠豆植株，去掉根系浮土，用毛刷刷取緊密附著在根系上土壤作為根際土壤，裝入自封袋，放置在-80℃冰箱中保存，用于測定土壤酶活性。土壤脲酶采用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法測定，單位為NH3-N mg·g-1[20]；土壤堿性磷酸酶活性采用磷酸苯二鈉比色法測定，單位為（酚）mg·g-1[20]；土壤蔗糖酶采用3，5-二硝基水楊酸比色法測定，單位為（葡萄糖）mg·g-1[20]；土壤脫氫酶采用TTC分光光度法測定,單位為（TPF）μg·g-1[20]；土壤過氧化氫酶采用比色法測定,單位為（KMnO4）mL·g-1[20]；土壤蛋白酶活性采用茚三酮比色法測定進行測定,單位為（甘氨酸）μg·g-1[20]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010和SPSS.19軟件對數(shù)據(jù)進行處理和統(tǒng)計分析，采用Duncan新復極差法進行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 木霉菌拌種對綠豆根際土壤脫氫酶活性的影響

由表2可知，利用木霉菌進行綠豆拌種，能夠調(diào)節(jié)綠豆根際土壤中脫氫酶的活性，且隨著木霉菌用量的增加土壤脫氫酶活性呈現(xiàn)升高—降低趨勢。與對照（CK）相比，不同用量的木霉菌進行綠豆種子包衣明顯促進了綠豆根際土壤脫氫酶活性，而木霉菌處理的綠豆根際土壤脫氫酶活性之間存在差異（P<0.05）。在綠豆開花期和成熟期，0.5%（A）處理的綠豆根際土壤脫氫酶活性顯著大于3%（D）處理，而0.5%（A）、1%（B）、2%（C）處理之間無明顯差異（P<0.05）；在結(jié)莢期，B（1%）處理的綠豆根際土壤脫氫酶活性明顯高于其他處理（P<0.05）。

表2 木霉菌拌種對綠豆根際土壤脫氫酶活性的影響Table 2 Effects of Trichoderma SPP.on dehydrogenase activity in rhizosphere soil of mung bean

2.2 木霉菌拌種對綠豆根際土壤堿性磷酸酶活性的影響

由表3可以看出，綠豆不同的生長發(fā)育期，木霉菌處理對綠豆根際土壤堿性磷酸酶活性影響存在差異。在開花期和結(jié)莢期，木霉菌拌種處理的辣椒根際土壤堿性磷酸酶活性高于對照（CK），差異顯著（P<0.05），而木霉菌拌種處理之間相比，綠豆根際土壤堿性磷酸酶活性也存在差異，且在開花期，C處理綠豆根際土壤堿性磷酸酶活性顯著高于其他處理，而在結(jié)莢期，C和D處理土壤堿性磷酸酶活性之間無明顯差異，但明顯高于A和B處理（P<0.05）。此外，在成熟期，C處理的綠豆根際土壤堿性磷酸酶活性明顯大于與對照（CK）和A、B、D處理，但A和B處理的土壤堿性磷酸酶活性則顯著低于C處理（P<0.05）。

表3 木霉菌拌種對綠豆根際土壤堿性磷酸酶活性的影響Table 3 Effects of Trichoderma SPP.on phosphatase activity in rhizosphere soil of mung bean

2.3 木霉菌拌種對綠豆根際土壤蔗糖酶活性的影響

木霉菌拌種處理影響了綠豆根際土壤蔗糖酶的活性（表4）。從表4可以看出，隨著木霉菌拌種量的增加，在綠豆生長發(fā)育的不同時期，根際土壤蔗糖酶活性隨著木霉菌用量的增加呈現(xiàn)出升高-減低的變化趨勢。與CK相比較，在綠豆生長發(fā)育的3時期，A（0.5%）、B（1%）、2%（C）、D（3%）處理的綠豆根際土壤蔗糖酶活性都明顯高于CK處理，而木霉菌拌種處理之間相比較，發(fā)現(xiàn)在這3個時期，C（2%）處理的綠豆根際土壤蔗糖酶活性都明顯大于其他木霉菌處理（P<0.05）。

表4 木霉菌對綠豆植株根際土壤蔗糖酶活性的影響Table 4 Effects of Trichoderma SPP.on sucrase activity in rhizosphere soil of mung bean

2.4 木霉菌用量對綠豆植株根際土壤脲酶活性的影響

脲酶活性的大小反映了土壤中有效態(tài)氮素的可利用性。由表5可知，在綠豆生長發(fā)育的開花期、結(jié)莢期以及成熟期，0.5%（A）、1%（B）、2%（C）、3%（D）處理的綠豆根際土壤脲酶活性顯著高于對照（CK）處理（P<0.05），且隨著木霉菌拌種用量的增加，綠豆根際土壤脲酶活性呈現(xiàn)為現(xiàn)升高而后降低趨勢；在綠豆的開花期和結(jié)莢期，木霉菌拌種處理之間相比，1%（B）處理的綠豆土壤根際脲酶活性明顯大于其他處理（P<0.05），而在綠豆成熟期，2%（C）處理的脲酶活性顯著高于對照（CK）和其他木滅菌處理，而0.5%（A）和3%（D）處理之間無明顯差異（P<0.05）。

表5 木霉菌對綠豆植株根際土壤脲酶活性的影響Table 5 Effects of Trichoderma SPP.on urease activity in rhizosphere soil of mung bean

2.5 木霉菌用量對綠豆植株根系土壤過氧化氫酶活性的影響

由表6可知，與CK相比較，在綠豆生長發(fā)育的3個時期，木霉菌拌種處理的綠豆根際土壤過氧化氫酶活性也明顯高于CK處理（結(jié)莢期A處理除外）；隨著木霉菌拌種用量的增加，綠豆根際土壤中過氧化氫酶活性逐漸增大，3%（D）處理根際土壤過氧化氫酶活性最高，顯著高于其他木霉菌處理，而其他木霉菌處理之間無明顯差異（P<0.05）。在結(jié)莢期，A（0.5%）處理的根際土壤過氧化氫酶與對照（CK）無顯著差異，但其明顯低于其他木霉菌處理，而B和C處理之間無明差異（P<0.05）。成熟期，A和B處理土壤根際過氧化氫酶活性顯著低于C和D處理，而二者之間無顯著差異（P<0.05）。

表6 木霉菌對綠豆植株根系土過氧化氫酶活性的影響Table 6 Effects of Trichoderma SPP.on catalase activity in rhizosphere soil of mung bean

2.6 木霉菌用量對綠豆植株根際土壤蛋白酶活性的影響

由表7可以看出，與對照（CK）相比較，木霉菌菌劑拌種處理后，在綠豆生長發(fā)育的開花期，A和D處理的綠豆根際土壤的蛋白酶活性與CK處理之間無明顯差異，而B和C處理的綠豆根際土壤蛋白酶活性大于CK處理，而與其他木霉菌處理之間無明顯差異（P<0.05）。在綠豆生長發(fā)育的結(jié)莢期和成熟期，木霉菌拌種處理綠豆根際土壤的蛋白酶活性隨著木霉菌用量的增加呈現(xiàn)升高-降低趨勢，且C（2%）處理土壤蛋白酶活性最高，顯著大于CK和其他木霉菌處理（P<0.05），而在結(jié)莢期，A、B和D處理土壤蛋白酶活性之間無明顯差異（P<0.05）。

表7 木霉菌對綠豆植株根際土壤蛋白酶活性的影響Table 7 Effects of Trichoderma SPP.on activity in rhizosphere soil of mung bean

3 討論

木霉菌定殖于植物根系，是促進植物生長和調(diào)節(jié)植物防御性能的一種方式。在定殖于根系的作用過程中，木霉菌分泌的蛋白、激素、次生代謝物、水解酶類、雜環(huán)類物質(zhì)以及抗菌素類物質(zhì)等多種活性物質(zhì)發(fā)揮著活化土壤養(yǎng)分、促生等作用[13,21]。李氏木酶菌能產(chǎn)生高效的多酶體系，能調(diào)節(jié)栽培基質(zhì)中腐殖質(zhì)或有機質(zhì)的含量，形成多糖物質(zhì)，為根系提供碳源，促進植物根系的生長[22]。但是，木霉菌菌劑拌種或接種于植物根際土壤能否影響土壤酶活性，進而間接促進植物生長的報道較少。本研究中，按照木霉菌菌劑與種子質(zhì)量比為0.5%（A）、1%（B）、2%（C）、3%（D）進行種子包衣處理都促進了綠豆植株根際土壤中脲酶、磷酸酶、蔗糖酶、脫氫酶、過氧化氫酶以及蛋白酶活性的增高，而調(diào)節(jié)酶活性升高的效果則存在處理間以及綠豆發(fā)育期的不同。在大豆的研究中，根部接種短密木霉菌促進了蔗糖酶活性的增加，而過氧化氫酶活性隨著培養(yǎng)時間的推移城鄉(xiāng)升高-降低-升高的趨勢[23]，與本研究結(jié)果存在有相同和有異之處，可能由于作物種類不同而產(chǎn)生了不同調(diào)節(jié)結(jié)果。本課題組在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，木霉菌菌劑對綠豆種子包衣能促進綠豆植株的生長發(fā)育，因此推測木霉菌菌劑包衣處理綠豆種子可通過調(diào)節(jié)綠豆根際土壤酶活性進而間接發(fā)揮促生作用，且發(fā)現(xiàn)，1%~2%用量的木霉菌菌劑包衣綠豆種子調(diào)節(jié)植株根際土壤酶活性的效果突出，而3%處理則導致根系過氧化氫酶活性升高，可能造成了脅迫作用，還需進一步研究。此外，木霉菌有機肥與化肥配施能通過促進綠豆植株根際土壤堿性磷酸酶、脲酶、蔗糖酶、多酚氧化酶、脫氫酶等活性的升高，促進了植株生長[15]，而在生菜研究中，也發(fā)現(xiàn)木霉菌有機肥與化肥配施提高了根際土壤中土壤中性磷酸酶、蔗糖酶和過氧化氫酶活性，而降低了脲酶和脫氫酶活性，促進了根際土壤中有效養(yǎng)分含量[20]；另外，木霉菌生物有機肥和有機肥處理提高了高叢越橘根際土壤中酸性磷酸酶和脲酶活性[17]；前人的研究結(jié)果暗示了木霉菌的應用對不同作物根際土壤酶活性的調(diào)節(jié)不同，可能與木霉菌的菌種、作物種類以及使用方法等存在關(guān)系。在研究中，木霉菌菌劑包衣處理對綠豆根際土壤酶活性的調(diào)節(jié)與在大豆中[20]的研究也存在不同，可能與木霉菌的使用方式不同有關(guān)，還需進一步進行研究。

4 結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)，采用木霉菌與種子質(zhì)量比為0.5%（A）、1%（B）、2%（C）、3%（D）拌種處理，發(fā)現(xiàn)能促進綠豆開花期、結(jié)莢期和成熟期根際土壤中的脫氫酶、磷酸酶、蔗糖酶、脲酶、過氧化氫酶以及蛋白酶的活性的提高，但存在木霉菌用量之間的差異，且隨著木霉菌用量的增加，土壤中這些酶活性呈現(xiàn)升高-降低趨勢（過氧化氫酶活性除外）；2%（C）木霉菌用量拌種處理綠豆，其根際土壤處理脫氫酶、磷酸酶、蔗糖酶以及蛋白酶活性最高，且促進了成熟期土壤脲酶的增加，而1%（B）木霉菌拌種處理促進了開花期和結(jié)莢期土壤脲酶的升高。此外，發(fā)現(xiàn)隨著木霉菌菌劑用量的增加，拌種處理綠豆根際土壤過氧化氫酶活性逐漸增大，且3%（D）木霉菌菌劑拌種處理的土壤過氧化氫酶活性最高，說明木霉菌菌劑拌種綠豆種子，能夠通過調(diào)節(jié)根際土壤各種代謝酶活性，但使用量過大能抑制脫氫酶、磷酸酶、蔗糖酶、脲酶以及蛋白酶的活性升高，并促進脅迫響應關(guān)鍵酶-過氧化氫酶活性的增加。