杜嬋娟，楊 迪 ， 葉云峰 ，潘連富 ，張 晉，付 崗

(1 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/廣西作物病蟲(chóng)害生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧， 530007；2 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，南寧，530007)

百香果Passifloraedulis，學(xué)名西番蓮，原產(chǎn)于南美洲熱帶地區(qū)，因富含多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有獨(dú)特的濃郁香氣，同時(shí)兼具食用價(jià)值和藥用價(jià)值，深受消費(fèi)者喜愛(ài)[1-2]。

我國(guó)從20世紀(jì)90年代開(kāi)始引種百香果，主產(chǎn)區(qū)分布包括廣西、廣東、海南、云南和福建等地[3]。截至2018年，我國(guó)百香果種植面積4.73萬(wàn)hm2，鮮果產(chǎn)量達(dá)63.5萬(wàn)t，成為近年來(lái)我國(guó)大力發(fā)展的新興產(chǎn)業(yè)之一[4]。

隨著百香果產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，我國(guó)百香果種植面積不斷擴(kuò)大，其病蟲(chóng)害問(wèn)題也日益突出[6-13]。其中，可可毛色二孢Lasiodiplodiatheobromae引起的果腐病是近年發(fā)生在百香果果實(shí)上新病害[14]，可造成果實(shí)腐爛，嚴(yán)重影響鮮果經(jīng)濟(jì)價(jià)值。然而，目前國(guó)內(nèi)鮮見(jiàn)防治百香果采后果腐病的相關(guān)研究報(bào)道，病害防治困難較大。

為進(jìn)一步了解百香果果腐病菌的生物學(xué)特性，我們研究其相關(guān)生物學(xué)特性，測(cè)定14種殺菌劑對(duì)病原菌的室內(nèi)毒力，為百香果采后果腐病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

百香果果腐病菌可可毛色二孢Lasiodiplodiatheobromae，由廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所分離與保存。培養(yǎng)基包括馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)和察氏培養(yǎng)基[15]。

殺菌劑：植物仿生類(lèi)，80%乙蒜素乳油，河南科邦化工有限公司產(chǎn)。硫代氨基甲酸酯類(lèi)，80%代森錳鋅可濕性粉劑，陶氏益農(nóng)農(nóng)業(yè)(中國(guó))科技有限公司產(chǎn)。咪唑類(lèi)，450 g/L咪鮮胺水乳劑，青島中達(dá)農(nóng)業(yè)科技有限公司產(chǎn)。三唑類(lèi)，250 g/L丙環(huán)唑乳油，山東濰坊雙星農(nóng)藥有限公司產(chǎn)；430 g/L戊唑醇懸浮劑，江蘇七洲綠色化工股份有限公司產(chǎn)；10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑，先正達(dá)南通作物保護(hù)有限公司產(chǎn)。苯并咪唑類(lèi)，50%多菌靈可濕性粉劑，上海悅聯(lián)化工有限公司產(chǎn)。烷基多胺類(lèi)，400 g/L嘧霉胺懸浮劑，拜耳(中國(guó))有限公司產(chǎn)。甲氧基丙烯酸酯類(lèi)，25%嘧菌酯懸浮劑，陜西皇牌作物科技有限公司產(chǎn)；22.5%啶氧菌酯懸浮劑，安陽(yáng)市銳普農(nóng)化有限公司產(chǎn)；30%吡唑醚菌酯懸浮劑，河南勇冠喬迪農(nóng)業(yè)科技有限公司產(chǎn)；50%肟菌酯水分散粒劑，河北興柏農(nóng)業(yè)科技有限公司產(chǎn)。酰胺類(lèi)，41.7%氟吡菌胺懸浮劑，拜耳(中國(guó))有限公司產(chǎn)；50%啶酰菌胺水分散粒劑，巴斯夫歐洲公司產(chǎn)。

1.2 pH值、溫度和光照的影響試驗(yàn)

將純化后的病原菌移至PDA平板，28 ℃培養(yǎng)2 d，用滅菌的直徑5 mm打孔器沿菌落邊緣取菌餅，分別接種至pH值3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5和11.0的PDA平板，28 ℃培養(yǎng)36 h；另將菌餅接種至PDA平板后，分別放置在10、13、16、19、22、25、28、31、34、37和40 ℃培養(yǎng)36 h；另將菌餅接種至PDA平板后，分別放置24 h/d光照、12 h/d光暗交替和24 h/d黑暗下，28 ℃培養(yǎng)36 h，每處理重復(fù)3次，采用十字交叉法測(cè)量各處理菌落直徑。

1.3 不同碳源、氮源的影響試驗(yàn)

以察氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別用葡萄糖、甘露醇、D-半乳糖、乳糖、山梨醇、果糖、可溶性淀粉、木糖、木糖醇和甘油等含碳化合物，等量置換基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的蔗糖，制成不同碳源培養(yǎng)基；用硝酸鉀、甘氨酸、硫酸銨、L-脯氨酸、亞硝酸鈉、L-精氨酸、氯化銨、DL-丙氨酸、L-天冬氨酸和尿素等含氮化合物，等量置換基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的硝酸鈉，制成不同氮源培養(yǎng)基，將病原菌菌餅接種至不同碳源或氮源培養(yǎng)基中，重復(fù)3次，28 ℃培養(yǎng)36 h，采用十字交叉法測(cè)量各處理菌落直徑。

1.4 殺菌劑室內(nèi)毒力測(cè)定

采用平板生長(zhǎng)速率法，將供試14種殺菌劑用無(wú)菌水配制成母液，分別加入PDA中配制成不同濃度含藥平板。即丙環(huán)唑和苯醚甲環(huán)唑濃度為3.125、6.25、12.5、25、50 mg/L；戊唑醇、多菌靈和吡唑醚菌酯濃度為6.25、12.5、25、50、100 mg/L；乙蒜素、嘧霉胺和咪鮮胺濃度為12.5、25、50、100、200 mg/L；啶氧菌酯和氟吡菌胺濃度為25、50、100、200、400 mg/L；嘧菌酯、肟菌酯和啶酰菌胺濃度為62.5、125、250、500、1 000 mg/L；代森錳鋅濃度為125、250、500、1 000、2 000 mg/L。每平板中央移入菌餅1塊，每濃度重復(fù)3次，以不含藥劑的PDA為對(duì)照， 28 ℃培養(yǎng)36 h，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算相對(duì)抑菌率。以藥劑濃度對(duì)數(shù)值為自變量(x)，相對(duì)抑菌率的概率值為因變量(y)，進(jìn)行線(xiàn)性回歸分析，建立毒力回歸方程，計(jì)算相關(guān)系數(shù)r和抑菌有效中濃度EC50和EC95。相對(duì)抑菌率(%)=(對(duì)照菌落直徑-藥劑處理菌落直徑)/(對(duì)照菌落直徑-5)×100。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)用Excel 2019匯總、計(jì)算平均值和作圖，并采用SPSS 18.0軟件的Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH值和培養(yǎng)溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

從圖1可知，病原菌在pH值3.5～10.5范圍內(nèi)均可以生長(zhǎng)，培養(yǎng)36 h，病原菌菌落直徑13.62 mm以上。當(dāng)pH值為4.5～5.5時(shí)，菌落生長(zhǎng)最快且不同處理間差異不顯著(p<0.05)，菌落直徑最大可達(dá)64.48 mm。當(dāng)pH值11.0時(shí)，病原菌停止生長(zhǎng)。病原菌在10～40 ℃范圍內(nèi)均可生長(zhǎng)；培養(yǎng)36 h，以31～34 ℃時(shí)菌落生長(zhǎng)最快，且差異不顯著(p<0.05)，菌落直徑最大可達(dá)68.15 mm。當(dāng)溫度小于16 ℃或大于40 ℃時(shí)，病原菌生長(zhǎng)緩慢，菌落直徑在7.63 mm以下。

注：不同小寫(xiě)字母表示處理間存在顯著性差異(p<0.05)。

2.2 碳源、氮源和光照條件對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

從表1可知，供試碳源條件下，病原菌均可較好生長(zhǎng)。培養(yǎng)36 h，病原菌在以蔗糖、甘油、D-半乳糖、葡萄糖、甘露醇、木糖醇、D-木糖、乳糖、山梨醇和可溶性淀粉為碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)差異不顯著，菌落直徑為43.20～59.64 mm。病原菌可利用11種供試氮源生長(zhǎng)。在以硫酸銨和氯化銨為氮源的培養(yǎng)基上，病原菌生長(zhǎng)最迅速，培養(yǎng)36 h，菌落直徑均在74 mm以上。以尿素為氮源的培養(yǎng)基上，病原菌生長(zhǎng)最慢，其菌落直徑僅3.34 mm，顯著低于其他氮源處理(p<0.05)。

表1 不同碳源、氮源和培養(yǎng)光照條件對(duì)百香果果腐病菌可可毛色二孢Lasiodiplodia theobromae菌絲生長(zhǎng)的影響

不同光照條件下，病原菌在PDA上的生長(zhǎng)無(wú)顯著性差異，菌落直徑均在45 mm以上，說(shuō)明光照對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響不大。

2.3 殺菌劑對(duì)病原菌的室內(nèi)毒力

從表2可知，供試14種殺菌劑對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用存在差異。其中，嘧霉胺的毒力最強(qiáng)，EC50為0.004 6 mg/L；其次為戊唑醇、多菌靈、苯醚甲環(huán)唑和丙環(huán)唑，其EC50均小于1 mg/L，分別為0.007 2、0.025 5、0.384 9和0.706 7 mg/L。毒力中等的為咪鮮胺、吡唑醚菌酯、乙蒜素和啶氧菌酯，EC506～76 mg/L。對(duì)病原菌的毒力效果較差的殺菌劑為代森錳鋅、肟菌酯、啶酰菌胺和嘧菌酯，EC50均大于100 mg/L。氟吡菌胺的毒力效果最差，其EC50高達(dá)1 152.317 6 mg/L。此外，丙環(huán)唑的EC95最小，為33.129 5 mg/L；其次是咪鮮胺和戊唑醇，EC95分別為46.596 5和90.545 9 mg/L，三者的EC95均小于100 mg/L；乙蒜素、苯醚甲環(huán)唑和代森錳鋅的EC95均小于1 000 mg/L，而其余藥劑的EC95均大于1 000 mg/L。

表2 14種殺菌劑對(duì)百香果果腐病菌可可毛色二孢Lasiodiplodia theobromae的室內(nèi)毒力

3 結(jié)論與討論

可可毛色二孢作為一種寄主廣泛的植物病原真菌[16]，可引起多種植物果實(shí)病害，其生物學(xué)特性研究已有大量報(bào)道[17-22]。然而，來(lái)源于不同寄主的可可毛色二孢的生物學(xué)特性存在一定差異[22-24]。筆者2019年在廣西北流、百色等地調(diào)查中發(fā)現(xiàn)可可毛色二孢會(huì)引起百香果采后果腐病[14]。由于該病害是近年來(lái)在百香果上發(fā)生的新病害，目前關(guān)于其病原菌的生物學(xué)特性及藥劑篩選鮮見(jiàn)報(bào)道。研究結(jié)果表明，該病原菌在pH值3.5～10.5范圍內(nèi)均可生長(zhǎng)，以pH值4.5～5.5生長(zhǎng)最好；10～40 ℃范圍內(nèi)均可生長(zhǎng)，以31～34 ℃生長(zhǎng)最好，表明其適應(yīng)性強(qiáng)，是一種嗜高溫的微生物。該結(jié)果與劉小玉等[24]、董章勇等[25]、戴利銘等[26]的報(bào)道基本一致。廣西百香果的采收期正值高溫多雨的夏季，濕熱的氣候?yàn)楣“l(fā)生及病害傳播提供了有利條件。病原菌生長(zhǎng)對(duì)碳源要求并不嚴(yán)格，均可利用供試的11種碳源；對(duì)氮源利用差異較大，最佳氮源為硫酸銨和氯化銨，利用尿素的能力最差。有研究表明，百香果果皮富含大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[27]，這為病原菌的生長(zhǎng)繁殖提供了條件。由于病原菌利用尿素的能力較差，因此，百香果施肥管理時(shí)，噴施含有尿素的葉面肥來(lái)補(bǔ)充氮肥，可利于控制該病害的發(fā)生和擴(kuò)展。

8類(lèi)14種殺菌劑的室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果表明，三唑類(lèi)的丙環(huán)唑和戊唑醇、咪唑類(lèi)的咪鮮胺對(duì)病原菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用，這與戴利銘等[26]、唐利華等[28]、劉樹(shù)森等[29]的研究相似。而苯并咪唑類(lèi)、烷基多胺類(lèi)、甲氧基丙烯酸酯類(lèi)和酰胺類(lèi)的供試殺菌劑對(duì)病原菌的EC95值均大于1 000 mg/L，表明這些藥劑對(duì)病原菌的抑制效果較差，因此在生產(chǎn)上不推薦使用這類(lèi)藥劑防治百香果果腐病。由于不同類(lèi)型的殺菌劑對(duì)病害的防治機(jī)理不同[30-32]，為避免重復(fù)施用單一殺菌劑而使病原菌產(chǎn)生抗藥性，可考慮交替使用不同類(lèi)型的殺菌劑防治病害。此外，本研究調(diào)查發(fā)現(xiàn)，百香果果腐病菌主要通過(guò)果皮上的傷口侵染為害[14]。因此，為預(yù)防該病害發(fā)生，可在采收前全園噴施戊唑醇、苯醚甲環(huán)唑等藥劑；采后則考慮使用咪鮮胺等藥劑。

本研究?jī)H測(cè)定了不同殺菌劑對(duì)病原菌的室內(nèi)毒力，由于田間環(huán)境較為復(fù)雜，且殺菌劑對(duì)病害的防治與病原菌孢子的抗逆性、殺菌劑的穩(wěn)定性、寄主植物的生長(zhǎng)環(huán)境等諸多因素有關(guān)。因此，室內(nèi)篩選藥劑在田間施用時(shí)，實(shí)際防效可能會(huì)存在差異。下一步我們將開(kāi)展田間藥效試驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證殺菌劑的防效，為百香果果腐病的防治提供參考。