韓曉利，劉廣興，李昳晴，鄭佳妍，王庭欣

(河北大學(xué) 質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督學(xué)院，河北 保定 071002)

鹽酸硫利達(dá)嗪，化學(xué)名稱為10-[2-(1-甲基-2-哌啶基)乙基]-2-甲基硫代吩噻嗪鹽酸鹽，分子式C12H26N2S2·HCl,相對(duì)分子質(zhì)量407.04.結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1.鹽酸硫利達(dá)嗪是一種常見(jiàn)鎮(zhèn)靜劑，在臨床上主要用于抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)，減弱機(jī)體活動(dòng)，從而消除躁動(dòng)不安并恢復(fù)安靜.有些養(yǎng)殖戶將鹽酸硫利達(dá)嗪非法用于畜禽以達(dá)催肥及縮短出欄時(shí)間，降低運(yùn)輸中死亡率的目的[1].鎮(zhèn)靜劑殘留會(huì)造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，引起體位性低血壓、運(yùn)動(dòng)障礙、肝損害等[2].農(nóng)業(yè)部176號(hào)公告規(guī)定，飼料和動(dòng)物飲用水中禁止使用鹽酸氯丙嗪、鹽酸異丙嗪、鹽酸硫利達(dá)嗪、地西泮、苯巴比妥等鎮(zhèn)靜劑類藥物.

圖1 鹽酸硫利達(dá)嗪分子結(jié)構(gòu)式Fig.1 Thiolidazine hydrochloride molecular formula

目前有關(guān)鎮(zhèn)靜劑的檢測(cè)方法有高效毛細(xì)管電泳法[3]、氣相色譜-質(zhì)譜法[4]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[5]、免疫學(xué)[6]等檢測(cè)方法.SN/T 2113—2008行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定動(dòng)物源性食品中鎮(zhèn)靜劑的檢測(cè)方法為液相色譜-質(zhì)譜法/質(zhì)譜法.雖然液質(zhì)聯(lián)用方法檢測(cè)靈敏度高，但是儀器昂貴，運(yùn)行成本高，很難在一般實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行普及.NY/T 1458—2007規(guī)定了飼料中鎮(zhèn)靜劑的檢測(cè)方法，對(duì)于雞肉中的鎮(zhèn)靜劑檢測(cè)沒(méi)有相關(guān)規(guī)定.目前雞肉中氯丙嗪、氟哌啶醇、阿扎哌醇等的殘留及檢測(cè)方法已有報(bào)道[7].雞肉中鎮(zhèn)靜劑的檢測(cè)研究大多集中在樣品前處理中，利利[8]以固相萃取技術(shù)為前處理方法，測(cè)定尿液中苯二氮卓類藥物.劉楊[9]論述了液液萃取技術(shù)和固相萃取技術(shù)的萃取效果，液液萃取技術(shù)對(duì)藥品的提取效率相對(duì)較低，而且靈敏度和選擇性較低.固相萃取技術(shù)具有對(duì)環(huán)境污染小、試劑量消耗少、乳化少、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)[10].本實(shí)驗(yàn)采用HLB固相萃取柱凈化提取液，結(jié)合HPLC法分析雞肉中鹽酸硫利達(dá)嗪的含量.建立了一種液相色譜技術(shù)檢測(cè)雞肉中鹽酸硫利達(dá)嗪的方法.本方法自動(dòng)化水平較高，凈化水平較好，準(zhǔn)確度也較高，可高效地測(cè)定雞肉中鹽酸硫利達(dá)嗪的含量.

1 儀器與試劑

1.1 儀器

高效液相色譜儀(1260 Infinity Ⅱ，Agilent Technologies)；冷凍離心機(jī)(FC5718R，奧豪斯儀器有限公司)；超聲波清洗機(jī)(SB25-12DTD，寧波新芝生物科技公司)；氮吹儀(TTL-DC，北京同泰聯(lián)科技公司)；固相萃取裝置(C18固相萃取柱：500 mg/3 mL，江蘇杰島高新材料科技公司)；高通量組織研磨器(SCIENTZ-48，寧波新芝生物科技股份有限公司).

1.2 材料

甲醇、乙腈、甲酸(色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；鹽酸硫利達(dá)嗪(質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.0%，上海源葉生物科技有限公司)；乙酸乙酯、正己烷(分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；水為一級(jí)超純水；雞肉樣品購(gòu)于保定市惠友超市軍校店.

1.3 溶液配制

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取鹽酸硫利達(dá)嗪100 mg，用甲醇溶解至質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL，4 ℃冷藏.

標(biāo)準(zhǔn)工作液：移取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用中性洗脫液依次稀釋配制成標(biāo)準(zhǔn)工作液，質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/mL，現(xiàn)用現(xiàn)配.

1.3.2 其他溶液的配制

體積分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸溶液：將1 mL無(wú)水甲酸用超純水溶解，通過(guò)0.22 μm濾膜，超聲15 min，現(xiàn)用現(xiàn)配.

洗脫液：體積分?jǐn)?shù)2%氨水的甲醇溶液，將2 mL氨水用甲醇定容至100 mL.

中性洗脫液：取洗脫液97.5 mL，加入2.5 mL無(wú)水甲酸混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配.

1.4 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用Origin 分析軟件.

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 儀器條件

色譜條件：Poroshell 120 EC-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,4 μm)；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸溶液，B為乙腈，B與A體積比為35∶65；流速：1.0 mL/min;柱溫：25 ℃；檢測(cè)器：二級(jí)管陣列檢測(cè)器；進(jìn)樣量：20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：262 nm；

2.2 最佳檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1458—2007，結(jié)合文獻(xiàn)[11]，將液相色譜連接二極管陣列檢測(cè)器初步確定鹽酸硫利達(dá)嗪的特征波長(zhǎng)262、256、313 nm，分別測(cè)定3個(gè)特征波長(zhǎng)下的峰面積確定最終檢測(cè)波長(zhǎng).

2.3 流動(dòng)相的確定

在確定流動(dòng)相比例時(shí)，采取流動(dòng)相V(乙腈)∶V(甲酸溶液)=28∶72,V(乙腈)∶V(甲酸溶液)=35∶65時(shí)進(jìn)行對(duì)比.根據(jù)峰型和是否有雜峰確定最佳的流動(dòng)相比例.

2.4 出峰時(shí)間、檢測(cè)時(shí)間的確定

將質(zhì)量濃度分別為0.2、0.5、2.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液依次進(jìn)樣，觀察出峰時(shí)間及峰面積的變化，確定出峰時(shí)間及檢測(cè)時(shí)間.

2.5 提取溶劑選擇

查閱相關(guān)文獻(xiàn)[12-13]，本實(shí)驗(yàn)的前處理中分別用乙酸乙酯和乙腈對(duì)相同添加水平的鹽酸硫利達(dá)嗪雞肉樣品進(jìn)行提取，觀察比較譜圖和峰面積，確定最佳提取溶劑.

2.6 樣品前處理

樣品的提?。簩⑿迈r的雞肉組織研碎，稱取2 000 mg，加入8.0 mL乙酸乙酯，旋渦攪拌，超聲提取15 min，9 400 r/min離心，上清液加入2.0 mL正己烷，磁力攪拌5 min，以9 400 r/min離心，吸出正己烷層.向提取后的雞肉殘?jiān)尤?.0 mL乙酸乙酯，按上述操作重復(fù)提取2.0次，合并3次提取液，在40 ℃下氮吹至近干，2.0 mL乙腈溶解，超聲震蕩5 min，加入2.0 mL正己烷渦旋1 min，6 000 r/min 離心 5 min，棄去正己烷層，濃縮液待凈化.

樣品的凈化：將HLB固相萃取柱依次用5.0 mL甲醇和5.0 mL水活化，將提取液轉(zhuǎn)移至HLB固相萃取柱中，流速約為1 mL/min，待提取液全部通過(guò)后，保持較強(qiáng)壓力抽氣2 min.用15 mL酸性乙腈洗脫，將洗脫液40 ℃下氮吹至0.5 mL，加入1.5 mL水，渦旋10 s，過(guò)0.22 μm濾膜，供液相色譜測(cè)定.

2.7 線性范圍和標(biāo)準(zhǔn)曲線

將標(biāo)準(zhǔn)工作液依次從低質(zhì)量濃度到高質(zhì)量濃度按確定的色譜條件進(jìn)樣，每個(gè)質(zhì)量濃度測(cè)定3次，記錄每次的峰面積.以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，利用Origin 2018軟件進(jìn)行擬合，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性方程和相關(guān)系數(shù).

2.8 檢出限和定量限的確定

最低檢出限是指在對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行定性時(shí)所能檢出的目標(biāo)物的最低含量，最低定量限是指儀器對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行定量時(shí)所能定量的最低含量，兩者通常用信噪比來(lái)衡量.當(dāng)信噪比(RSN)為3時(shí)，鹽酸硫利達(dá)嗪質(zhì)量分?jǐn)?shù)為最低檢出限，當(dāng)信噪比(RSN)為10時(shí)，鹽酸硫利達(dá)嗪質(zhì)量分?jǐn)?shù)為最低定量限[14].

2.9 回收率

在3份相同雞肉樣品中添加鹽酸硫利達(dá)嗪(添加水平分別為5.0、10.0、20.0 μg/kg)，經(jīng)過(guò)相同前處理，進(jìn)樣分析，每個(gè)樣進(jìn)6次，得相應(yīng)峰面積，計(jì)算回收率.

回收率=(加標(biāo)樣品測(cè)定值-空白樣品測(cè)定值)×100%.

2.10 精密度

3個(gè)添加水平分別為5.0、10.0、20.0 μg/kg的樣品，每個(gè)樣品按已經(jīng)確定的色譜條件重復(fù)進(jìn)樣 6 次，記錄峰面積數(shù)值，算得精密度.

精密度(RSD)=標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)/計(jì)算結(jié)果的算術(shù)平均值×100%.

2.11 樣品中鹽酸硫利達(dá)嗪含量分析

將2.6小節(jié)中處理樣品在已確定液相色譜條件下進(jìn)樣3次，觀察進(jìn)樣結(jié)果.

3 結(jié)果

3.1 最佳檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

待測(cè)樣品質(zhì)量濃度相同條件下，在高效液相色譜測(cè)定時(shí)檢測(cè)波長(zhǎng)分別設(shè)定為262、313、256 nm，在262 nm處檢測(cè)所得吸收峰面積最大(見(jiàn)表1)，最終確定262 nm為鹽酸硫利達(dá)嗪的檢測(cè)波長(zhǎng).

表1 鹽酸硫利達(dá)嗪不同吸收波長(zhǎng)和峰面積

3.2 流動(dòng)相的確定

本實(shí)驗(yàn)采用乙腈-甲酸溶液為流動(dòng)相.2個(gè)不同的比例作為流動(dòng)相進(jìn)樣后得到的譜圖如圖2所示.由圖2可知V(乙腈)∶V(甲酸溶液)=28∶72 作為流動(dòng)相時(shí)，在待測(cè)物吸收波長(zhǎng)處出現(xiàn)雙肩峰，接著出現(xiàn)明顯倒峰，峰形較差，信號(hào)響應(yīng)基線不能保持穩(wěn)定，經(jīng)優(yōu)化，在V(乙腈)∶V(甲酸溶液)=35∶65時(shí)，待測(cè)物峰型較好，附近雜峰較少.最終確定流動(dòng)相為V(乙腈)∶V(甲酸溶液)=35∶65.

圖2 2種流動(dòng)相比例吸收譜線Fig.2 Absorption spectrum of two mobile phases

標(biāo)準(zhǔn)品1：0.5 μg/mL;標(biāo)準(zhǔn)品2：0.2 μg/mL;標(biāo)準(zhǔn)品3：2.0 μg/mL圖3 3個(gè)質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)品吸收譜線Fig.3 Absorption spectra of three mass concentrations of standard substances

3.3 出峰時(shí)間、檢測(cè)時(shí)間的確定

將3個(gè)不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)樣后得到譜圖，如圖3.將不同質(zhì)量濃度工作液由低到高依次進(jìn)樣檢測(cè).隨著標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度的增大，待測(cè)物峰面積在800 s處隨之增大，可得鹽酸硫利達(dá)嗪檢測(cè)最佳時(shí)間為20 min.

3.4 提取溶劑的確定

將乙酸乙酯和乙腈對(duì)相同濃度的鹽酸硫利達(dá)嗪進(jìn)行提取，乙酸乙酯提取所得的峰面積(4.325 mAU·s)大于乙腈提取所得峰面積(2.535 mAU·s)，提取效果較好，因此選取乙酸乙酯作為鹽酸硫利達(dá)嗪的提取溶劑.

3.5 線性范圍和標(biāo)準(zhǔn)曲線

將標(biāo)準(zhǔn)工作液按已確定的條件進(jìn)行高效液相色譜分析，每個(gè)質(zhì)量濃度測(cè)定3次，得峰面積結(jié)果如表2.以不同質(zhì)量濃度對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度作為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.經(jīng)擬合，得線性方程為y=224.5x-0.009 5,相關(guān)系數(shù)r2=0.999 9,在0.1～10.0 μg/mL內(nèi)相關(guān)性良好，靈敏度為224.5，標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合較好.

表2 不同質(zhì)量濃度下的峰面積數(shù)據(jù)

3.6 回收率和精密度

3份相同空白雞肉樣品中添加等量不同添加水平的鹽酸硫利達(dá)嗪，經(jīng)過(guò)相同處理，進(jìn)樣分析，每個(gè)添加水平進(jìn)樣6次，得峰面積，計(jì)算回收率.見(jiàn)表3.由表3可知3個(gè)不同質(zhì)量濃度加標(biāo)回收率為89.84%～96.54%，回收率較好，結(jié)果滿足GB/T 27404—2008的要求，滿足實(shí)際檢測(cè)要求.

分析精密度時(shí)，采用3個(gè)不同添加水平的樣品，每個(gè)樣品重復(fù)進(jìn)樣 6 次，記錄峰面積數(shù)值.計(jì)算得鹽酸硫利達(dá)嗪峰面積的 RSD 為 0.82%、1.05%、1.11%，精密度為0.82%～1.11%，符合含量測(cè)定的要求.

3.7 檢出限與定量限

當(dāng)信噪比RSN=3時(shí)，計(jì)算出鹽酸硫利達(dá)嗪最低檢出限為1.20 μg/kg，當(dāng)信噪比RSN=10時(shí)，計(jì)算出鹽酸硫利達(dá)嗪的最低定量限為4.0 μg/kg.

3.8 樣品中鹽酸硫利達(dá)嗪含量分析

將2 000 mg雞肉樣品進(jìn)行樣品前處理操作，在已確定液相色譜條件下進(jìn)樣3次，得到譜圖(圖4)，由圖4可知，雞肉樣品中鹽酸硫利達(dá)嗪未檢出.

表3 樣品不同添加水平的回收率結(jié)果

圖4 雞肉樣品檢測(cè)色譜Fig.4 Chromatogram of chicken samples

4 討論

本研究選擇固相萃取結(jié)合高效液相色譜技術(shù)研究了雞肉中鹽酸硫利達(dá)嗪含量的分析方法.在確定鹽酸硫利達(dá)嗪最佳檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)，NY/T 1458—2007標(biāo)準(zhǔn)中，液相色譜條件規(guī)定同步測(cè)定多種鎮(zhèn)靜劑時(shí)的檢測(cè)波長(zhǎng)為251 nm，并非鹽酸硫利達(dá)嗪的最佳吸收波長(zhǎng)，因此本研究對(duì)檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)比3個(gè)特征波長(zhǎng)的峰面積，確定最佳檢測(cè)波長(zhǎng)為262 nm;流動(dòng)相比例的改變會(huì)影響出峰效果，優(yōu)化結(jié)果可知，在V(乙腈)∶V(甲酸溶液)=28∶72時(shí)，待測(cè)物峰出現(xiàn)雙肩峰和倒峰現(xiàn)象，峰形較差，在V(乙腈)∶V(甲酸溶液)=35∶65時(shí)，峰形對(duì)稱性好.

對(duì)樣品前處理?xiàng)l件優(yōu)化：用乙酸乙酯和乙腈分別提取含有相同含量的鹽酸硫利達(dá)嗪雞肉樣品，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，樣品經(jīng)乙酸乙酯提取后，進(jìn)樣測(cè)得的峰面積更大，即提取效果更好，所以確定乙酸乙酯為最佳提取劑，與許世富[15]提取豬肉中氯丙嗪方法中的提取效果具有一致性.固相萃取技術(shù)具有簡(jiǎn)單方便、樣品凈化效果好、回收率高等優(yōu)點(diǎn)，經(jīng)萃取凈化后可直接用于液相色譜檢測(cè)[16-17].

在最佳前處理和色譜條件下，選擇更簡(jiǎn)單準(zhǔn)確的外標(biāo)定量分析方法[18]進(jìn)行測(cè)定.通過(guò)外標(biāo)法建立的鹽酸硫利達(dá)嗪高效液相色譜檢測(cè)方法，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，靈敏度高，精密度為0.82%～1.11%，加標(biāo)回收率為89.84%～96.54%，回收率滿足GB/T 27404—2008的要求.此實(shí)驗(yàn)方法成本低，且操作簡(jiǎn)單，易實(shí)現(xiàn)，可作為小型實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)雞肉中鹽酸硫利達(dá)嗪殘留量的方法推廣應(yīng)用.