唐連發(fā)，王琴，唐兆鑫，楊晴晴

(河北大學(xué) 生態(tài)環(huán)境學(xué)院(籌)，河北 保定 071002)

土壤酶由植物根系和土壤微生物分泌[1]．在植物—土壤元素循環(huán)中，酶對有機分子的降解和礦化起著重要的作用，土壤中胞外酶揭示了土壤的C、N、P循環(huán)[2]．土壤胞外酶穩(wěn)定性好，可長時間保持高的酶活性[3]．它們在環(huán)境受到脅迫后的響應(yīng)能力，使其成為評價土壤微生物質(zhì)量的潛在指示劑[4]．在有關(guān)土壤生態(tài)學(xué)以及土壤微生物的測定中，關(guān)鍵土壤酶活性的測定成為必不可少的指標(biāo)[2]．

對采集的土壤立即進行分析可能是最接近實際情況的，但由于各方面的限制較難實現(xiàn)，因此就需要采用適宜的方法來保存土壤，這可能影響到土壤胞外酶的活性，但不同類型土壤酶活性的差異仍可得以保留[5]．在特定的實驗條件下使用人工底物測量土壤胞外酶活性，大多采用熒光法或吸光度法[6]．熒光法測定土壤胞外酶活性與吸光度法相比具有靈敏性高、所需樣本量少、高通量、耗時短等優(yōu)點，但同時也存在著底物較貴、底物和標(biāo)準(zhǔn)品難溶解等缺點[7]．在熒光法測定土壤胞外酶活性的實驗中，緩沖溶液與土壤混勻是土壤酶提取的重要一步，其作用在于破壞土壤團聚體將土壤酶充分釋放出來，但不同類型的土壤使用相同的緩沖溶液可能對不同土壤酶的提取存在差異[1]．大多采用漩渦震蕩將緩沖溶液與土壤混勻，使土壤中的酶與底物發(fā)生完全反應(yīng)[8]．不同酶與底物充分反應(yīng)所需的培養(yǎng)時間不同，大多為4 h[9-12]．酶與底物充分反應(yīng)還會受到培養(yǎng)溫度的影響，在合適的溫度下培養(yǎng)更能獲得實際的土壤中酶活性情況．因土壤類型不同、酶的種類不同等，可能在可控的實驗步驟方面存在一定的差異，需要逐項優(yōu)化．

本研究檢測了根際土壤中5種關(guān)鍵的胞外酶：纖維素降解的β-葡萄糖苷酶(βG)[13]，從甲殼素中釋放出含氮小氨基糖的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)[14]，將纖維素分解為纖維二糖、果糖和葡萄糖的纖維二糖水解酶(CBH)[15]，水解蛋白質(zhì)和多肽的亮氨酸氨基肽酶(LAP)，礦化有機磷的堿性磷酸酶(AKP)[16]．通過測定不同緩沖溶液提取、不同混勻方式、不同培養(yǎng)溫度、不同培養(yǎng)時間等對酶活性的影響，確定熒光法測定5種土壤胞外酶活性的最佳參數(shù)，為其標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考．

1 材料與方法

1.1 土壤樣本的選擇

選取來自不同類型宿主的根際土壤樣本.刺槐(RobiniapseudoacaciaLinn)和一年生的歐美雜交楊‘546’(Populusdeltoidescv.′55/56′×P.deltoidescv. ′Imperial′，高敏感性，含有典型臭氧敏感性差異楊樹基因型)，均來自北京延慶地區(qū)臭氧實驗基地(40.47° N，116.34° E)．樹木種植在20 L的塑料花盆中，盆內(nèi)裝有從附近農(nóng)田采集的0～10 cm深度的棕色砂壤土．生長5個月后取植物根際土，過2 mm篩用于測定土壤理化指標(biāo)，再過1 mm篩用于測定土壤胞外酶活性，密封袋保存后快速運回實驗室-20 ℃冷凍保存．

1.2 土壤理化指標(biāo)的測定

土壤pH采用國標(biāo)法，使用pH計(ST3100，奧豪斯)進行測定[17]．

含水率：土壤過1 mm篩，110 ℃至恒質(zhì)量，計算含水率．

含水率=(濕土質(zhì)量-烘干土質(zhì)量)/烘干土質(zhì)量×100%．

有機質(zhì)、全氮、全磷、全鉀、堿解氮、有效磷和速效鉀的測定均采用鮑士旦[18]所記錄的方法．所測得楊樹土壤理化指標(biāo)見表1．

表1 根際土壤的理化指標(biāo)

1.3 相關(guān)溶液的配制

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為4-甲基傘形酮(MUB)和7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)(麥克林試劑)．LAP的參考標(biāo)準(zhǔn)是AMC，其余4種酶是MUB[19]．本研究以MUB和AMC的偶聯(lián)物作為底物[19-20]，其原理是：5種酶分解其特異性的底物，其底物中包含的熒光物質(zhì)MUB、AMC被釋放出來，通過測定熒光強度值，將酶活性轉(zhuǎn)化為所產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)物的量．在Merck網(wǎng)站上(https://www.sigmaaldrich.cn)，MUB在甲醇中的溶解度為50 mg/mL；AMC在丙酮中的溶解度為10 mg/mL．另有文獻采用另一種極佳的有機溶劑DMSO(二甲基亞砜)作為溶劑[21]．本研究中MUB和AMC標(biāo)準(zhǔn)物采用甲醇作為溶劑，超純水稀釋(AMC在超純水中溶解較好)，配制濃度為40 mmol/L．

1.3.2 底物溶液的配制

底物濃度200 μmol/L，底物溶劑為超純水，其中βG底物需超聲使其徹底溶解．有文獻使用底物濃度4 μmol/L[22]，但大多數(shù)文獻使用200 μmol/L[23-24]，后者可使大多數(shù)土壤樣品分解[20, 24]．所配溶液分裝且用錫紙包裹后，放入4 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫玫孜镆姳?(羅恩試劑)．

表2 所測土壤胞外酶及相應(yīng)底物

1.3.3 土壤胞外酶活性測定的操作步驟及計算方法

稱取1 g土壤于50 mL離心管中，加入緩沖溶液，振蕩混勻，制備土壤均質(zhì)懸濁液．先將土壤懸濁液(在磁力攪拌器上取樣)、超純水加入黑色96孔酶標(biāo)板(上海WHB)，然后在暗處加入底物溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液．加入完成后，在黑暗條件下使用恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)．培養(yǎng)完成后在每孔中加入10 μL、1 mol/L的NaOH(終止反應(yīng)，增加熒光強度)，反應(yīng)1 min后使用酶標(biāo)儀(美國/Biotek，Cytation5，激發(fā)365 nm，發(fā)射450 nm)測定熒光值．各孔加入物質(zhì)[25]見表3.

表3 黑色96孔酶標(biāo)板各孔加入物質(zhì)

計算方法:

酶活=(凈熒光值×緩沖溶液體積)/(發(fā)射系數(shù)×懸濁液體積×培養(yǎng)時間×土壤干質(zhì)量).

其中，

凈熒光值=(樣品微孔的熒光值-樣品控制孔的熒光值)/淬滅系數(shù)-基底控制孔的熒光值；淬滅系數(shù)=(淬火標(biāo)準(zhǔn)孔的熒光值-樣品控制孔的熒光值)/參考標(biāo)準(zhǔn)孔的熒光值；發(fā)射系數(shù)=參考標(biāo)準(zhǔn)孔的熒光值/(參考標(biāo)準(zhǔn)物濃度×參考標(biāo)準(zhǔn)物體積).

1.4 實驗設(shè)計

1.4.1 緩沖溶液的選擇

分別選取乙酸鈉(0.2 mol/L，pH 5.8)、檸檬酸-檸檬酸鈉(0.2 mol/L，pH 6.6)、PBS(0.2 mol/L，pH 7.5)、超純水4種溶液作為緩沖溶液．

1.4.2 混勻方式的選擇

選取幾種常用的混勻方式，混勻時間根據(jù)經(jīng)驗設(shè)置．本研究中所用的混勻方式見表4．

表4 本研究所用的混勻方式

1.4.3 培養(yǎng)溫度的選擇

恒溫培養(yǎng)箱(SPX型智能生化培養(yǎng)箱)設(shè)置3個不同的溫度(20、25、30 ℃)．

1.4.4 培養(yǎng)時間的選擇

每種酶的培養(yǎng)時間分別為1、2、3、4、5、6 h．

2 結(jié)果

2.1 緩沖溶液對酶活的影響

稱取楊樹、刺槐根際土壤各1 g，分別加入1.4.1中不同的緩沖溶液30 mL，搖床搖勻1 h，25 ℃培養(yǎng)5 h，酶活測定結(jié)果見圖1.

a.楊樹;b.刺槐圖1 緩沖溶液對酶活的影響Fig.1 Effect of buffer solutions on the enzyme activities

由圖1可知，不同樹種之間對緩沖溶液的反應(yīng)是一致的．AKP、βG、LAP在以超純水為緩沖溶液的情況下，酶活最高；CBH、NAG在乙酸鈉為緩沖溶液的情況下，酶活最高．

本研究的土壤均呈弱堿性，而乙酸鈉、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液屬于酸性．由乙酸鈉緩沖溶液測得的CBH、NAG酶活最高，但是測得的βG酶活很低．PBS作為緩沖溶液測得的AKP酶經(jīng)計算得出的酶活為負值(圖1中取0)，PBS可能并不適合作為測定土壤胞外酶酶活的緩沖溶液，至少不適合本研究土壤中的AKP酶活的測定．

2.2 混勻方式對酶活的影響

稱取5份刺槐根際土壤各1 g，加入超純水30 mL，分別以1.4.2中5種方法混勻處理，25 ℃培養(yǎng)4 h．所用底物從4 ℃冰箱中取出，置于室溫避光處放置12 h，酶活測定結(jié)果見圖2.

圖2 混勻方式對酶活的影響Fig.2 Effect of mixing methods on the enzyme activities

由圖2可知，使用漩渦混合器提取出的AKP、βG、CBH酶活最高．搖床1 h，提取出的NAG、LAP酶活最高．使用超聲清洗器提取的酶活較小，可能由于超聲時間過長，破壞了酶的結(jié)構(gòu)．超聲后又經(jīng)立式混勻器混勻提取的βG、CBH、NAG酶活非常低，AKP、LAP酶活也有所降低．使用立式混勻器可能由于轉(zhuǎn)速不夠的原因，所測得LAP酶活與搖床相比較低．雖然經(jīng)不同混勻方式提取的酶活不同，但每種方式下5種酶的酶活趨勢基本一致(AKP>LAP>CBH>βG/NAG)．

2.3 培養(yǎng)溫度對酶活的影響

稱取楊樹根際土壤1 g，加入30 mL超純水，漩渦混勻5 min后，將土壤懸濁液稀釋10倍，25 ℃培養(yǎng)5 h．所用底物、標(biāo)準(zhǔn)品從4 ℃冰箱中取出，置于室溫避光處放置24 h，酶活測定結(jié)果見圖3.

圖3 培養(yǎng)溫度對酶活的影響Fig.3 Effect of culture temperatures on the enzyme activities

由圖3可知，除LAP經(jīng)30 ℃和20 ℃培養(yǎng)相差不大以外，其余酶的趨勢基本為25 ℃培養(yǎng)的酶活>30 ℃培養(yǎng)的酶活>20 ℃培養(yǎng)的酶活．

2.4 培養(yǎng)時間對酶活的影響

稱取楊樹根際土壤1 g，加入30 mL超純水，漩渦混勻5 min后，將土壤懸濁液稀釋10倍，25 ℃培養(yǎng)．根據(jù)酶的培養(yǎng)時間曲線，判斷5種酶最佳的培養(yǎng)時間，結(jié)果見圖4．

由圖4可知，在培養(yǎng)4 h的情況下，AKP、βG的酶活隨著培養(yǎng)時間延長呈上升趨勢，在4 h時達到最高值．隨后繼續(xù)分別培養(yǎng)5、6 h，AKP的酶活在培養(yǎng)5、6 h呈現(xiàn)下降趨勢(酶活分別為303.63、253.25 nmol/(g·h))，βG的酶活也在培養(yǎng)5、6 h呈現(xiàn)下降趨勢(酶活分別為12.25、8.76 nmol/(g·h))．LAP酶活最高點在1 h，然后隨著時間呈波浪變化，但始終沒有超過1 h時的酶活．CBH、NAG的酶活隨時間不斷變化，CBH酶活在2 h時達到最高值，NAG的酶活在3 h時達到最高值．

2.5 優(yōu)化后參數(shù)的應(yīng)用

根據(jù)1.4實驗設(shè)計優(yōu)化后的條件，選取楊樹根際土壤進行5種酶酶活的測定，結(jié)果見圖5.

圖4 培養(yǎng)時間對酶活的影響Fig.4 Effect of culture times on the enzyme activities

圖5 楊樹根際土壤胞外酶的酶活Fig.5 Activities of extracellular enzymes in the rhizosphere soil of poplar

由圖5可知，楊樹根際土壤中AKP、LAP的酶活遠高于其他3種酶，βG、CBH、NAG的酶活均小于40 nmol/(g·h)．上述實驗中5種土壤胞外酶AKP、βG、CBH、NAG、LAP的活性(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)分別為(237.70±74.72)、(24.68±6.20)、(17.05±2.76)、(26.38±3.03)、(289.70±130.60)nmol/(g·h)．

3 討論

采用熒光法測定土壤胞外酶活性，是一種高通量且簡便的方法．標(biāo)準(zhǔn)品 MUB 和AMC較難溶解，本研究中用甲醇作溶劑，再用超純水稀釋到相應(yīng)濃度.研究過程中發(fā)現(xiàn)SynergyHTX酶標(biāo)儀(使用鎢絲燈，用濾光片作為光源)的檢測范圍較低(100～6 000)，測得的熒光值較?。籆ytation5酶標(biāo)儀(使用氙閃燈，單色器作為光源)的檢測范圍較高(10 000～3 000 000)、靈敏度高，故本研究采用Cytation5酶標(biāo)儀進行測定.研究還發(fā)現(xiàn)文獻中使用的水土比30∶1(mL∶g)較低[26]，實驗過程中用此水土比測得的熒光值較大，所以本研究加大了水土比，圖3為在水土比30∶1(mL∶g)再稀釋10倍的條件下計算出的土壤胞外酶酶活，此時實際水土比為300∶1(mL∶g).

測試土壤樣本均來自相同類型的土壤，因其宿主植物差異，根際土壤的理化性質(zhì)并不完全一致，其有機質(zhì)是影響土壤酶活性的關(guān)鍵因子[2, 27]．本研究中不同樣本之間的pH、有機質(zhì)的含量相似．乙酸鈉是測定這5種土壤胞外酶酶活常用的緩沖溶液，其所測定的土壤多呈酸性[9, 28-29]．本研究發(fā)現(xiàn)CBH、NAG在用乙酸鈉緩沖液提取時測得的酶活最高，AKP、βG、LAP在用超純水提取時測得的酶活最高．

對于混勻方式來說，使用XH-C漩渦混合器混勻5 min，測得AKP、βG、CBH酶活性最高，搖床混勻60 min所得NAG、LAP酶活最高．可能XH-C漩渦混合器的功率及時間、搖床的轉(zhuǎn)速及時間都對酶活有影響，這就需要根據(jù)不同樣本性質(zhì)多次測定所得的經(jīng)驗進行選擇．有研究發(fā)現(xiàn)，不同酶之間有著不同的最佳攪拌時間[8]．梅孔燦等[28]在測定βG、CBH中，使用磁力攪拌器攪拌5 min．當(dāng)樣本較少時，選擇漩渦混合器省時省力；當(dāng)樣本數(shù)較多時，選擇搖床可一次混勻所有的樣本．

在水解酶的培育時間上各學(xué)者都有不同選擇，李歡等[30]在對這5種酶的測定中，采用黑暗下培育2 h；杜璨[26]在對CBH、βG、NAG的測定中采用黑暗下培育4 h；Brockett等[24]在對CBH、βG、NAG的測定中分別培育3、7、3 h；賈淑嫻等[8]在對CBH、βG、NAG測定方法探究上，證明這3種酶培養(yǎng)4 h是最佳的．培養(yǎng)時間在4 h內(nèi)是多數(shù)研究者所采用的時間.本研究設(shè)置培養(yǎng)時間為1～6 h，發(fā)現(xiàn)AKP、βG的最優(yōu)培養(yǎng)時間是4 h，LAP是1 h，CBH是2 h，NAG是3 h．溫度對土壤胞外酶活性有著重要的影響[27]．通過實驗測定，發(fā)現(xiàn)在25 ℃下5種土壤胞外酶的酶活均為最高，在20 ℃下培養(yǎng)的5種酶的酶活均為最低，這5種酶的最佳培養(yǎng)溫度為25 ℃左右(較20 ℃和30 ℃來說)，培養(yǎng)溫度可能需要根據(jù)實際采樣時的溫度來設(shè)置，比如：福建省4月份采樣，實驗設(shè)置的培養(yǎng)溫度為20 ℃[28]；云南元謀縣采樣土壤年均溫度23.4 ℃，實驗設(shè)置的培養(yǎng)溫度為25 ℃[29]．25 ℃幾乎是本研究中土壤樣本采集時的溫度，也比較符合實際的情況．徐國慶[31]用熒光法測定施加污泥生物碳的楊樹土壤酶的酶活，βG、LAP、NAG酶活依次是140～240、10～20、50～80 nmol/(g·h)．本研究結(jié)果與之相比較，βG活性較小，LAP活性較大．βG是有關(guān)C分解的酶，LAP是有關(guān)N分解的酶，根據(jù)土壤酶化學(xué)計量學(xué)[26]，本研究樣本可能受到了微生物的N限制．

4 結(jié)論

本研究依據(jù)熒光法優(yōu)化了土壤中常見的5種胞外酶酶活的測定方法，考察了不同的混勻方式、不同緩沖溶液提取、不同培養(yǎng)溫度、不同培養(yǎng)時間等因素對酶活的影響．結(jié)果得出：在使用Cytation5等高靈敏度的酶標(biāo)儀測定時所采用水土比值應(yīng)高于300∶1(mL∶g)．轉(zhuǎn)速會影響土壤胞外酶提取，若選擇較高轉(zhuǎn)速則應(yīng)相對減少混勻時間．基于以下土壤胞外酶測試的關(guān)鍵參數(shù)可獲得最大酶活：測定AKP、βG時用超純水作為緩沖溶液，用XH-C漩渦混勻器(功率60 W)混勻土壤5 min，在25 ℃培養(yǎng)4 h；測定CBH時用乙酸鈉(0.2 mol/L，pH 5.8)作為緩沖溶液，用XH-C漩渦混勻器(功率60 W)混勻土壤5 min，在25 ℃培養(yǎng)2 h；測定NAG時用乙酸鈉(0.2 mol/L，pH 5.8)作為緩沖溶液，搖床(150 r/min)混勻60 min，在25 ℃培養(yǎng)3 h；測定LAP時用超純水作為緩沖溶液，搖床(150 r/min)混勻60 min，在25 ℃培養(yǎng)1 h．本研究結(jié)果可為提高熒光法準(zhǔn)確測定土壤胞外酶活性提供依據(jù)．