趙長云，石海春，羅 婷，許秀蘭，余學杰，柯永培

(1.四川農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，四川 溫江 611130；2.四川正紅生物技術(shù)有限責任公司，成都 610213)

種質(zhì)資源是育種的物質(zhì)基礎(chǔ)，對選育優(yōu)良玉米雜交種具有重要作用[1-5]。研究表明，目前我國玉米遺傳基礎(chǔ)狹窄，創(chuàng)新資源少，是制約玉米育種取得新突破的主要原因之一[6-10]。因此，對玉米種質(zhì)資源進行改良、創(chuàng)新和利用，是目前玉米育種的重要課題?；亟环芸焖俚叵蜉喕赜H本導入其優(yōu)良性狀的基因，且不同供體和回交次數(shù)所創(chuàng)制的玉米自交系遺傳差異較大，因此回交法是擴增玉米新種質(zhì)、提高自交系選育效率的有效方法之一[11-13]。蔣銘澤[13]和蘭琴英[14]以不同供體和回交次數(shù)對玉米自交系的遺傳改良效果進行了相關(guān)研究，但其回交次數(shù)有限。因此，進一步系統(tǒng)研究不同供體和回交次數(shù)對玉米自交系的遺傳改良效應(yīng)，對玉米回交育種具有重要的指導意義。玉米自交系K 11具有莖稈堅韌、株型好等優(yōu)點，但結(jié)實性較差、產(chǎn)量低；玉米自交系K 62具有結(jié)實性好、產(chǎn)量配合力高等優(yōu)點，但株高和穗位偏高。本研究以玉米自交系K 11和K 62為輪回親本，分別選用具有不同優(yōu)良性狀的自交系為供體親本，通過不同回交次數(shù)育成的36個改良系為材料，比較研究改良系與輪回親本間的主要性狀差異，并結(jié)合SSR分子標記技術(shù)，分析改良系與輪回親本間的遺傳差異，為進一步研究應(yīng)用提供依據(jù)。

表1 36個改良系的系譜來源Table 1 Pedigree sources of 36 improved lines

1 材料與方法

1.1 供試材料及選育過程

2013年春季，在四川正紅生物技術(shù)有限責任公司(以下簡稱公司)遼寧鐵嶺育種基地，配制6個雜交組合，分別是KA 457×K 11、KS 141×K 11、DM 882×K 11、KS 322×K 62、KS 162×K 62、K 11×K 62；2013年冬季在海南陵水，以K 11作輪回親本分別與雜交組合KA 457×K 11、KS 141×K 11、DM 882×K 11回交，以K 62作輪回親本分別與KS 322×K 62、KS 162×K 62、K 11×K 62回交，得到相應(yīng)的BC1F1群體，同時6個雜交組合選優(yōu)株自交得到F2群體；2014年春季在鐵嶺種植BC1F1和F2群體，從BC1F1群體中選優(yōu)株與相應(yīng)輪回親本K 11和K 62分別回交得到對應(yīng)的BC2F1群體，同時在BC1F1群體中選優(yōu)株自交得BC1F2群體，在F2群體中繼續(xù)選優(yōu)株自交得F3群體；2014年冬季在陵水、2015年春季在鐵嶺、2015年冬季在陵水分別重復上述操作，獲得對應(yīng)的F6、BC1F5、BC2F4、BC3F3、BC4F2、BC5F1群體，2016年春季在鐵嶺種植上述6個世代群體并分別選優(yōu)株自交獲得對應(yīng)的F7、BC1F6、BC2F5、BC3F4、BC4F3、BC5F2群體。2016年冬季在陵水種植上述6個世代群體并分別選優(yōu)株自交獲得對應(yīng)的F8、BC1F7、BC2F6、BC3F5、BC4F4、BC5F3群體，育成遺傳穩(wěn)定一致的36個回交改良系，其系譜來源見表1。

1.2 田間試驗方法

2017年春季在鐵嶺基地種植輪回親本K 11、K 62和36個回交改良系，采用間比法排列，兩行區(qū)，不設(shè)重復。試驗行長為5 m，過道1 m，行距0.58 m，株距0.25 m，單株留苗，密度為68 965株/hm2，每小區(qū)取中間30株調(diào)查數(shù)據(jù)資料。

表2 改良系各性狀的方差分析(MS值)Table 2 Analysis of variance on traits for improved lines (MS-value)

1.3 性狀調(diào)查項目與方法

田間調(diào)查株高、穗位高、雄穗分枝數(shù)、雄穗長和總?cè)~片數(shù)，室內(nèi)考查穗長、禿尖長、穗行數(shù)、行粒數(shù)以及百粒重，計算單株產(chǎn)量。

1.4 分子標記鑒定方法

對36個回交改良系和2個輪回親本DNA進行SSR-PCR擴增，擴增產(chǎn)物采用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染觀察結(jié)果，按照NY/T 1432—2014《玉米品種鑒定技術(shù)規(guī)程 SSR標記法》進行鑒定[15]。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

1.5.1主要性狀差異比較

以單株所測性狀值為單位，利用DPS v 7.05軟件對各性狀值進行方差分析，檢驗不同基因型間各性狀的差異顯著性；并利用孔繁玲[16]的最小顯著差數(shù)法(LSD法)比較各性狀在改良系與相應(yīng)輪回親本間的差異顯著性。

1.5.2SSR數(shù)據(jù)分析

電泳結(jié)果，有帶記為“1”，無帶記為“0”，建立SSR數(shù)據(jù)庫。根據(jù)Nei和Li[15]所提出的計算遺傳相似系數(shù)的算法[GS=2Nxy/(Nx+Ny)]，用類平均法(UPGMA)通過NTSYSpc 2.10 e軟件進行聚類分析，遺傳差異位點判斷參照《玉米品種鑒定技術(shù)規(guī)程 SSR標記法》(NY/T 1432—2014)。以上分析均在Excel 2007和SPSS 17.0軟件上進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 改良系主要性狀表現(xiàn)

2.1.1方差分析

36個改良系和2個輪回親本主要性狀方差分析結(jié)果(表2)表明，改良系間全部性狀差異均達到極顯著水平，說明這些性狀在改良系間存在真實差異。

2.1.2改良系與輪回親本主要農(nóng)藝性狀比較

經(jīng)比較分析主要農(nóng)藝性狀可知，不同改良系間同一性狀差異較大。K 11較A 3-1等8個改良系的株高極顯著降低；較A 3-1等7個改良系的穗位高顯著或極顯著降低；較A 2-2等4個改良系的雄穗分支數(shù)顯著或極顯著增多；較A 3-1等14個改良系的總?cè)~片數(shù)顯著或極顯著減少。K 62較B 1-2等8個改良系的株高顯著或極顯著降低；較B 1-1等10個改良系的穗位高顯著或極顯著降低；較B 3-2等8個改良系的雄穗分支數(shù)極顯著增多；較B 3-0等5個改良系的雄穗長顯著或極顯著長于K 62；較B 2-1等6個改良系的總?cè)~片數(shù)顯著或極顯著減少。

2.1.3供體對主要農(nóng)藝性狀的改良效應(yīng)

比較不同供體改良系與相應(yīng)輪回親本主要農(nóng)藝性狀(表3)可知，K 11改良系，供體A 2和A 3對降低株高和穗位高的改良效果明顯，供體A 2對增加雄穗分支數(shù)的改良效果較好，供體A 1、A 2和A 3均對減少總?cè)~片數(shù)具有較好的改良效果；K 62改良系，供體B 1和B 2對降低株高和穗位高的改良效果好，供體B 3對增加雄穗分支數(shù)的改良效果較好，供體B 1和B 3對縮短雄穗長的改良效果好，供體B 1、B 2和B 3均對減少總?cè)~片數(shù)有一定的改良效果。

2.1.4回交次數(shù)對主要農(nóng)藝性狀的改良效應(yīng)

分析不同回交次數(shù)改良系主要農(nóng)藝性狀(表4)可知，回交1～5次對降低株高、穗位高和減少總?cè)~片數(shù)均具有一定的效果，但不同回交次數(shù)對這些性狀的改良效果差異不明顯。

2.1.5改良系與輪回親本主要產(chǎn)量性狀比較

經(jīng)比較分析主要產(chǎn)量性狀可知，K 11改良系，A 1-2和A 3-0的穗長極顯著增長；A 3-2等11個改良水平的個數(shù)。下同。

表3 不同供體對主要農(nóng)藝性狀的改良效應(yīng)Table 3 Improved effects of different donors on main agronomic traits

表4 不同回交次數(shù)對主要農(nóng)藝性狀的改良效應(yīng)Table 4 Improvement effects of different back-cross times on main agronomic traits

表5 不同供體對主要產(chǎn)量性狀的改良效應(yīng)Table 5 Improved effects of different donors on major yield traits

系的禿尖長顯著縮短；A 3-1等7個改良系的穗行數(shù)顯著或極顯著增多；A 3-2等14個改良系的行粒數(shù)極顯著增多；A 3-3等7個改良系的百粒重顯著或極顯著增加；A 3-3等15個改良系的單株產(chǎn)量顯著或極顯著增加。K 62改良系，B 1-1等13個改良系的穗長顯著或極顯著增長；B 1-1的穗行數(shù)顯著增多；B 1-4的行粒數(shù)顯著增多；B 1-0和B 3-3的百粒重顯著或極顯著增加；B 2-5和B 1-4的單株產(chǎn)量顯著增加。

2.1.6供體對主要產(chǎn)量性狀的改良效應(yīng)

比較分析不同供體改良系與相應(yīng)輪回親本主要產(chǎn)量性狀(表5)可知，K 11改良系，供體A 1、A 2和A 3均能有效增加穗行數(shù)和行粒數(shù)，減少禿尖長，供體A 1對提高百粒重的改良效果明顯，這3個供體對提高單株產(chǎn)量具有顯著的改良效果；對于K 62改良系，供體B 1、B 2和B 3能顯著增加穗長，這3個供體對穗行數(shù)、行粒數(shù)、百粒重和單株產(chǎn)量的改良效果差異不明顯。

表6 不同回交次數(shù)對主要產(chǎn)量性狀的改良效應(yīng)Table 6 Improved effects of different back-cross times on main yield traits

表7 40對SSR引物檢測結(jié)果Table 7 Detected results of 40 pairs of SSR primers

2.1.7回交次數(shù)對主要產(chǎn)量性狀的改良效應(yīng)

分析不同回交次數(shù)改良系主要產(chǎn)量性狀(表6)可知，回交0～5次對增加穗長、行粒數(shù)和單株產(chǎn)量均有一定的改良效果，不同回交次數(shù)對這些性狀的改良效果差異不明顯。

2.2 改良系SSR標記遺傳變異

2.2.1SSR標記擴增結(jié)果

用40對SSR引物，對2個輪回親本和36個回交改良系進行SSR擴增，結(jié)果(表7)表明，40對引物共檢測到81個基因型，平均每個引物檢測到2.025個，共檢測到99個等位基因片段，平均2.475個。引物bnlg 490 y 4d對38個自交系的擴增結(jié)果見圖1。

2.2.2SSR聚類分析

以遺傳相似系數(shù)0.86為閾值，采用類平均法(UPGMA)進行聚類分析，可將其劃分為五大類群。聚類結(jié)果如圖2所示，改良系A(chǔ) 3-1、A 3-0與A 2-0分別單獨聚為1類，來自K 11的除B 1-0外其余改良系與K 11聚為一類，來自K 62的改良系全部與K 62聚為一類。聚類結(jié)果與回交改良系的系譜來源基本一致。

圖1 引物bnlg 490 y 4d對38個自交系的擴增結(jié)果Fig.1 Amplification results of 38 inbred lines with primer bnlg 490 y 4d

圖2 改良系SSR聚類分析Fig.2 Clustering diagram of improved lines by SSR markers

2.2.3SSR標記差異位點數(shù)分析

根據(jù)NY/T 1432—2014標準，統(tǒng)計改良系與其相應(yīng)輪回親本K 11和K 62在40對SSR引物上存在的標記差異位點數(shù)(表8)。K 11改良系，SSR標記差異位點數(shù)最多的是A 3-0，達29個，最少的是A 3-5，與K 11無差異，供體A 1、A 2和A 3改良系與輪回親本K 11的平均差異位點數(shù)分別為5.0個、9.3個和10.2個；K 62改良系，SSR標記差異位點數(shù)最多為B 1-0，達25個，最少為B 2-5等6個改良系，它們與K 62差異位點數(shù)為0，供體B 1、B 2和B 3改良系與輪回親本K 62的平均差異位點數(shù)分別為7.3個、5.3個和1.7個?？梢?，不同供體改良系與輪回親本之間SSR標記位點數(shù)存在較大差異。

將改良系與其相應(yīng)輪回親本的SSR標記差異位點數(shù)求平均數(shù)(表9)?？梢?，回交0～5次K 11改良系與K 11之間的平均差異位點數(shù)分別為20.7～1.3個，且回交4次以后，有A 1-5等5個改良系與K 11的差異位點數(shù)為0～2個；回交0～5次K 62改良系與K 62之間的平均差異位點數(shù)分別為13.3～0個，且回交4次以后，全部改良系與K 62的差異位點數(shù)為0～1個。說明K 11改良系和K 62改良系與其相應(yīng)輪回親本在分子水平上的遺傳差異隨著回交次數(shù)的增多而減小，在回交4次以后與輪回親本非常近似或相同。

3 討論與結(jié)論

3.1 不同供體和回交次數(shù)對農(nóng)藝性狀的改良效應(yīng)

回交法是改良自交系的個別缺點、育成優(yōu)良自交系的有效方法之一，該方法應(yīng)用非常靈活[17-20]。

表8 不同供體改良系與輪回親本之間的SSR標記差異位點數(shù)Table 8 Number of variation loci between recurrent parents and improved lines derived from different donors based on SSR marker

表9 不同回交次數(shù)改良系與輪回親本之間的SSR標記差異位點數(shù)Table 9 Number of variation loci between recurrent parents and improved lines from different backcrossing times based on SSR marker

喬善寶等[12]對改良系田間出苗率和大斑病抗性的研究表明，相同回交次數(shù)不同供體回交的改良效果不同，回交1次自交2次選系優(yōu)于回交2次自交1次選系；郭海鰲[21]采用回交1～3次對玉米自交系矮331的改良研究表明，回交1次對株高和單株產(chǎn)量的改良效果較好。本研究表明，不同供體和回交次數(shù)對輪回親本K 11和K 62不同性狀的改良效果均存在差異。供體A 2、A 3、B 1和B 2對降低株高、穗位高和減少總?cè)~片數(shù)的改良效果較好，供體A 2和B 3具有增加雄穗分支數(shù)的效應(yīng)；供體A 1、A 2和A 3能有效增加穗行數(shù)和行粒數(shù)，減少禿尖長，從而提高單株產(chǎn)量；供體B 1、B 2和B 3雖然能顯著增加穗長，但同時增加了禿尖長，因而對單株產(chǎn)量改良效果不明顯?；亟?～5次對降低株高、穗位高、減少總?cè)~片數(shù)、增加穗長、行粒數(shù)和單株產(chǎn)量具有一定的改良效果，但是不同回交次數(shù)對這些性狀的改良效果差異不明顯。因此，育種實踐上應(yīng)根據(jù)改良目標，選擇具有目標優(yōu)良性狀的供體親本回交1～2次即可。

3.2 不同供體和回交次數(shù)改良系SSR標記遺傳差異

研究改良系與輪回親本間的分子遺傳變異，能有效地提高回交育種效率，并能為種質(zhì)改良和利用提供一定的理論依據(jù)[13,22-23]。喬善寶等[12]利用SSR引物對R 08回交改良群體的遺傳差異研究表明，相同回交次數(shù)不同供體選系所創(chuàng)造的遺傳變異存在較大差異，相同供體回交1～2次選系間沒有明顯差異。本試驗通過SSR標記研究，輪回親本與其改良系之間的聚類結(jié)果與系譜來源基本一致；不同供體K 11和K 62改良系與相應(yīng)輪回親本間的平均SSR標記差異位點數(shù)變幅為1.7～10.2個；回交0～5次改良系與2個輪回親本間的平均差異位點數(shù)分別為20.7～1.3個和13.3～0個，平均差異位點數(shù)隨著回交次數(shù)的增加而減少，并且回交4次以上多數(shù)改良系與輪回親本間差異位點僅有0～2個，可判定為相同或相似系。因此，實際育種中在選擇優(yōu)良供體的同時，回交次數(shù)不宜超過3次。