過量表達(dá)NtCAF1基因?qū)煵菹倜芏鹊挠绊?/h1>
2022-12-22 01:53宮沛文吳秀雙孟淑真吳擁軍
種子 2022年11期
宮沛文，吳秀雙，孟淑真，陳 曦，吳擁軍
(貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物工程研究院，山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽 550025)
煙草是主要的經(jīng)濟(jì)作物之一，在世界各地均有大面積栽培[1]。植物腺毛對植物抗逆境脅迫、植物病蟲害防治等有很大影響。煙草的長柄腺毛是二萜和糖脂合成的重要場所，二萜和糖脂不僅是重要香氣物質(zhì)前體，對蚜蟲抗性也有較大影響。而短柄腺毛是葉面抗性蛋白的合成場所，葉面抗性蛋白在抑制孢子萌發(fā)和抵抗真菌侵染中起重要作用[2]。腺毛主要分布在植物莖、葉的表面，其發(fā)育受多種植物激素等內(nèi)部信號及光、溫等環(huán)境信號的調(diào)控[3]。多種內(nèi)外因素通過影響轉(zhuǎn)錄因子的水平，進(jìn)而影響腺毛發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控腺毛發(fā)育。
在本氏煙草的一系列研究中發(fā)現(xiàn)了與煙草腺毛發(fā)育相關(guān)的基因和轉(zhuǎn)錄因子：C 2 H 2鋅指轉(zhuǎn)錄因子NbGIS能導(dǎo)致煙草增加腺毛[4-5]。NbGIS由赤霉素(GA)誘導(dǎo)并作用于GA生物合成基因的下游，通過下游的R 2 R 3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子NbMYB123-like(AtMYB123的同源物)正向調(diào)控?zé)煵菹倜珷铙w的啟動[5]。Wu等[6]克隆了兩個(gè)煙草基因，即NbCycB2和NbWo(SlCycB2和SlWo的同源物)，并證明NbWo蛋白通過結(jié)合啟動子區(qū)域中的L 1-like框直接調(diào)節(jié)NbCycB2的表達(dá)。該研究還表明NbCycB 2蛋白可以通過結(jié)合NbWo蛋白的LZ結(jié)構(gòu)域來抑制毛狀體的起始，這是在煙草中發(fā)現(xiàn)的一種相互調(diào)節(jié)的新機(jī)制。雖然擬南芥表皮毛發(fā)育模型已被逐步闡明[7]，但煙草腺毛調(diào)控模型還未建立，與腺毛發(fā)育相關(guān)的幾個(gè)基因剛被研究發(fā)現(xiàn)，腺毛發(fā)生的分子機(jī)制還有待研究。
前期研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)ChIFN-γ煙草的腺毛密度增加了一倍以上[8]。通過Agilent基因芯片檢測差異基因，篩選到NtCAF1，分析可能與煙草腺毛的起始和發(fā)育有關(guān)。CCR 4-associated factor 1(CAF 1)，是CCR 4-NOT復(fù)合體的關(guān)鍵亞基，是一種進(jìn)化保守的蛋白質(zhì)復(fù)合體，參與控制轉(zhuǎn)錄和mRNA去腺苷化和RNA降解。有研究證實(shí)CAF 1與細(xì)胞周期激酶(DBF 2)相互作用，直接參與細(xì)胞的周期調(diào)控及細(xì)胞代謝調(diào)控[9-10]。在番茄中異源過表達(dá)辣椒CaCAF1后表現(xiàn)出生長顯著增強(qiáng)，葉片厚度增加及對卵菌致病菌疫霉的抗性增強(qiáng)，其中參與多胺生物合成、防御反應(yīng)和細(xì)胞壁器官發(fā)生的基因上調(diào)[11-12]。擬南芥過量表達(dá)AtCAF1A對PST DC 3000(PseudomonassyringaepvtomatoDC 3000)病原體的抗性增強(qiáng)[13]。鹽生杜氏藻DsCAF 1響應(yīng)高滲、低滲、冷、熱或紫外線的脅迫環(huán)境[14]。以上研究結(jié)果表明，CAF1在植物的生長發(fā)育和防御病原體方面發(fā)揮著重要作用。在煙草中，NtCAF1是否參與腺毛起始和發(fā)育，NtCAF1是否影響激素合成。迄今為止，煙草腺毛發(fā)育的分子機(jī)制仍不清楚。本研究以過表達(dá)NtCAF1煙草為實(shí)驗(yàn)材料，研究NtCAF1對煙草腺毛發(fā)育的影響，可為深入解析煙草腺毛發(fā)育的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 材 料
所用煙草品種為三星煙草(Nicotianatabacumcv. Xanthin)，由貴州大學(xué)煙草學(xué)院提供。pSH 737植物過表達(dá)載體、農(nóng)桿菌LBA 4404由貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究院提供。
1.2 方 法
1.2.1基因表達(dá)模式分析
取3周齡且長勢一致的煙草根、莖、葉和12周的花各1 g，經(jīng)液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱。取0.1 g植物組織提取RNA，提取程序參照TAKARA公司的植物RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行。取1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄，程序參照GeneStar公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行。根據(jù)NtCAF1的ORF序列設(shè)計(jì)引物F 1和R 1(表1)，以煙草EF-1α為內(nèi)參基因(引物為F 2和R 2)，按照GeneStar公司的2×RealStar Green Fast Mixture試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)(qRT-PCR)。20 μL反應(yīng)體系：2×RealStar Green Fast Mixture with ROX Ⅱ10.0 μL，上、下游引物(10.0 μmol/L)各0.5 μL，cDNA 1.0 μL，RNase-free H2O 8.0 μL。反應(yīng)條件為95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s、60 ℃ 15 s、72 ℃ 30 s、40次循環(huán)。每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次，采用2-ΔΔCt法[15]進(jìn)行分析。
1.2.2載體構(gòu)建
實(shí)驗(yàn)前期已獲得將NtCAF1克隆連接到pGEM-T質(zhì)粒上[16]，以pGEM-T-NtCAF1模板PCR擴(kuò)增NtCAF1片段(引物為F 3和R 3)，膠回收純化基因片段產(chǎn)物。限制性內(nèi)切酶Xba Ⅰ和Sma Ⅰ同時(shí)酶切膠回收片段和pSH 737質(zhì)粒，使用PlasmidMini Kit Ⅰ試劑盒純化pSH 737質(zhì)粒酶切產(chǎn)物，用DNA LigationKit連接純化后的基因片段與載體，將NtCAF1基因插入到表達(dá)載體pSH 737中，重組載體暫命名為pSH 737-NtCAF1。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH 5α感受態(tài)細(xì)胞中，通過菌落PCR、質(zhì)粒PCR和測序驗(yàn)證表達(dá)載體后，通過凍融法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌LBA 4404。
1.2.3煙草遺傳轉(zhuǎn)化與鑒定
煙草轉(zhuǎn)基因采用葉盤轉(zhuǎn)化法參考王關(guān)林[17]的方法。GUS染色程序參照北京華越洋生物科技有限公司的GUS染色試劑盒說明書進(jìn)行。植物DNA提取參照OMEGA公司的SP Plant DNA Kit試劑盒說明書提取抗性苗葉片DNA，進(jìn)行基因組PCR反應(yīng)(引物為F 4和R 4)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，篩選陽性轉(zhuǎn)基因株系。利用F 1和R 1引物對過表達(dá)抗性株系進(jìn)行qRT-PCR。檢測分析方法同1.2。
表1 引物信息Table 1 Primer information
1.2.4煙草葉片腺毛形態(tài)觀察
煙草葉片腺毛組織化學(xué)染色法參考Zhang等[18]的方法。利用超景深顯微鏡(VHR-7000)對葉片表面進(jìn)行觀察，并在上表皮中隨機(jī)選擇3個(gè)視野進(jìn)行腺毛密度統(tǒng)計(jì)分析。
1.2.5煙草葉片激素含量測定
樣品前處理：取過表達(dá)NtCAF1基因煙草和野生型煙草從上至下第4～5個(gè)葉片。迅速置于滅菌的研缽中(提前用液氮預(yù)冷)研磨，稱量0.400 g粉碎后的樣品于玻璃試管中。參考周幼成等[19]的方法處理。取上清用氮吹機(jī)吹干，用400 μL含0.1%甲酸的甲醇溶液溶解，混勻，濾膜過濾，待測(植物激素不穩(wěn)定，提取過程應(yīng)全程保持在冰盒上操作)。
檢測方法：色譜條件參考翁文昕等[20]的方法。梯度洗脫程序0～9 min 20%～80%A、9～10.5 min 80%A、10.5～10.6 min 80%～20%A、10.6～13.5 min 20%A。質(zhì)譜條件參考莫文娟等[21]的方法。測定煙草葉片中茉莉酸(JA)、脫落酸(ABA)、GA3的含量。
1.2.6數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)方法
所有數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行整理并進(jìn)行顯著性分析，數(shù)據(jù)處理采用T-Test檢驗(yàn)分析。質(zhì)譜數(shù)據(jù)使用Analyst軟件處理、分析。
2 結(jié)果與分析
2.1 NtCAF1表達(dá)模式分析
qRT-PCR結(jié)果表明，NtCAF1在煙草的根、莖、葉、花中均有表達(dá)，其中葉片中的表達(dá)水平最高，是花的8.0倍(圖1)。NtCAF1表達(dá)水平在根和花中較低。說明NtCAF1主要在煙草葉片中富集表達(dá)。
注：“*”，“**”分別表示相對于花差異顯著(p<0.05)和極顯著(p<0.01)。圖1 NtCAF1基因表達(dá)模式分析Fig.1 Analysis of NtCAF1 gene expression pattern
2.2 煙草NtCAF1基因的植物表達(dá)載體構(gòu)建
PCR擴(kuò)增NtCAF1目的片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后在855 bp左右處有亮帶，條帶大小與預(yù)期相符(圖2 A)，隨機(jī)挑取5個(gè)單克隆經(jīng)F 4和R 4引物菌落PCR驗(yàn)證，電泳結(jié)果均為陽性單克隆(圖2 B)。提取1號和2號菌液質(zhì)粒，經(jīng)F 4和R 4引物質(zhì)粒PCR驗(yàn)證，其結(jié)果與菌落PCR結(jié)果一致，均特異性擴(kuò)增到了符合預(yù)期大小的目的片段(圖1 C)，證明成功將NtCAF1基因構(gòu)建到pSH 737載體。并將質(zhì)粒送上海生工測序檢測。測序結(jié)果表明，NtCAF1基因已經(jīng)重組到pSH 737載體上，且沒有堿基序列突變，pSH 737-NtCAF1載體構(gòu)建成功。
2.3 pSH 737-NtCAF1載體在煙草中的遺傳轉(zhuǎn)化與鑒定
采用葉盤轉(zhuǎn)化法遺傳轉(zhuǎn)化煙草葉片。取煙草生根苗幼葉進(jìn)行GUS染色(圖3)，提取幼葉基因組DNA，經(jīng)F 4和R 4引物PCR檢測陽性轉(zhuǎn)基因植株(圖4)。最終獲得轉(zhuǎn)空載和過表達(dá)NtCAF1基因煙草的陽性植株分別為4株和19株。
注：1為DL 2 000 Marker；A為2～3：NtCAF1片段PCR產(chǎn)物；B為2～6：NtCAF1過表達(dá)載體菌落PCR產(chǎn)物；C為2～3：NtCAF1過表達(dá)載體質(zhì)粒PCR產(chǎn)物。圖2 植物表達(dá)載體構(gòu)建Fig.2 Construction of plant expression vector
注：A為過表達(dá)NtCAF1煙草；B為轉(zhuǎn)空載煙草；C為野生型煙草。圖3 轉(zhuǎn)基因植株的葉片細(xì)絲GUS染色顯微鏡觀察Fig.3 GUS staining microscope observation of leaf filaments of transgenic plants
注：1為DL 2 000 Marker；2為野生型煙草(陰性對照)；A為3：pSH 737載體質(zhì)粒PCR產(chǎn)物(陽性對照)；4～8為轉(zhuǎn)空載煙草；B為3：pSH 737-35 S-NtCAF1載體質(zhì)粒PCR產(chǎn)物(陽性對照)；4～24為過表達(dá)NtCAF1煙草。圖4 轉(zhuǎn)基因植株的基因組PCR驗(yàn)證Fig.4 Genome PCR validation of transgenic plants
2.4 轉(zhuǎn)基因煙草中 NtCAF1基因分析
提取組培煙草生根苗幼葉總RNA，qRT-PCR結(jié)果表明(圖5)，以野生型煙草(WT)為參考，轉(zhuǎn)空載體煙草為陰性對照(ck)，煙草NtCAF1基因轉(zhuǎn)化到煙草植株中均極顯著高表達(dá)，相對表達(dá)量最高的株系是23號、27號和28號，這3個(gè)株系用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的分析。
注：A,C為野生型煙草葉片腺毛；B,D為過表達(dá)NtCAF1煙草葉片腺毛；圖6 野生型煙草和過表達(dá)NtCAF1煙草葉片腺毛Fig.6 Glandular trichomes of leaves of WT and NtCAF1overexpression tobacco
注：“**”表示相對于野生型煙草差異極顯著(p<0.01)。圖5 不同株系NtCAF1的表達(dá)水平分析Fig.5 Analysis of expression level of NtCAF1 with different lines
2.5 過表達(dá)NtCAF1基因煙草植株的腺毛密度分析
將表達(dá)量較高的23號、27號和28號過表達(dá)NtCAF1煙草植株和野生型植株移栽，2周后觀察統(tǒng)計(jì)單位面積葉片腺毛數(shù)量，并進(jìn)行顯著性差異分析。發(fā)現(xiàn)與野生型相比，過表達(dá)NtCAF1煙草的腺毛形態(tài)沒有明顯變化(圖6)，整個(gè)植株呈現(xiàn)多毛狀態(tài)，其長腺毛、短腺毛均顯著增多(圖7)，轉(zhuǎn)NtCAF1煙草的長腺毛密度是野生型煙草的1.57倍，短線毛密度是野生型煙草的1.83倍，總腺毛密度是野生型煙草的1.70倍。表明NtCAF1能夠促進(jìn)煙草腺毛密度增加。
2.6 煙草葉片激素水平分析
通過HPLC-MS/MS檢測了過表達(dá)NtCAF1和野生型煙草植株葉片內(nèi)源JA、ABA、GA3的含量。結(jié)果顯示(圖8)，與野生型煙草相比，過表達(dá)NtCAF1煙草植株葉片的內(nèi)源ABA和GA3含量顯著升高，JA無顯著變化。因此NtCAF1可能通過ABA、GA3激素調(diào)節(jié)的途徑影響煙草腺毛的密度。
注：A為總腺毛密度；B為長腺毛密度；C為短腺毛密度；“*”表示相對于野生型煙草差異顯著(p<0.05)。圖7 野生型煙草和過表達(dá)NtCAF1煙草葉片不同種類腺毛的密度Fig.7 Density of glandular trichomes of leaves in different species of WT and overexpression tobacco with NtCAF1
注：“*”為相對于野生型煙草差異顯著(p<0.05)。圖8 野生型煙草和過表達(dá)NtCAF1煙草葉片中內(nèi)源激素的含量Fig.8 Contents of endogenous hormones in leaves of WT and overexpression tobacco with NtCAF1
3 討 論
3.1 過表達(dá)NtCAF1對煙草腺毛密度的影響
植物毛狀體的數(shù)量和分泌能力不僅影響植物對生物、非生物脅迫的抗性，同時(shí)其次級代謝產(chǎn)物對人類具有極大的價(jià)值。栽培煙草(N.tabacum)的腺毛富含次級代謝物，其含量接近葉片干重的10%[22]。例如由煙草腺毛合成的西柏烯類化合物，是一類煙草中非常重要的香味前體物質(zhì)，在煙草調(diào)制老化的過程中，西柏烯類化合物發(fā)生降解，產(chǎn)生的香味化合物種類有60多種[23]。查宏波等[24]研究表明，不同煙草品種間，腺毛密度越高，腺毛分泌物含量越高，因此可以通過增加煙草腺毛密度改良煙葉品質(zhì)。實(shí)驗(yàn)室前期研究，篩選到NtCAF1基因，分析可能與煙草腺毛的起始和發(fā)育有關(guān)。因此，本文為闡明NtCAF1對煙草腺毛起始和發(fā)育的影響，對該基因進(jìn)行了過表達(dá)研究。通過形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，NtCAF1過表達(dá)植株總腺毛密度呈現(xiàn)顯著增多的趨勢，且長、短腺毛密度均顯著提高，表明NtCAF1可以促進(jìn)煙草腺毛的密度提高。
3.2 植物激素JA、ABA、GA3對煙草腺毛密度的影響
在擬南芥中，CAF1基因可以被ABA、JA、茉莉酸甲酯(MeJA)等激素和外界脅迫(例如低溫和物理創(chuàng)傷)誘導(dǎo)，并快速表達(dá)[25]。因此推測NtCAF1可能通過激素的途徑影響煙草腺毛的起始和發(fā)育。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NtCAF1可能通過ABA、GA3激素調(diào)節(jié)的途徑影響煙草腺毛的密度提高。在薄荷中，GA的外源應(yīng)用導(dǎo)致毛狀體密度和腺體直徑增加，表明GA能促進(jìn)薄荷毛狀體的起始和發(fā)育[26]。有研究表明，外源噴施GA3可以促進(jìn)本氏煙草腺毛起始，GA通過激活參與毛狀體發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子C 2 H 2鋅指蛋白GIS的信號傳導(dǎo)，參與植物調(diào)節(jié)毛狀體發(fā)育[27]。pGbEXPA 2啟動子在纖維和幼葉的毛狀體中特異性啟動，該啟動子受GA和ABA信號傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)[28]。已發(fā)現(xiàn)NbCycB2能抑制本氏煙草中NbWo蛋白的活性，通過CycB 2-Wo反饋回路影響毛狀體的形成[7]，同時(shí)NtCycB2是受ABA介導(dǎo)的高鹽抗性的負(fù)調(diào)節(jié)因子[29]。HST突變體的毛狀體密度降低，當(dāng)用GA3處理時(shí)，突變體植物上的莖毛部分恢復(fù)[30]。因此ABA、GA激素調(diào)節(jié)對植物毛狀體發(fā)育有重要作用。雖然有文獻(xiàn)報(bào)道，在種子中早期萌發(fā)時(shí)ABA與GA起拮抗作用的關(guān)系[31]，但ABA和GA3均可以通過促進(jìn)AaSAP1的表達(dá)量，促進(jìn)了青蒿中腺毛的發(fā)育[32]。因此植物激素ABA與GA間受植物的發(fā)育時(shí)期和性狀等因素影響，表現(xiàn)出不同的作用關(guān)系。雖然JA被報(bào)道可促進(jìn)煙草腺毛密度增加[33]，但過表達(dá)NtCAF1促進(jìn)煙草葉片腺毛密度增加并未使煙草葉片內(nèi)源JA的含量產(chǎn)生顯著變化。有文獻(xiàn)報(bào)道GA通過阻遏DELLAs來促進(jìn)JAZ蛋白合成，而JAZ蛋白抑制JA反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄[31]，因此推測可能是GA含量增加的同時(shí)抑制了JA的生物合成。為證明過表達(dá)NtCAF1對煙草的農(nóng)藝性狀和應(yīng)對生物、非生物脅迫的抗性以及次級代謝產(chǎn)物合成有無影響，還需進(jìn)行田間比較試驗(yàn)。本研究結(jié)果可為提升農(nóng)業(yè)種植煙草的品質(zhì)質(zhì)量奠定基礎(chǔ)。
4 結(jié) 論
NtCAF1主要在煙草葉片中富集表達(dá)。通過葉盤法獲得過表達(dá)NtCAF1煙草19個(gè)株系，NtCAF1基因均極顯著高表達(dá)，其腺毛密度顯著提高，腺毛發(fā)育形態(tài)正常。表明NtCAF1能夠顯著促進(jìn)煙草腺毛密度增加。過表達(dá)NtCAF1煙草植株葉片的內(nèi)源ABA和GA3含量顯著升高，JA無顯著變化。表明NtCAF1可能通過ABA、GA3激素調(diào)節(jié)的途徑影響煙草腺毛密度變化。
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煙草是主要的經(jīng)濟(jì)作物之一，在世界各地均有大面積栽培[1]。植物腺毛對植物抗逆境脅迫、植物病蟲害防治等有很大影響。煙草的長柄腺毛是二萜和糖脂合成的重要場所，二萜和糖脂不僅是重要香氣物質(zhì)前體，對蚜蟲抗性也有較大影響。而短柄腺毛是葉面抗性蛋白的合成場所，葉面抗性蛋白在抑制孢子萌發(fā)和抵抗真菌侵染中起重要作用[2]。腺毛主要分布在植物莖、葉的表面，其發(fā)育受多種植物激素等內(nèi)部信號及光、溫等環(huán)境信號的調(diào)控[3]。多種內(nèi)外因素通過影響轉(zhuǎn)錄因子的水平，進(jìn)而影響腺毛發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控腺毛發(fā)育。
在本氏煙草的一系列研究中發(fā)現(xiàn)了與煙草腺毛發(fā)育相關(guān)的基因和轉(zhuǎn)錄因子：C 2 H 2鋅指轉(zhuǎn)錄因子NbGIS能導(dǎo)致煙草增加腺毛[4-5]。NbGIS由赤霉素(GA)誘導(dǎo)并作用于GA生物合成基因的下游，通過下游的R 2 R 3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子NbMYB123-like(AtMYB123的同源物)正向調(diào)控?zé)煵菹倜珷铙w的啟動[5]。Wu等[6]克隆了兩個(gè)煙草基因，即NbCycB2和NbWo(SlCycB2和SlWo的同源物)，并證明NbWo蛋白通過結(jié)合啟動子區(qū)域中的L 1-like框直接調(diào)節(jié)NbCycB2的表達(dá)。該研究還表明NbCycB 2蛋白可以通過結(jié)合NbWo蛋白的LZ結(jié)構(gòu)域來抑制毛狀體的起始，這是在煙草中發(fā)現(xiàn)的一種相互調(diào)節(jié)的新機(jī)制。雖然擬南芥表皮毛發(fā)育模型已被逐步闡明[7]，但煙草腺毛調(diào)控模型還未建立，與腺毛發(fā)育相關(guān)的幾個(gè)基因剛被研究發(fā)現(xiàn)，腺毛發(fā)生的分子機(jī)制還有待研究。
前期研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)ChIFN-γ煙草的腺毛密度增加了一倍以上[8]。通過Agilent基因芯片檢測差異基因，篩選到NtCAF1，分析可能與煙草腺毛的起始和發(fā)育有關(guān)。CCR 4-associated factor 1(CAF 1)，是CCR 4-NOT復(fù)合體的關(guān)鍵亞基，是一種進(jìn)化保守的蛋白質(zhì)復(fù)合體，參與控制轉(zhuǎn)錄和mRNA去腺苷化和RNA降解。有研究證實(shí)CAF 1與細(xì)胞周期激酶(DBF 2)相互作用，直接參與細(xì)胞的周期調(diào)控及細(xì)胞代謝調(diào)控[9-10]。在番茄中異源過表達(dá)辣椒CaCAF1后表現(xiàn)出生長顯著增強(qiáng)，葉片厚度增加及對卵菌致病菌疫霉的抗性增強(qiáng)，其中參與多胺生物合成、防御反應(yīng)和細(xì)胞壁器官發(fā)生的基因上調(diào)[11-12]。擬南芥過量表達(dá)AtCAF1A對PST DC 3000(PseudomonassyringaepvtomatoDC 3000)病原體的抗性增強(qiáng)[13]。鹽生杜氏藻DsCAF 1響應(yīng)高滲、低滲、冷、熱或紫外線的脅迫環(huán)境[14]。以上研究結(jié)果表明，CAF1在植物的生長發(fā)育和防御病原體方面發(fā)揮著重要作用。在煙草中，NtCAF1是否參與腺毛起始和發(fā)育，NtCAF1是否影響激素合成。迄今為止，煙草腺毛發(fā)育的分子機(jī)制仍不清楚。本研究以過表達(dá)NtCAF1煙草為實(shí)驗(yàn)材料，研究NtCAF1對煙草腺毛發(fā)育的影響，可為深入解析煙草腺毛發(fā)育的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 材 料
所用煙草品種為三星煙草(Nicotianatabacumcv. Xanthin)，由貴州大學(xué)煙草學(xué)院提供。pSH 737植物過表達(dá)載體、農(nóng)桿菌LBA 4404由貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究院提供。
1.2 方 法
1.2.1基因表達(dá)模式分析
取3周齡且長勢一致的煙草根、莖、葉和12周的花各1 g，經(jīng)液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱。取0.1 g植物組織提取RNA，提取程序參照TAKARA公司的植物RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行。取1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄，程序參照GeneStar公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行。根據(jù)NtCAF1的ORF序列設(shè)計(jì)引物F 1和R 1(表1)，以煙草EF-1α為內(nèi)參基因(引物為F 2和R 2)，按照GeneStar公司的2×RealStar Green Fast Mixture試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)(qRT-PCR)。20 μL反應(yīng)體系：2×RealStar Green Fast Mixture with ROX Ⅱ10.0 μL，上、下游引物(10.0 μmol/L)各0.5 μL，cDNA 1.0 μL，RNase-free H2O 8.0 μL。反應(yīng)條件為95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s、60 ℃ 15 s、72 ℃ 30 s、40次循環(huán)。每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次，采用2-ΔΔCt法[15]進(jìn)行分析。
1.2.2載體構(gòu)建
實(shí)驗(yàn)前期已獲得將NtCAF1克隆連接到pGEM-T質(zhì)粒上[16]，以pGEM-T-NtCAF1模板PCR擴(kuò)增NtCAF1片段(引物為F 3和R 3)，膠回收純化基因片段產(chǎn)物。限制性內(nèi)切酶Xba Ⅰ和Sma Ⅰ同時(shí)酶切膠回收片段和pSH 737質(zhì)粒，使用PlasmidMini Kit Ⅰ試劑盒純化pSH 737質(zhì)粒酶切產(chǎn)物，用DNA LigationKit連接純化后的基因片段與載體，將NtCAF1基因插入到表達(dá)載體pSH 737中，重組載體暫命名為pSH 737-NtCAF1。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH 5α感受態(tài)細(xì)胞中，通過菌落PCR、質(zhì)粒PCR和測序驗(yàn)證表達(dá)載體后，通過凍融法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌LBA 4404。
1.2.3煙草遺傳轉(zhuǎn)化與鑒定
煙草轉(zhuǎn)基因采用葉盤轉(zhuǎn)化法參考王關(guān)林[17]的方法。GUS染色程序參照北京華越洋生物科技有限公司的GUS染色試劑盒說明書進(jìn)行。植物DNA提取參照OMEGA公司的SP Plant DNA Kit試劑盒說明書提取抗性苗葉片DNA，進(jìn)行基因組PCR反應(yīng)(引物為F 4和R 4)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，篩選陽性轉(zhuǎn)基因株系。利用F 1和R 1引物對過表達(dá)抗性株系進(jìn)行qRT-PCR。檢測分析方法同1.2。
表1 引物信息Table 1 Primer information
1.2.4煙草葉片腺毛形態(tài)觀察
煙草葉片腺毛組織化學(xué)染色法參考Zhang等[18]的方法。利用超景深顯微鏡(VHR-7000)對葉片表面進(jìn)行觀察，并在上表皮中隨機(jī)選擇3個(gè)視野進(jìn)行腺毛密度統(tǒng)計(jì)分析。
1.2.5煙草葉片激素含量測定
樣品前處理：取過表達(dá)NtCAF1基因煙草和野生型煙草從上至下第4～5個(gè)葉片。迅速置于滅菌的研缽中(提前用液氮預(yù)冷)研磨，稱量0.400 g粉碎后的樣品于玻璃試管中。參考周幼成等[19]的方法處理。取上清用氮吹機(jī)吹干，用400 μL含0.1%甲酸的甲醇溶液溶解，混勻，濾膜過濾，待測(植物激素不穩(wěn)定，提取過程應(yīng)全程保持在冰盒上操作)。
檢測方法：色譜條件參考翁文昕等[20]的方法。梯度洗脫程序0～9 min 20%～80%A、9～10.5 min 80%A、10.5～10.6 min 80%～20%A、10.6～13.5 min 20%A。質(zhì)譜條件參考莫文娟等[21]的方法。測定煙草葉片中茉莉酸(JA)、脫落酸(ABA)、GA3的含量。
1.2.6數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)方法
所有數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行整理并進(jìn)行顯著性分析，數(shù)據(jù)處理采用T-Test檢驗(yàn)分析。質(zhì)譜數(shù)據(jù)使用Analyst軟件處理、分析。
2 結(jié)果與分析
2.1 NtCAF1表達(dá)模式分析
qRT-PCR結(jié)果表明，NtCAF1在煙草的根、莖、葉、花中均有表達(dá)，其中葉片中的表達(dá)水平最高，是花的8.0倍(圖1)。NtCAF1表達(dá)水平在根和花中較低。說明NtCAF1主要在煙草葉片中富集表達(dá)。
注：“*”，“**”分別表示相對于花差異顯著(p<0.05)和極顯著(p<0.01)。圖1 NtCAF1基因表達(dá)模式分析Fig.1 Analysis of NtCAF1 gene expression pattern
2.2 煙草NtCAF1基因的植物表達(dá)載體構(gòu)建
PCR擴(kuò)增NtCAF1目的片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后在855 bp左右處有亮帶，條帶大小與預(yù)期相符(圖2 A)，隨機(jī)挑取5個(gè)單克隆經(jīng)F 4和R 4引物菌落PCR驗(yàn)證，電泳結(jié)果均為陽性單克隆(圖2 B)。提取1號和2號菌液質(zhì)粒，經(jīng)F 4和R 4引物質(zhì)粒PCR驗(yàn)證，其結(jié)果與菌落PCR結(jié)果一致，均特異性擴(kuò)增到了符合預(yù)期大小的目的片段(圖1 C)，證明成功將NtCAF1基因構(gòu)建到pSH 737載體。并將質(zhì)粒送上海生工測序檢測。測序結(jié)果表明，NtCAF1基因已經(jīng)重組到pSH 737載體上，且沒有堿基序列突變，pSH 737-NtCAF1載體構(gòu)建成功。
2.3 pSH 737-NtCAF1載體在煙草中的遺傳轉(zhuǎn)化與鑒定
采用葉盤轉(zhuǎn)化法遺傳轉(zhuǎn)化煙草葉片。取煙草生根苗幼葉進(jìn)行GUS染色(圖3)，提取幼葉基因組DNA，經(jīng)F 4和R 4引物PCR檢測陽性轉(zhuǎn)基因植株(圖4)。最終獲得轉(zhuǎn)空載和過表達(dá)NtCAF1基因煙草的陽性植株分別為4株和19株。
注：1為DL 2 000 Marker；A為2～3：NtCAF1片段PCR產(chǎn)物；B為2～6：NtCAF1過表達(dá)載體菌落PCR產(chǎn)物；C為2～3：NtCAF1過表達(dá)載體質(zhì)粒PCR產(chǎn)物。圖2 植物表達(dá)載體構(gòu)建Fig.2 Construction of plant expression vector
注：A為過表達(dá)NtCAF1煙草；B為轉(zhuǎn)空載煙草；C為野生型煙草。圖3 轉(zhuǎn)基因植株的葉片細(xì)絲GUS染色顯微鏡觀察Fig.3 GUS staining microscope observation of leaf filaments of transgenic plants
注：1為DL 2 000 Marker；2為野生型煙草(陰性對照)；A為3：pSH 737載體質(zhì)粒PCR產(chǎn)物(陽性對照)；4～8為轉(zhuǎn)空載煙草；B為3：pSH 737-35 S-NtCAF1載體質(zhì)粒PCR產(chǎn)物(陽性對照)；4～24為過表達(dá)NtCAF1煙草。圖4 轉(zhuǎn)基因植株的基因組PCR驗(yàn)證Fig.4 Genome PCR validation of transgenic plants
2.4 轉(zhuǎn)基因煙草中 NtCAF1基因分析
提取組培煙草生根苗幼葉總RNA，qRT-PCR結(jié)果表明(圖5)，以野生型煙草(WT)為參考，轉(zhuǎn)空載體煙草為陰性對照(ck)，煙草NtCAF1基因轉(zhuǎn)化到煙草植株中均極顯著高表達(dá)，相對表達(dá)量最高的株系是23號、27號和28號，這3個(gè)株系用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的分析。
注：A,C為野生型煙草葉片腺毛；B,D為過表達(dá)NtCAF1煙草葉片腺毛；圖6 野生型煙草和過表達(dá)NtCAF1煙草葉片腺毛Fig.6 Glandular trichomes of leaves of WT and NtCAF1overexpression tobacco
注：“**”表示相對于野生型煙草差異極顯著(p<0.01)。圖5 不同株系NtCAF1的表達(dá)水平分析Fig.5 Analysis of expression level of NtCAF1 with different lines
2.5 過表達(dá)NtCAF1基因煙草植株的腺毛密度分析
將表達(dá)量較高的23號、27號和28號過表達(dá)NtCAF1煙草植株和野生型植株移栽，2周后觀察統(tǒng)計(jì)單位面積葉片腺毛數(shù)量，并進(jìn)行顯著性差異分析。發(fā)現(xiàn)與野生型相比，過表達(dá)NtCAF1煙草的腺毛形態(tài)沒有明顯變化(圖6)，整個(gè)植株呈現(xiàn)多毛狀態(tài)，其長腺毛、短腺毛均顯著增多(圖7)，轉(zhuǎn)NtCAF1煙草的長腺毛密度是野生型煙草的1.57倍，短線毛密度是野生型煙草的1.83倍，總腺毛密度是野生型煙草的1.70倍。表明NtCAF1能夠促進(jìn)煙草腺毛密度增加。
2.6 煙草葉片激素水平分析
通過HPLC-MS/MS檢測了過表達(dá)NtCAF1和野生型煙草植株葉片內(nèi)源JA、ABA、GA3的含量。結(jié)果顯示(圖8)，與野生型煙草相比，過表達(dá)NtCAF1煙草植株葉片的內(nèi)源ABA和GA3含量顯著升高，JA無顯著變化。因此NtCAF1可能通過ABA、GA3激素調(diào)節(jié)的途徑影響煙草腺毛的密度。
注：A為總腺毛密度；B為長腺毛密度；C為短腺毛密度；“*”表示相對于野生型煙草差異顯著(p<0.05)。圖7 野生型煙草和過表達(dá)NtCAF1煙草葉片不同種類腺毛的密度Fig.7 Density of glandular trichomes of leaves in different species of WT and overexpression tobacco with NtCAF1
注：“*”為相對于野生型煙草差異顯著(p<0.05)。圖8 野生型煙草和過表達(dá)NtCAF1煙草葉片中內(nèi)源激素的含量Fig.8 Contents of endogenous hormones in leaves of WT and overexpression tobacco with NtCAF1
3 討 論
3.1 過表達(dá)NtCAF1對煙草腺毛密度的影響
植物毛狀體的數(shù)量和分泌能力不僅影響植物對生物、非生物脅迫的抗性，同時(shí)其次級代謝產(chǎn)物對人類具有極大的價(jià)值。栽培煙草(N.tabacum)的腺毛富含次級代謝物，其含量接近葉片干重的10%[22]。例如由煙草腺毛合成的西柏烯類化合物，是一類煙草中非常重要的香味前體物質(zhì)，在煙草調(diào)制老化的過程中，西柏烯類化合物發(fā)生降解，產(chǎn)生的香味化合物種類有60多種[23]。查宏波等[24]研究表明，不同煙草品種間，腺毛密度越高，腺毛分泌物含量越高，因此可以通過增加煙草腺毛密度改良煙葉品質(zhì)。實(shí)驗(yàn)室前期研究，篩選到NtCAF1基因，分析可能與煙草腺毛的起始和發(fā)育有關(guān)。因此，本文為闡明NtCAF1對煙草腺毛起始和發(fā)育的影響，對該基因進(jìn)行了過表達(dá)研究。通過形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，NtCAF1過表達(dá)植株總腺毛密度呈現(xiàn)顯著增多的趨勢，且長、短腺毛密度均顯著提高，表明NtCAF1可以促進(jìn)煙草腺毛的密度提高。
3.2 植物激素JA、ABA、GA3對煙草腺毛密度的影響
在擬南芥中，CAF1基因可以被ABA、JA、茉莉酸甲酯(MeJA)等激素和外界脅迫(例如低溫和物理創(chuàng)傷)誘導(dǎo)，并快速表達(dá)[25]。因此推測NtCAF1可能通過激素的途徑影響煙草腺毛的起始和發(fā)育。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NtCAF1可能通過ABA、GA3激素調(diào)節(jié)的途徑影響煙草腺毛的密度提高。在薄荷中，GA的外源應(yīng)用導(dǎo)致毛狀體密度和腺體直徑增加，表明GA能促進(jìn)薄荷毛狀體的起始和發(fā)育[26]。有研究表明，外源噴施GA3可以促進(jìn)本氏煙草腺毛起始，GA通過激活參與毛狀體發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子C 2 H 2鋅指蛋白GIS的信號傳導(dǎo)，參與植物調(diào)節(jié)毛狀體發(fā)育[27]。pGbEXPA 2啟動子在纖維和幼葉的毛狀體中特異性啟動，該啟動子受GA和ABA信號傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)[28]。已發(fā)現(xiàn)NbCycB2能抑制本氏煙草中NbWo蛋白的活性，通過CycB 2-Wo反饋回路影響毛狀體的形成[7]，同時(shí)NtCycB2是受ABA介導(dǎo)的高鹽抗性的負(fù)調(diào)節(jié)因子[29]。HST突變體的毛狀體密度降低，當(dāng)用GA3處理時(shí)，突變體植物上的莖毛部分恢復(fù)[30]。因此ABA、GA激素調(diào)節(jié)對植物毛狀體發(fā)育有重要作用。雖然有文獻(xiàn)報(bào)道，在種子中早期萌發(fā)時(shí)ABA與GA起拮抗作用的關(guān)系[31]，但ABA和GA3均可以通過促進(jìn)AaSAP1的表達(dá)量，促進(jìn)了青蒿中腺毛的發(fā)育[32]。因此植物激素ABA與GA間受植物的發(fā)育時(shí)期和性狀等因素影響，表現(xiàn)出不同的作用關(guān)系。雖然JA被報(bào)道可促進(jìn)煙草腺毛密度增加[33]，但過表達(dá)NtCAF1促進(jìn)煙草葉片腺毛密度增加并未使煙草葉片內(nèi)源JA的含量產(chǎn)生顯著變化。有文獻(xiàn)報(bào)道GA通過阻遏DELLAs來促進(jìn)JAZ蛋白合成，而JAZ蛋白抑制JA反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄[31]，因此推測可能是GA含量增加的同時(shí)抑制了JA的生物合成。為證明過表達(dá)NtCAF1對煙草的農(nóng)藝性狀和應(yīng)對生物、非生物脅迫的抗性以及次級代謝產(chǎn)物合成有無影響，還需進(jìn)行田間比較試驗(yàn)。本研究結(jié)果可為提升農(nóng)業(yè)種植煙草的品質(zhì)質(zhì)量奠定基礎(chǔ)。
4 結(jié) 論
NtCAF1主要在煙草葉片中富集表達(dá)。通過葉盤法獲得過表達(dá)NtCAF1煙草19個(gè)株系，NtCAF1基因均極顯著高表達(dá)，其腺毛密度顯著提高，腺毛發(fā)育形態(tài)正常。表明NtCAF1能夠顯著促進(jìn)煙草腺毛密度增加。過表達(dá)NtCAF1煙草植株葉片的內(nèi)源ABA和GA3含量顯著升高，JA無顯著變化。表明NtCAF1可能通過ABA、GA3激素調(diào)節(jié)的途徑影響煙草腺毛密度變化。
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