林冠權(quán)

(圣諾生物醫(yī)藥技術(shù)(廣州)有限公司，廣東 廣州 510000)

小干擾核酸(siRNA)[1-2]是一種短片段的雙鏈RNA分子，其基因沉默效應(yīng)具有高特異性和高效性。因此，siRNA可用于治療病毒感染、遺傳性疾病、癌癥等疾病[3-4]。然而，裸露的siRNA在血清中極易被RNase類酶降解，且難以進(jìn)入細(xì)胞，即使進(jìn)入了細(xì)胞，也無(wú)法有效地從內(nèi)涵體中逃逸到細(xì)胞質(zhì)中。所以，裸露siRNA很難在體內(nèi)發(fā)揮作用以達(dá)到治療的效果[5-6]。因此，開(kāi)發(fā)有效的核酸遞送載體，構(gòu)建合適的納米核酸藥物是提高siRNA基因沉默效應(yīng)，達(dá)到其治療效果的主要途徑。

殼聚糖是一種無(wú)生物毒性的多糖，具有良好的生物相容性、生物降解性、無(wú)免疫原性，能被人體分解吸收，常用于食品及醫(yī)藥領(lǐng)域。殼聚糖的分子鏈段上具有多個(gè)氨基，氨基質(zhì)子化后形成銨根離子，呈正電性，可與帶負(fù)電的核酸通過(guò)靜電作用力結(jié)合，因而殼聚糖是良好的核酸載體[7-8]。但殼聚糖的親水性能差，轉(zhuǎn)染效率低的局限性，嚴(yán)重阻礙其臨床的應(yīng)用[9]。因此，通過(guò)二甲基二烯丙基氯化銨改性殼聚糖，以提高殼聚糖的水溶性；通過(guò)構(gòu)建納米核酸藥物，以提高siRNA的轉(zhuǎn)染效率，達(dá)到基因治療的效果。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器和試劑

實(shí)驗(yàn)儀器：400 MHz核磁共振波普NMR，德國(guó)布魯克；Chromate 4300酶標(biāo)儀，Awarenes technology；Quant Studio 3實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，賽默飛世爾有限公司；1220凝膠成像儀，上海天能科技有限公司；nano-ZS90納米粒度與zeta電位儀，英國(guó)馬爾文儀器有限公司；FD-1C-50冷凍干燥機(jī)，無(wú)錫沃信流體設(shè)備科技有限公司；ES1035A電子天平，天津市德安特傳感技術(shù)有限公司。

實(shí)驗(yàn)試劑：殼聚糖(30000 Da)，上海麥克林；二甲基二烯丙基氯化銨(60wt%水溶液)，上海麥克林；小干擾核酸(siTGF-β1+siCOX-2)，蘇州貝信；過(guò)硫酸銨(分析純)，上海麥克林；三聚磷酸鈉(分析純)，上海阿拉??；冰醋酸(分析純)，上海麥克林；氫氧化鈉(ACS級(jí))，上海阿拉??；細(xì)胞RAN快速提取試劑盒(50T)，北京聚合美。

1.2 二甲基二烯丙基氯化銨改性殼聚糖(CS-g-PDMDAAC，簡(jiǎn)稱CP)的制備及表征

取殼聚糖于燒瓶中，加入pH 5的醋酸鈉緩沖溶液，攪拌使其完全溶解，得到12 mg/mL的殼聚糖溶液，加入與殼聚糖質(zhì)量比為6:1的二甲基二烯丙基氯化銨單體，磁力攪拌混勻，在80 ℃下回流10 min。取與殼聚糖質(zhì)量比為0.5:1的過(guò)硫酸銨于燒杯中，加入超純水使其完全溶解，得到30 mg/mL的過(guò)硫酸銨溶液，再滴加進(jìn)回流體系中，反應(yīng)3 h，冷卻至室溫，透析，過(guò)濾，冷凍干燥，獲得殼聚糖-聚二甲基二烯丙基氯化銨(CP)干粉。采用核磁共振氫譜對(duì)CP的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。

1.3 納米藥物的制備

把CP干粉溶于超純水，得到1 mg/mL的CP溶液。把1 mg/mL的siRNA溶液和1 mg/mL的三聚磷酸鈉(ST)置于離心管中混勻，把CP溶液注入離心管中，渦旋混勻，得到siRNA/CP納米核酸藥物。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳測(cè)試siRNA的結(jié)合情況。

1.4 納米核酸藥物的性能測(cè)試

細(xì)胞活性測(cè)試[10]。把樣品與opti-MEM培養(yǎng)基混合后，置于96孔板中轉(zhuǎn)染6 h，去掉樣品液，用含10%血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，往96孔板中每孔加入10 μL CCK8，靜置1 h。采用酶標(biāo)儀在450 nm的測(cè)試波長(zhǎng)中測(cè)試細(xì)胞的活力情況，重復(fù)三次。

抑制基因表達(dá)測(cè)試[11]。把樣品與opti-MEM培養(yǎng)基混合后，置于12孔板中轉(zhuǎn)染6 h，移除樣品液，用含10%血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，通過(guò)RT-PCR評(píng)估基因敲除效率。

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)構(gòu)表征分析

圖1是殼聚糖-聚二甲基二烯丙基氯化銨(CP)的核磁共振氫譜圖，4.80 ppm是重水的溶劑峰。1.89 ppm是殼聚糖乙?；馁|(zhì)子峰[12]。3.54 ppm為殼聚糖亞甲基的質(zhì)子峰。3.48 ppm、3.01 ppm處是N上所連-CH3的質(zhì)子峰；3.72 ppm、2.82 ppm是接枝單體聚合物中-CH2-上H的吸收峰；3.37 ppm為接枝單體聚合物中次甲基的質(zhì)子峰；5.56 ppm、5.86 ppm是CH2=CH-上H的多重吸收峰，這可能是聚合物末端鏈終止所形成的雙鍵。這說(shuō)明DMDAAC已成功接枝于CS主鏈上。

圖1 CS-g-PDMDAAC的1H NMR譜圖

2.2 siRNA/CP納米核酸藥物包裹性能測(cè)試分析

siRNA中存在多個(gè)磷酸二酯鍵，在水溶液中呈負(fù)電；CP中存在多個(gè)銨根離子，在水溶液中呈正電。siRNA與CP通過(guò)靜電作用自發(fā)結(jié)合形成納米粒子，而siRNA與CP的結(jié)合情況需通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳觀察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，圖2中CP與siRNA的質(zhì)量比為16:1時(shí)有拖帶的現(xiàn)象，說(shuō)明在此質(zhì)量比下制備的納米核酸藥物不能很好包裹siRNA，存在結(jié)合較差或游離的siRNA。在CP與siRNA的質(zhì)量比為24:1時(shí)，沒(méi)發(fā)現(xiàn)拖帶和siRNA特征條帶，說(shuō)明在此質(zhì)量比下CP能很好的與siRNA結(jié)合。三聚磷酸鈉為物理交聯(lián)劑，可進(jìn)一步壓縮納米顆粒，提高納米核酸藥物的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，在CP:ST:siRNA的質(zhì)量比分別為24:2:1和24:1:1時(shí)，均沒(méi)發(fā)現(xiàn)結(jié)合較差和游離的siRNA。通過(guò)凝膠滯留分析可篩選出納米核酸藥物中包裹性能較好的比例配方，除了CP與siRNA的質(zhì)量比為16:1的配方以外，上述配方得到的納米核酸藥物可很好的包裹siRNA，達(dá)到保護(hù)siRNA的作用。根據(jù)圖3粒徑分布圖可知，CP:ST:siRNA的質(zhì)量比為24:2:1時(shí)，納米核酸藥物的粒徑為180 nm。

圖2 瓊脂糖凝膠電泳圖

圖3 siRNA/CP納米核酸藥物粒徑分布圖

2.3 細(xì)胞活性分析

LIPO2000是一種適用于基因表達(dá)和基因沉默的高性能轉(zhuǎn)染試劑。在圖4細(xì)胞活性圖中得知，LIPO2000組的細(xì)胞毒性較大，細(xì)胞活性為63%。CP組的細(xì)胞活性為101%，ST組的細(xì)胞活性為118%，說(shuō)明CP載體和ST離子交聯(lián)劑對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，CP和ST兩者對(duì)細(xì)胞具有無(wú)毒性。雖然CP與ST混合后發(fā)現(xiàn)，CP:ST組的細(xì)胞活性為87%，具有低毒性，但與LIPO2000組對(duì)比，CP:ST組的安全性也具有很大優(yōu)勢(shì)。與LIPO2000組相比， siRNA/LIPO2000組的細(xì)胞活性下降約10%，說(shuō)明siRNA對(duì)BXPC3細(xì)胞的活力具有一定的抑制作用。同理，與CP組相比，CP:ST:siRNA(24:2:1)組的細(xì)胞活性下降了20%。從細(xì)胞活性的下降程度對(duì)比，CP:ST:siRNA(24:2:1)組優(yōu)于siRNA/LIPO2000組，這主要源于CP的高安全性及良好的轉(zhuǎn)染效率。

圖4 細(xì)胞活性結(jié)果圖

2.4 抑制目的基因表達(dá)性能分析

siRNA使用的是siTGF-β1與siCOX-2兩兩混合的小核酸，siRNA通過(guò)與特定的mRNA互補(bǔ)結(jié)合后切割mRNA，阻斷了mRNA翻譯成蛋白質(zhì)的表達(dá)路線，從而沉默了該編碼基因的表達(dá)，達(dá)到治療的效果。圖5是mRNA表達(dá)水平圖，GFP組是陰性對(duì)照，對(duì)于目的基因的表達(dá)沒(méi)有任何的抑制作用，siRNA/LIPO2000組是陽(yáng)性對(duì)照，TGF-β1與COX-2的mRNA表達(dá)水平均有不同程度的下降,這源于LIPO2000具有高效的轉(zhuǎn)染性能。CP:ST:siRNA(24:1:1)組的兩組mRNA表達(dá)抑制水平不及陽(yáng)性對(duì)照組，CP:siRNA(24:1)組的COX-2的mRNA表達(dá)抑制水平不及陽(yáng)性對(duì)照組。24:2:1(CP:ST:siRNA)組的兩組mRNA表達(dá)抑制水平均優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照組，說(shuō)明CP載體的轉(zhuǎn)染效率在一定程度上優(yōu)于LIPO2000，在CP:ST:siRNA質(zhì)量比為24:2:1時(shí)制備的納米核酸藥物，其具有較高的抑制目的基因表達(dá)效率。

圖5 mRNA表達(dá)水平結(jié)果圖

3 結(jié) 論

siRNA具有特異性及高效性，對(duì)于癌癥及遺傳學(xué)疾病具有良好的治療效果，但裸siRNA難以完整地進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部以發(fā)揮治療的作用。需要通過(guò)構(gòu)建藥物/載體復(fù)合體，保護(hù)siRNA免被酶分解的同時(shí)，提高siRNA的轉(zhuǎn)染效率。

通過(guò)接枝聚合制備殼聚糖-聚二甲基二烯丙基氯化銨核酸載體，與siRNA、離子交聯(lián)劑ST通過(guò)靜電作用力結(jié)合型成納米核酸藥物。結(jié)果顯示，CP:ST:siRNA的質(zhì)量比分別為24:2:1時(shí)，能很好的包裹siRNA。CP具有較高的安全性，能促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)。CP:ST:siRNA的質(zhì)量比為24:2:1時(shí)，納米核酸藥物具有良好的抑制目的基因表達(dá)的作用。本文制備的核酸載體有望發(fā)展為平臺(tái)性技術(shù)，為多種核酸藥物的有效遞送提供可能。