張瀟晗，張曉蕾，牛麗穎,2,3，畢曉東,2,3

(1 河北中醫(yī)學(xué)院，河北 石家莊 050091；2 河北省中藥配方顆粒創(chuàng)新中心，河北 石家莊 050091；3 河北省中藥材品質(zhì)評價與標(biāo)準(zhǔn)化工程研究中心，河北 石家莊 050091)

氫溴酸樟柳堿作為M膽堿受體阻斷劑, 具有較強(qiáng)的中樞和外周抗膽堿活性, 能夠解除血管痙攣[1], 改善微循環(huán), 還有平喘、解痙、散瞳、抑制唾液分泌、對抗有機(jī)磷中毒、抑制血小板活性等作用, 其安全性高于其他同類藥物，將樟柳堿的氫溴酸鹽作為臨床用藥, 研究開發(fā)得到的包括注射液、片劑等劑型也已成功應(yīng)用于臨床[2]。氫溴酸樟柳堿是天然提取的托品烷類生物堿，存在莨菪堿、山莨菪堿和阿托品等結(jié)構(gòu)類似的活性物質(zhì)，在藥物分析中需要進(jìn)行分離和鑒別。常用的分析方法有薄層色譜、電泳、液相色譜等方法，本實(shí)驗采用新型高效環(huán)保的加壓毛細(xì)管電色譜法[3-4]，對氫溴酸樟柳堿等三種生物堿類成分進(jìn)行分離。

1 實(shí) 驗

1.1 儀器試劑

TriSepTM-2100加壓毛細(xì)管電色譜，上海通微分析技術(shù)有限公司；UV-2102PC 型紫外-可見分光光度計，上海尤尼柯儀器有限公司；超聲波清洗器；旋渦混合器；濾頭，注射器；純水機(jī)。

氫溴酸樟柳堿、氫溴酸東莨菪堿、氫溴酸山莨菪堿標(biāo)準(zhǔn)品(純度)；甲醇(分析純);乙腈(色譜純)；實(shí)驗用水為RO級別用水;所有試劑和溶液在進(jìn)樣器前都需要用0.2 μm濾膜過濾，流動相需超聲除氣。

1.2 實(shí)驗方法

準(zhǔn)確稱取氫溴酸樟柳堿、氫溴酸東莨菪堿、氫溴酸山莨菪堿標(biāo)準(zhǔn)品4 mg，置離心管中，加適量甲醇溶解，配置成2 mg/mL的氫溴酸樟柳堿、氫溴酸東莨菪堿、氫溴酸山莨菪堿的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，超聲10 min，備用。精密吸取三種標(biāo)準(zhǔn)儲備液各200 μL于3個離心管中，加甲醇1800 μL，用旋渦混合器震蕩搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)品溶液。精密吸取三種標(biāo)準(zhǔn)儲備液各100 μL于1個離心管中，加甲醇2700 μL，用旋渦混合器震蕩搖勻，作為混標(biāo)。

pCEC-UV色譜條件，毛細(xì)管填充柱(EP-100-20/45-3-C18，內(nèi)徑 100 μm，總長度 45 μm，有效長度20 cm，ODS填料內(nèi)徑3 μm)；流動相：乙腈-50 mmol/L磷酸二氫鉀(含0.08%三乙胺)=15:85；流動相的流速為0.07 mL/min,分離電壓為0 KV，紫外檢測波長為210 nm。進(jìn)樣量 2 μL；電壓施加在毛細(xì)管的出口端，進(jìn)口端接地。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動相的優(yōu)化

本實(shí)驗對流動相的體積分?jǐn)?shù)進(jìn)行了優(yōu)化，有機(jī)相乙腈的比例的改變，會改變樣品在固定相和流動相之間的分配比例，從而改變分離度[5]。 本實(shí)驗考察了乙腈的體積分?jǐn)?shù)為10%，15%，20%時的分離效果。當(dāng)乙腈體積分?jǐn)?shù)為10%時不出峰，隨著乙腈體積分?jǐn)?shù)的增加到20%，氫溴酸樟柳堿、氫溴酸東莨菪堿、氫溴酸山莨菪堿不能完全達(dá)到基線分離。當(dāng)乙腈體積分?jǐn)?shù)選擇15%時，出峰良好，基本達(dá)到基線分離，因此本實(shí)驗選擇15%乙腈為有機(jī)流動相。本實(shí)驗同時考察了三乙胺對氫溴酸樟柳堿的分離影響。實(shí)驗發(fā)現(xiàn)，三乙胺的加入可明顯改善峰形，提高靈敏度，因此實(shí)驗選擇加入0.08%的三乙胺。

2.2 流動相流速的選擇

流速的大小直接改變柱壓，從而影響出峰時間以及分離度，本實(shí)驗考察了(0.05，0.07 mL/min)兩種流速對氫溴酸樟柳堿三種生物堿的分離效果。實(shí)驗表明在壓力允許的范圍內(nèi)，流速的增大，可減小分離時間，縮短單個組分的出峰時間。因此本實(shí)驗選擇0.07 mL/min。圖1，圖2分別為流速0.05，0.07 mL/min，進(jìn)樣量2 μL混標(biāo)的分離情況，峰1，2，3，分別為氫溴酸樟柳堿、氫溴酸山莨菪堿、氫溴酸東莨菪堿。

圖1 混標(biāo)電色譜圖(流速0.05 mL/min，進(jìn)樣量2 μL)

圖2 混標(biāo)電色譜圖(流速0.07，進(jìn)樣量2 μL)

2.3 分離電壓的選擇

電壓的增加會改變電滲流的大小，從而影響各組分之間的保留情況。本實(shí)驗考察了不同電壓(+6，+15，0，-6，-15 kV)下對氫溴酸樟柳堿等三種生物堿的分離效果。由圖3～圖6可知，在毛細(xì)管出口端施加正電壓或負(fù)電壓，都對氫溴酸樟柳堿、氫溴酸山莨菪堿、氫溴酸東莨菪堿三種生物堿的出峰時間無顯著影響，也無改善峰形等影響效果。并且隨著電壓的增大，電流持續(xù)時間增長，會出現(xiàn)焦耳熱，從而增加基線的平衡時間。對比不加電壓的情況，綜合選擇0 kV為分離電壓。

圖3 混標(biāo)電色譜圖(流速0.07，進(jìn)樣量2 μL，+6 kV)

圖4 混標(biāo)電色譜圖(流速0.07，進(jìn)樣量2 μL，+15 kV)

圖5 混標(biāo)電色譜圖(流速0.07，進(jìn)樣量2 μL，-6 kV)

圖6 混標(biāo)電色譜圖(流速0.07，進(jìn)樣量2 μL，-15 kV)

3 結(jié) 論

本文建立了加壓毛細(xì)管電色譜分離氫溴酸樟柳堿等三種生物堿類成分，在10 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了氫溴酸樟柳堿、氫溴酸山莨菪堿、氫溴酸東莨菪堿三種生物堿快速高效分離，該方法的分離時間短，消耗有機(jī)試劑量小，為氫溴酸樟柳堿等生物堿類成分的分離提供了一種新型快速高效的分離方法。