陳鎮(zhèn)何曉瑩 任靜 俎峰趙凱琴李根澤黃曉霞程小毛

（1.西南林業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院，國家林業(yè)與草原局西南風(fēng)景園林工程技術(shù)研究中心，云南昆明 650233；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所，云南昆明 650225）

油菜（Brassicanapus）是我國植物油生產(chǎn)最主要的油料作物之一[1-2]。在同一遺傳背景下，黃籽油菜較黒籽油菜具有種皮薄、含油量高及油清澈透明等多方面優(yōu)點[3-4]。然而在推廣面積最大的油菜栽培類型—甘藍型油菜中卻不存在天然黃籽種質(zhì)資源，故而開展黃籽甘藍型油菜種質(zhì)創(chuàng)新，一直是甘藍型油菜品質(zhì)育種的重大研究課題之一。研究表明，僅在種子發(fā)育時期種皮部位特異表達的TT8基因是種皮色素代謝通路下游的重要轉(zhuǎn)錄因子，其突變后可獲得透明/黃色種皮，并提升籽粒含油量[5]。Zhai等[6]利用最新的CRISPR/Cas9技術(shù)編輯BnTT8的2個同源拷貝，創(chuàng)制出了黃籽甘藍型油菜，該黃籽突變性狀可穩(wěn)定遺傳且對含油量有明顯的提升作用。因此，探究蕓薹屬（Brassica）作物TT8基因功能，對促進黃籽種質(zhì)的創(chuàng)制工作具有較為重要的現(xiàn)實意義。

對于種子種皮色澤性狀的研究，前人以擬南芥（Arabidopsisthaliana）開展了大量探索。1992年，Shirley等[7-8]最早利用電離輻射發(fā)現(xiàn)2個透明突變tt基因，隨后研究認為突變體能破壞種皮色素的合成積累，其中tt8與ttg能特異地影響類黃酮生物合成途徑，導(dǎo)致種皮色素?zé)o法積累，進而致使種皮呈現(xiàn)透明。Nesi等[9]發(fā)現(xiàn)，tt8基因編碼的蛋白是類黃酮途徑后期生物合成2個基因DFR和BAN的關(guān)鍵調(diào)控因子，推測TT8、TT2與TTG1之間的相互作用可能控制類黃酮的代謝。之后，Baudry等[10]研究證實了三者產(chǎn)生的肽鏈可結(jié)合形成三元復(fù)合體直接調(diào)控BAN表達，特異調(diào)控種皮發(fā)育中的類黃酮、原花青素生物合成途徑，對種皮色素積累起至關(guān)重要的作用。高度保守性的多肽鏈復(fù)合體對植物類黃酮合成積累具有重要調(diào)控作用，而轉(zhuǎn)錄因子TT8作為該復(fù)合體的中心組分已在多項研究中得到證實[11-15]。

蕓苔屬作物與擬南芥共屬十字花科（Brassicaceae），親緣關(guān)系緊密，TT8同源基因在油菜黃色籽粒性狀研究中起極為相似的作用。Li等[16]在白菜型油菜研究中報道，BrTT8被插入大片段新型轉(zhuǎn)座子，可致使基因突變與功能喪失，進而產(chǎn)生黃色種皮性狀。在芥菜型油菜研究中，Padmaja等[17]發(fā)現(xiàn)TT82個同源拷貝BjuA.TT8與BjuB.TT8的自然突變能控制其種皮黃色性狀。以上研究均表明，TT8是控制蕓薹屬作物種子顏色和含油量的關(guān)鍵調(diào)控因子，對擬南芥種皮透明與蕓薹屬作物黃籽性狀起重要作用，但目前尚未有對蕓薹屬作物TT8基因開展系統(tǒng)生物信息學(xué)分析的研究報道。因此，本研究挖掘與鑒定蕓薹屬TT8基因，利用生物信息學(xué)方法對其核苷酸及氨基酸序列進行比較分析，在此基礎(chǔ)上，根據(jù)43份甘藍型油菜種質(zhì)材料的重測序數(shù)據(jù)對其TT8基因多態(tài)性進行分析，為進一步理解該基因參與種子種皮色澤變化的調(diào)控機制，以及促進油菜的黃籽種質(zhì)創(chuàng)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

蕓薹屬作物中白菜（Brassicarapa）、甘藍（Brassica oleracea)、芥菜（Brassica juncea）、黑芥（Brassicanigra）和甘藍型油菜的基因組數(shù)據(jù)從BRAD[18]（http://brassicadb.org/brad/）獲取，擬南芥的基因組數(shù)據(jù)從TAIR（https://www.arabidopsis.org/）下載。擬南芥AtTT8(AT4G09820.1)基因核苷酸序列從PlantTFDB[19]（http://planttfdb.gao-lab.org/）檢索下載并作為種子或探查序列（query sequence）。

1.2 蕓薹屬作物TT8同源基因的鑒定及理化性質(zhì)分析

構(gòu)建白菜、甘藍、芥菜、黑芥、甘藍型油菜和擬南芥本地基因組數(shù)據(jù)庫，以擬南芥TT8蛋白氨基酸序列為探針序列，設(shè)置閾值（E）為10-5,使用本地BLAST程序進行比對檢索，分別獲取TT8候選基因蛋白序列。從Pfam數(shù)據(jù)庫[20]下載保守結(jié)構(gòu)域bHLH-MYC_N的隱馬爾科夫模型（HMM）PF14215.7，使用本地Hmmersearch軟件，E值＜10-5，進行二次比對檢索。利用在線工具Conserved Domain Search （https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrps-b.cgi）及數(shù)據(jù)庫SMART[21]（http://smart.embl-heidelberg.de/）對已得到的TT8同源拷貝驗證bHLH-MYC_N結(jié)構(gòu)域的存在，篩選兩次基因組比對檢索結(jié)果，整理去冗余及假基因后得到蕓薹屬作物的TT8基因成員并命名。使用WoLF PSORT（https://wolfpsort.hgc.jp/）和ExPASy[22]中Protparam工具（https://web.expasy.org/protparam/）預(yù)測其亞細胞位置和基礎(chǔ)理化性質(zhì)。

1.3 序列比較與系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

DNAMAN軟件對蛋白氨基酸序列進行比較分析，基于多重比對結(jié)果，采取MEGA[23]軟件中鄰接法（NJ），默認參數(shù)構(gòu)建TT8同源蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 保守結(jié)構(gòu)域及Motif預(yù)測

在線工具CDD預(yù)測TT8蛋白保守結(jié)構(gòu)域，E值為10-5；MEME[24]（http://meme-suite.org/tools/meme）預(yù)測其Motif，其中參數(shù)設(shè)置為：基序位點按任意重復(fù)次數(shù)，Motif 數(shù)最大為10，Motif最小寬度為6，最大寬度為50。上述結(jié)果下載保存，并使用TBtools[25]繪圖。

1.5 蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

采用SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）在線預(yù)測分析擬南芥、芥菜、黑芥、白菜、甘藍與甘藍型油菜TT8蛋白的三級結(jié)構(gòu)。

1.6 染色體定位與共線性分析

在甘藍型油菜全基因組數(shù)據(jù)中獲取TT8同源基因位置信息；利用MCScanX[26]對擬南芥、甘藍型油菜及近緣物種間進行共線性分析，用TBtools中Advanced Circos工具繪制TT8基因共線性關(guān)系圖。

1.7 CRISPR/Cas9靶點選擇及sgRNA設(shè)計與本地化分析

提交擬南芥TT8基因（AT4G09820.1）到sgRNA在線分析網(wǎng)站（http://chopchop.cbu.uib.no/），獲取AtTT8基因sgRNA序列位點及序列信息。使用ncbi-blast-2.11.0+軟件包makeblastdb命令，分別構(gòu)建白菜、甘藍、芥菜、黑芥、甘藍型油菜和擬南芥的CDS序列本地化數(shù)據(jù)庫。輸入文件為擬南芥TT8基因的sgRNA序列，利用命令將其提交至本地化數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對，其參數(shù)設(shè)置為-qcov_hsp_perc 100-task blastn-short-outfmt 6-evalue 1E-3。

1.8 甘藍型油菜核心種質(zhì)資源TT8基因的變異檢測與多態(tài)性分析

為探究甘藍型油菜BnTT8自然變異信息，利用云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所油菜中心提供的43份核心種質(zhì)重測序數(shù)據(jù)進行SNP與InDel分析（項目編號：PRJCA006241/CRA004803）。使用Burrows-Wheeler Aligner[27]中MEM算法，將reads映射至“Darmor-bzh”基因組（https://www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/data/）。使 用SAMtools[28]對reads進行比對并排序，PICARD[29]去重 復(fù)（http://broadinstitute.github.io/picard/）。使用GATK[30]中HaplotypeCaller模塊對所有樣品進行SNP、InDel檢測，過濾SNP參數(shù):QD＜2.0||MQ＜40.0||FS＞60.0||SOR ＞3.0||MQRankSum＜-12.5||ReadPosRankSum ＜-8.0；過 濾Indel參數(shù)：QD＜2.0||FS＞200.0|| SOR ＞10.0||MQRank-Sum ＜-12.5|| ReadPosRankSum＜-8.0。采用ANNOVAR[31]軟件進行SNP、Indel注釋，提取并統(tǒng)計甘藍型油菜BnTT8基因的變異注釋信息。序列變異頻率=變異位點總數(shù)/參考基因組基因序列長度。

2 結(jié)果與分析

2.1 TT8蛋白理化性質(zhì)和亞細胞定位分析

通過本地BLAST和Hmmersearch檢索比對，在線數(shù)據(jù)庫CDD和SMART鑒定TT8基因均含有完整的bHLH結(jié)構(gòu)域。研究發(fā)現(xiàn)，共獲得檢索鑒定得到共8條TT8蛋白序列，其中擬南芥有1條，芥菜有2條，黑芥有1條，白菜有1條，甘藍有1條，甘藍型油菜中有2條（表1）。在所有TT8基因中，蛋白基礎(chǔ)理化性質(zhì)差異較不明顯，其蛋白長度為512（BjuB004115）～566（BjuA034148），分子量為58.698（BjuB004115）～64.917（BjuA034148）kD，等電點為5.48（BjuA034148）～5.90（BniB08g 052890.2N.1），不穩(wěn)定系數(shù)為49.61（AT4G09820.1）～59.25（BjuA034148），脂肪族系數(shù)為79.19（AT4G09820.1）～86.61（BraA09g028560.3C），疏水性指數(shù)為-0.601（BjuA034148）～-0.415（BniB08g052890.2N.1）。從理化性質(zhì)看，其所有等電點均小于6，為弱酸性，這與水稻（Oryzasativa）[32]研究現(xiàn)象保持一致；不穩(wěn)定系數(shù)均大于40為不穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)；總疏水性指數(shù)均小于0，表明其所有成員屬親水性蛋白；亞細胞定位結(jié)果，均位于在細胞核上。

表1 擬南芥、芥菜、黑芥、白菜、甘藍與甘藍型油菜TT8基因的信息Table 1 TT8 gene information of A.thaliana, B. juncea, B.nigra, B.rapa, B.oleracea and B.napus

2.2 TT8蛋白序列對比與系統(tǒng)發(fā)育分析

利用DNAMAN進行多序列比對發(fā)現(xiàn)，8個蛋白序列均存在典型bHLH保守結(jié)構(gòu)域（圖1）。bHLH結(jié)構(gòu)域高度保守，分為堿性區(qū)域、2個螺旋及1個環(huán)形區(qū)域，這4個保守區(qū)域由約60個氨基酸組成；該結(jié)構(gòu)域含有2個功能分區(qū)，一個位于N端由13～17個主要堿性氨基酸構(gòu)成，其主要DNA結(jié)合特異性位點有關(guān)；另一個位于C端的HLH區(qū)域，主要由疏水性氨基酸組成，與相鄰的兩個螺旋，共同組成螺旋—環(huán)—螺旋結(jié)構(gòu)[33]。系統(tǒng)進化樹表明，8個TT8同源基因的親緣關(guān)系極為接近，進一步可分為兩大類：一類為擬南芥TT8基因AT4G09820.1；另一類為蕓薹屬作物TT8同源基因。其中，甘藍型油菜（BnaA09g22810D、BnaC09g24870D）與白菜（BraA09g028560.3C）、甘藍（Bo9g086910.1）遺傳相似度分別為94和99，遺傳關(guān)系更為緊密，進一步說明甘藍型油菜TT8基因高度保守（圖2）。

圖1 TT8蛋白的多序列比對Fig.1 Multiple sequence alignment of TT8 protein

圖2 TT8蛋白的系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of TT8 protein

2.3 TT8蛋白保守結(jié)構(gòu)域及Motif分析

對TT8蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，所有成員均具有典型的bHLH-MYC_N結(jié)構(gòu)域蛋白（PF14215），屬于bHLH蛋白超家族，且含有雙結(jié)構(gòu)域（圖3）。蕓薹屬作物TT8同源基因含有bHLH_SF superfamily結(jié)構(gòu)域，而AT4G09820.1另含bHLH_AtTT8_like結(jié)構(gòu)域。

圖3 TT8蛋白結(jié)構(gòu)域示意圖Fig.3 Schematic representation of TT8 protein

利用MEME對TT8同源蛋白序列進行Motif預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，Motif數(shù)量與種類差異較小，擬南芥TT8基因AT4G09820.1不含有Motif8外，其余均與蕓薹屬作物TT8同源基因Motif相同（表2、圖4）。

表2 TT8基因的Motif信息Table 2 Motif information of TT8 gene

圖4 TT8蛋白Motif示意圖Fig.4 Schematic representation of TT8 protein Motif

2.4 TT8蛋白3級結(jié)構(gòu)分析

對TT8同源蛋白的三級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，如圖5展示：基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)由α螺旋、無規(guī)則卷曲、β轉(zhuǎn)角及延長鏈構(gòu)成。所預(yù)測的蛋白三級結(jié)構(gòu)模型，AT4G09820.1、BraA09g028560.3C、BnaC09g2487 0D、BnaA09g22810D、Bo9g086910.1這5個幾乎一致，而BjuA034148與上述模型也極為相似，BjuB004115、BniB08g052890.2N.1則部分相似，進一步表明其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系緊密。

圖5 TT8蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.5 Tertiary structure prediction of TT8 protein

2.5 染色體定位與共線性分析

通過系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)，甘藍型油菜與其近緣物種白菜、甘藍親緣關(guān)系最近；對擬南芥、甘藍型油菜及其近緣物種TT8同源基因，進行染色體定位與共線性分析（圖6）。發(fā)現(xiàn)擬南芥的AT4G09820.1基因位于Chr4染色體，甘藍型油菜及其近緣物種TT8同源基因均定位于基因組或亞基因組第9條染色體上；擬南芥、白菜、甘藍與甘藍型油菜之間，共6個基因?qū)Υ嬖诠簿€性關(guān)系，且分別各存在2個共線性基因?qū)?。研究認為，TT8基因在染色體間存在少量且相等的共線性基因?qū)?，基因組內(nèi)部未見共線性關(guān)系，甘藍型油菜BnTT8基因的產(chǎn)生，主要通過白菜、甘藍的染色體間同源復(fù)制拷貝形成，整體數(shù)量較少，進一步說明，在異源四倍體甘藍型油菜的基因組進化過程中，TT8基因具有高度的功能保守性。

圖6 擬南芥、白菜、甘藍與甘藍型油菜TT8基因染色體定位及基因組間共線性分析Fig.6 Chromosome location and syntenic relationship of TT8 genes in A.thaliana,B.rapa, B.oleracea,and B.napus

2.6 TT8基因中高度保守的sgRNA序列

提交擬南芥TT8基因（At4g09820）到sgRNA在線網(wǎng)站分析，設(shè)計sgRNA共147條，可作為CRISPR/Cas9編輯的靶點（圖7）。之后利用這147條AtTT8的sgRNA分別提交甘藍型油菜、白菜、甘藍、芥菜、黑芥CDS序列本地化數(shù)據(jù)庫進行BLAST分析，其中4條sgRNA序列存在于所有7個TT8同源基因中，顯示出高度的進化保守性，推測是TT8基因功能所必須的。

圖7 擬南芥TT8基因的目標靶點區(qū)域Fig.7 The target region of TT8 gene in A.thaliana

根據(jù)基因在染色體上的相對位置（表3），深入分析發(fā)現(xiàn)這4條sgRNA均位于AtTT8第7個外顯子上，對應(yīng)bHLH結(jié)構(gòu)域。后續(xù)選擇這4條sgRNA序列位點作為蕓薹屬作物TT8基因CRISPR/Cas9編輯靶點，預(yù)期更易獲得TT8基因功能缺失突變體。

表3 TT8基因目標靶點的選擇Table 3 Selection of target of TT8 gene

2.7 甘藍型油菜核心種質(zhì)資源TT8基因的變異檢測結(jié)果與多態(tài)性分析

甘藍型油菜TT8同源基因：BnaA09g22810D和BnaC09g24870D，其全長分別為3668、2798 bp，基本結(jié)構(gòu)均由5'UTR、7個外顯子、6個內(nèi)含子組成。基于云南農(nóng)科院油菜中心收集到的43份核心種質(zhì)資源的重測序數(shù)據(jù)，在甘藍型油菜TT82個同源基因共檢測到11個多態(tài)性位點（表4），且均位于5'UTR區(qū)，包括4個SNP和1個單堿基InDel、6個 多 堿 基InDel（DNA的 缺 失/插 入）；其發(fā)生的總頻率為0.00308，SNP與InDel出現(xiàn)的總頻率分別為0.00109和0.00199；其中BnaA09g 22810D的SNP有4個，出現(xiàn)頻率為0.00109，InDel有6個，出現(xiàn)頻率為0.00163，而BnaC09g24870D僅存在1個InDel，出現(xiàn)頻率為0.00036。在檢測的4個SNP中，2個SNP發(fā)生了嘌呤與嘌呤間的轉(zhuǎn)換，2個發(fā)生了嘧啶與嘌呤間的顛換，轉(zhuǎn)換與顛換的發(fā)生頻率相同。1個單堿基InDel位點以A堿基的插入，多堿基InDel位點以a：堿基序列為TA、b：堿基序列為GGAGAGGGAGAGGGAG、c：堿基序列為AG、d：堿基序列為AGAGAGAGAGAGAGA、e：堿基序列為CA，這5種類型的插入/缺失。多態(tài)性在甘藍型油菜TT82個同源基因的各區(qū)域及基因間呈不均勻分布。

表4 43份核心種質(zhì)資源中BnTT8序列多態(tài)性分布Table 4 Polymorphism of BnTT8 sequence in 43 coregermplasm resources

3 結(jié)論與討論

十字花科蕓薹屬植物是油料作物的重要來源，其中甘藍型油菜是世界第三大的油料作物，占總植物油產(chǎn)量的16%左右[34]。提升甘藍型油菜含油量，不斷優(yōu)化菜籽油品質(zhì)一直為研究熱點；研究表明，油菜黃籽較黑籽的含油量與蛋白質(zhì)比例更高。在十字花科作物中，TT8基因是參與種皮顏色調(diào)控的關(guān)鍵基因，該基因突變可造成功能喪失，形成透明或半透明種皮，這已在擬南芥[9]、白菜型油菜[16]及芥菜型油菜[17]中得到證實。因此，在蕓薹屬作物尤其是甘藍型油菜中，TT8基因系統(tǒng)性的生物信息學(xué)分析，對解析TT8基因生物學(xué)功能及創(chuàng)新育種具有重要意義。

近年來，隨著擬南芥和蕓薹屬作物全基因組數(shù)據(jù)庫的建立，以及對部分基因家族鑒定與研究，為蕓薹屬作物TT8基因的生物信息學(xué)分析，奠定了扎實的數(shù)據(jù)與理論基礎(chǔ)。本研究在蕓薹屬數(shù)據(jù)庫中共鑒定出7個TT8同源拷貝，其基本理化性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，整體呈弱酸性且結(jié)構(gòu)較不穩(wěn)定；亞細胞定位均位于細胞核上，這與齊雙慧[5]對BnTT8煙草葉片亞細胞定位實驗結(jié)果相符。

bHLH蛋白是廣泛存在于動植物轉(zhuǎn)錄因子中的一大超家族，在多種生物過程和組織發(fā)育中起著重要調(diào)控作用，該家族已在擬南芥、水稻、玉米（Zeamays）等[35-36]多種植物中得到鑒定與研究。前人研究認為，擬南芥TT8基因是bHLH轉(zhuǎn)錄因子超家族的成員之一，主要通過對bHLH蛋白合成進行調(diào)控，進而對種子發(fā)育及物質(zhì)儲藏產(chǎn)生重要影響[33]。白菜BrTT8基因編碼bHLH結(jié)構(gòu)蛋白，其蛋白序列在C端存在明顯的bHLH信號[16]。本研究中，蕓薹屬作物TT8基因包含典型的bHLH保守結(jié)構(gòu)域，其保守的bHLH結(jié)構(gòu)域由堿性、第一螺旋、環(huán)和第二螺旋區(qū)域共同構(gòu)成。保守元件發(fā)現(xiàn)，基因成員均含有相似的Motif和結(jié)構(gòu)域，與Doebley等[37]發(fā)現(xiàn)來自同一拷貝的基因擁有相似的結(jié)構(gòu)與保守Motif相一致；在BnCKX基因分析中也得到相同的結(jié)論[38]。

甘藍型油菜2個TT8同源拷貝分別同白菜與甘藍聚為一類，且均定位于第9條染色體上，其蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測模型幾乎一致，親緣關(guān)系高度緊密。擬南芥、白菜、甘藍與甘藍型油菜基因組間共線性分析認為，TT8基因復(fù)制擴張程度較小，不存在基因丟失現(xiàn)象，這可能也是成員較少，基因保守程度較高的原因之一。此外，本研究分析獲得4條sgRNA序列位點，可作為蕓薹屬作物TT8基因CRISPR/Cas9編輯靶點，預(yù)期更易獲得TT8基因功能缺失突變體，為CRISPR/Cas9系統(tǒng)在蕓薹屬中應(yīng)用提供一定的參考。

SNP是在植物全基因組中出現(xiàn)頻率最高的遺傳多態(tài)性[39]。本研究基于云南省農(nóng)科院經(jīng)濟作物研究所對43份甘藍型油菜材料的全基因組重測序數(shù)據(jù)，對TT8基因進行核苷酸多態(tài)性分析，共檢測到11個多態(tài)性位點，包括4個SNP和1個單堿基InDel、6個多堿基InDel（DNA的缺失/插入）；其發(fā)生的總頻率為0.00308，SNP與InDel出現(xiàn)的總頻率分別為0.00109和0.00199。與前人研究中的人類基因組SNP頻率1/1000[40]相近，而遠高于玉米的SNP頻率1/57[41]及水稻的SNP頻率1/154[42]，表明植物全基因組中該基因的單核苷酸多態(tài)性較為單一匱乏。此外，SNP轉(zhuǎn)換與顛換的發(fā)生頻率相同，很有可能在進化過程中TT8基因高度保守，在自然條件下極難發(fā)生AC基因組上的同時突變，從而產(chǎn)生黃色性狀。

總體而言，蕓薹屬TT8基因是bHLH轉(zhuǎn)錄因子超家族成員之一，含bHLH結(jié)構(gòu)域，序列高度保守。本研究揭示蕓薹屬作物TT8基因進化保守位點與功能結(jié)構(gòu)域，為利用CRISPR/Cas9對蕓薹屬特別是甘藍型油菜的黃籽創(chuàng)新育種提供參考。