陳孟君 梁永強(qiáng) 袁燕文

痔瘡分為內(nèi)部和外部，是一種相當(dāng)常見的疾病，盡管一直以來都試圖闡明其病理生理學(xué)，以治愈、改善患者的生活質(zhì)量，然而該疾病的許多方面仍然難以捉摸［1］。其中內(nèi)痔常見于45～65 歲人群中，因其為良性疾病，所以并未引起人們足夠的重視，有關(guān)內(nèi)痔病理學(xué)研究相對(duì)較少，分子學(xué)機(jī)制等也尚未明確，其中“靜脈曲張”、“血管增生”、“肛墊下移”等學(xué)說是目前內(nèi)痔形成與發(fā)展的主要機(jī)制理論［2］。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）屬于新生血管形成因子，可促進(jìn)血管內(nèi)皮的分化與增殖［3］，堿性成纖維細(xì)胞生長因子-2（fibroblast growth factor-2，F(xiàn)GF-2）可促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂及血管生成［4］，雌激素受體（estrogen receptor，ER）在血管生成調(diào)控中起到促進(jìn)作用［5］。本研究通過檢測Ⅲ、Ⅳ分度內(nèi)痔患者術(shù)前內(nèi)痔黏膜VEGF、FGF2、ER 表達(dá)，探討術(shù)前內(nèi)痔粘膜中的分布特征，旨在進(jìn)一步闡明內(nèi)痔發(fā)生的分子機(jī)制，為臨床治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019 年10 月至2021 年11 月于東莞市人民醫(yī)院就診的Ⅲ、Ⅳ分度的內(nèi)痔患者96 例作為研究對(duì)象，Ⅲ分度的內(nèi)痔患者為Ⅲ度組（n=50）、Ⅳ分度的內(nèi)痔患者為Ⅳ度組（n=46），以及選取同期體檢志愿者35 名非痔患者作為正常組。內(nèi)痔患者納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《痔臨床診治指南（2006 版）》［6］中內(nèi)痔診斷標(biāo)準(zhǔn)；②年齡20～75 歲；③Ⅲ、Ⅳ分度并符合手術(shù)指征；④患者及其家屬均知情同意本研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：①無法耐受像關(guān)治療并中途終止治療者；②合并凝血功能障礙患者；③存在惡性腫瘤或其他重要器官功能障礙患者；③哺乳期或妊娠期患者。正常組為正常肛墊患者。Ⅲ度組男31 例，女19 例，平均年齡（42.52±6.41）歲，平均病程（5.72±2.43）年，BMI（25.79±3.34）kg/m2，既往治療0 次12 例、1 次20 例、2 次18 例；Ⅳ度組男28 例，女18 例，平均年齡（43.41±6.58）歲，平均病程（5.33±3.17）年，BMI（25.56±4.24）kg/m2，既往治療0 次9 例、1 次26 例、2 次11 例；正常組男18 名，女17 名，平均年齡（44.72±8.11）歲，BMI（24.83±2.34）kg/m2，三組性別比例、年齡、BMI 等差異無統(tǒng)計(jì)意義（P＞0.05）。本研究經(jīng)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 試劑與設(shè)備

蘇木素、伊紅染色液（四川維克奇生物科技有限公司），VEGF、ER 抗體（德國默克公司），F(xiàn)GF2 抗體（ABclonal 公司），羊抗兔免疫球蛋白IgG 抗體（德國默克公司），DAB 顯色液（福州邁新生物科技有限公司）；18596W6WEE 生物顯微鏡（德國Leica 公司），HS-S7220-B 電動(dòng)石蠟切片機(jī)（廣東恒松科技有限公司），胃腸功能檢測系統(tǒng)擠壓力換能器（瑞典Medtronic-Synectic 公司）。

1.2.2 組織病理學(xué)檢查

所有標(biāo)本均有病理科常規(guī)固定取材后，進(jìn)行脫水、石蠟包埋等處理，根據(jù)分度及正常肛墊進(jìn)行編號(hào)，采用組織切片機(jī)進(jìn)行連續(xù)切片，在采用HE染色，于生物顯微鏡下觀察。

1.2.3 免疫組化檢測

采用免疫組化法檢測各組VEGF、FGF2 及ER 表達(dá)與分布。將組織石蠟片置于65℃烤箱中90 min 后進(jìn)行脫蠟，修復(fù)3 次后加入山羊血清，37℃保溫性中封閉30 min 后加入一抗，VEGF、FGF2、ER 抗體，保濕4℃過夜，再加入羊抗兔免疫球蛋白IgG 抗體溫室孵育20 min，應(yīng)用PBS 液進(jìn)行洗片2 min，共洗3 次，避光，加入DAB 顯色劑至覆蓋組織切片，顯微鏡下觀察，棕黃色顯色后用蒸餾水終止，1 min，加入蘇木素進(jìn)行細(xì)胞核染色，1 min，蒸餾水沖洗至藍(lán)色，采用乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，在顯微鏡下進(jìn)行觀察，其中褐色則為陽性表達(dá)，采用圖像分析軟件進(jìn)行灰度（IOD）值測量。

1.2.4 臨床特征檢測

采用胃腸功能檢測系統(tǒng)擠壓力換能器對(duì)患者肛管靜息壓（anal canal resting pressure，RASP）、肛管收縮壓（anal canal resting pressure，MASP）、直腸感知閾值（rectal perceptual thresholds，RSTV）、直腸最大容量閾值（rectal maximum volume threshold，RMTV）進(jìn)行檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料用（±s）表示，兩組間比較用t檢驗(yàn)，多組間比較用F檢驗(yàn)，進(jìn)一步兩兩比較使用SNK-q 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用n（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)；采用Pearson相關(guān)性分析法進(jìn)行相關(guān)性分析；P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病理組織特點(diǎn)

正常組的肛墊組織黏膜層被覆蓋的上皮厚度均勻、完整，無明顯的出血以及血管增生，Trietz 肌纖維聚集且平行排列，形態(tài)較為規(guī)則，彈性纖維多。見圖1A。內(nèi)痔組織黏膜層被覆蓋的上皮呈連續(xù)性的破壞、糜爛甚至潰爛，黏膜厚度不均勻，黏膜以及黏膜的下層或可見炎癥浸潤，組織可見明顯的彌漫性出血，血管擴(kuò)張且數(shù)量增多，可見血管腔形成在或新鮮或陳舊的血栓，Trietz 肌排列紊亂疏松，纖維缺乏彈性，肌纖維有斷裂或變性。見圖1B。

圖1 組織病理學(xué)檢查（HE 法，×100）Figure 1 Histopathological examination（HE，×100）

2.2 正常組肛墊與與不同程度內(nèi)痔患者黏膜VEGF、FGF2 及ER 染色表現(xiàn)及表達(dá)水平比較

與正常組比較，內(nèi)痔黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞中具有明顯的棕褐色染色，正常組肛墊細(xì)胞質(zhì)內(nèi)沒有或僅有少量棕黃色可沉淀。內(nèi)痔Ⅲ度組與Ⅳ度組VEGF、FGF2 及ER 表達(dá)水平均高于正常組的表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Ⅳ度組的VEGF、FGF2 及ER 表達(dá)水平高于Ⅲ度組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 正常組肛墊與不同程度內(nèi)痔患者黏膜VEGF、FGF2 及ER 表達(dá)水平比較（±s）Table 1 Comparison of mucosal VEGF，F(xiàn)GF2 and ER expression levels between anal pads from normal subjects and patients with internal hemorrhoids of various degrees（±s）

表1 正常組肛墊與不同程度內(nèi)痔患者黏膜VEGF、FGF2 及ER 表達(dá)水平比較（±s）Table 1 Comparison of mucosal VEGF，F(xiàn)GF2 and ER expression levels between anal pads from normal subjects and patients with internal hemorrhoids of various degrees（±s）

注：與正常肛墊組比較，aP＜0.05；與內(nèi)痔Ⅲ度患者比較，bP＜0.05。

組別正常組Ⅲ度組Ⅳ度組F 值P 值n 35 50 46 VEGF 25.55±5.62 83.71±8.56a 112.74±15.46ab 636.745 0.000 FGF2 50.19±8.69 99.87±9.76a 121.43±13.45ab 430.832 0.000 ER 15.83±4.42 31.51±6.22a 52.46±8.87ab 288.301 0.000

2.3 各組臨床特征值比較

內(nèi)痔Ⅲ度組與Ⅳ度組RASP 水平高于正常組、Ⅳ度組高于Ⅲ度組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；MASP 水平低于正常組，Ⅳ度組低于Ⅲ度組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；各組RSTV、RMTV 水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組RASP、MASP、RSTV、RMTV 水平比較（±s）Table 2 Comparison of rasp，masp，rstv，and rmtv levels in each group（±s）

表2 各組RASP、MASP、RSTV、RMTV 水平比較（±s）Table 2 Comparison of rasp，masp，rstv，and rmtv levels in each group（±s）

注：與正常肛墊組比較，aP＜0.05；與內(nèi)痔Ⅲ度患者比較，aP＜0.05。

RMTV（mL）218.58±36.42 216.53±34.66 214.60±37.17 0.122 0.885組別正常組Ⅲ度組Ⅳ度組F 值P 值n 35 50 46 RASP（mmHg）31.56±10.42 64.74±11.14a 78.79±12.85ab 169.60 0.000 MASP（mmHg）162.44±17.85 144.86±33.86a 125.83±29.76ab 16.145 0.000 RSTV（mL）56.74±16.96 61.52±17.78 63.92±16.98 1.740 0.180

2.4 患者內(nèi)痔黏膜VEGF、FGF2 及ER 表達(dá)水平與RASP、MASP 的關(guān)系

VEGF、FGF2 表達(dá)水平與RASP 呈正相關(guān)、與MASP 呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；ER 表達(dá)水平與RASP、MASP 均無顯著相關(guān)性（P＞0.05）。見表3。

表3 患者內(nèi)痔黏膜VEGF、FGF2 及ER 表達(dá)水平與RASP、MASP 的相關(guān)性Table 3 Correlation of VEGF，F(xiàn)GF2 and ER expression levels with rasp and masp in internal hemorrhoidal mucosa of patients

3 討論

根據(jù)脫垂程度，內(nèi)痔可以進(jìn)一步分為Ⅰ至Ⅳ級(jí)［7］。痔瘡可以通過內(nèi)科和外科手術(shù)進(jìn)行治療，具體取決于它們的脫垂程度以及它們是內(nèi)部還是外部，Ⅲ級(jí)或Ⅳ級(jí)痔瘡最有效的治療方法是手術(shù)切除?！把茉錾鷮W(xué)說”是內(nèi)痔發(fā)生機(jī)制的主要學(xué)說之一［8］。目前利用分子生物學(xué)研究機(jī)制的方法已經(jīng)逐漸成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的主流［9］。

本研究對(duì)正常肛墊及內(nèi)痔黏膜組織病理學(xué)形態(tài)觀察比較，結(jié)果顯示，正常組的肛墊組織黏膜層被覆蓋的上皮厚度均勻、完整，無明顯的出血以及血管增生，Trietz 肌纖維聚集且平行排列，形態(tài)較為規(guī)則，彈性纖維多。內(nèi)痔組織黏膜層被覆蓋的上皮呈連續(xù)性的破壞、糜爛甚至潰爛，黏膜厚度不均勻，黏膜以及黏膜的下層或可見炎癥浸潤，組織可見明顯的彌漫性出血，血管擴(kuò)張且數(shù)量增多，可見血管腔形成在或新鮮或陳舊的血栓，Trietz 肌排列紊亂疏松，纖維缺乏彈性，肌纖維有斷裂或變性。正常肛墊的結(jié)構(gòu)與功能的震顫，需在血管與纖維結(jié)蹄組織的共同作用下維持，而病理情況下的肛墊組織，黏膜較薄，Trietz 肌的固定與支持作用遭到破壞，痔區(qū)的血管受到的約束降低，從而引起肛墊充血肥大甚至導(dǎo)致內(nèi)痔脫垂等［10］。

同時(shí)，本研究對(duì)內(nèi)痔粘膜VEGF、FGF2 及ER在術(shù)前的分布情況進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，VEGF、FGF2 與ER 在內(nèi)痔黏膜血管內(nèi)皮細(xì)胞中呈高表達(dá)狀態(tài)，表明VEGF、FGF2 與ER 的表達(dá)與內(nèi)痔墊的微血管生成有關(guān)。VEGF 具有重要促血管生成活性的生長因子，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞具有促有絲分裂和抗凋亡作用，增加血管通透性，促進(jìn)細(xì)胞遷移等［11］。FGF2 代表FGF 家族的原型成員，能夠在體外誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞中的復(fù)雜“血管生成表型”，促炎和血管生成信號(hào)之間的緊密相互作用，能夠在體內(nèi)誘導(dǎo)強(qiáng)有力的新血管反應(yīng)［12］。VEGF 和FGF-2 是最強(qiáng)的血管生成激活劑，其刺激現(xiàn)有血管中內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖以產(chǎn)生和穩(wěn)定新血管［13］。作為類固醇激素，雌激素在血管病理學(xué)方面獲得了廣泛的關(guān)注，ER 是雌激素的細(xì)胞受體，其可通過炎癥調(diào)節(jié)血管系統(tǒng)，調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞增殖、血管張力和新生血管［14］。在內(nèi)痔的生成過程中，血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，可促進(jìn)血管的生成，因此可誘導(dǎo)黏膜下的血管增生同時(shí)產(chǎn)生曲張、擴(kuò)張等情況，同時(shí)各種炎癥因子從管壁滲出，造成局部的炎癥細(xì)胞增殖，黏膜開始發(fā)生潰爛，因此痔瘡反復(fù)加重或不愈。本研究中VEGF、FGF2 表達(dá)水平與RASP 呈正相關(guān)、與MASP 呈負(fù)相關(guān)，可能與VEGF、FGF2在內(nèi)痔黏膜組織中的高表達(dá)導(dǎo)致肛墊血管過度增生，從而導(dǎo)致患者RASP 的升高、MASP 的降低［15］，而此作用可能為內(nèi)痔臨床癥狀的發(fā)生與發(fā)展的機(jī)制之一。

綜上所述，VEGF、FGF2 及ER 在內(nèi)痔墊的微血管的生成與發(fā)展具有重要作用，VEGF、FGF2 與患者臨床表現(xiàn)存在相關(guān)性，為臨床的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。