劉扣龍 鄭浩然

0 引言

近年來隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，以及儀器精度的提高，主要采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)對大規(guī)模蛋白質(zhì)組進行分析[1]。蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)采集策略主要有兩種，一種是數(shù)據(jù)依賴性采集(data dependent acquisition,DDA)[2]，另一種是數(shù)據(jù)非依賴性采集(data independent acquisition,DIA)[3]。在DIA中，將質(zhì)譜整個掃描范圍分為若干個窗口，循環(huán)地對每個窗口中的所有離子進行碎裂，而不是選擇具有特定質(zhì)荷比的離子，具有高通量、可重復(fù)性高的優(yōu)點[4]。但采用DIA方法進行碎裂，會導(dǎo)致二級質(zhì)譜是由多個母離子同時碎裂產(chǎn)生的混合質(zhì)譜，母離子與碎裂子離子之間不存在對應(yīng)關(guān)系，顯著增加了肽段定性和定量的復(fù)雜度。

目前在DIA數(shù)據(jù)的蛋白質(zhì)組分析中，主要都是基于提取離子色譜圖(extracted ion chromatogram,XIC)的方法[5]。例如，OpenSWATH[6]通過集成各種軟件工具來輔助DIA分析，提取目標(biāo)肽的色譜圖，對碎片離子的共洗脫峰進行評分，最后進行統(tǒng)計分析，其在數(shù)據(jù)處理方面較繁瑣。Wang等[7-8]計算了實驗質(zhì)譜與理論質(zhì)譜之間的余弦相似度，針對兩個肽段構(gòu)成的混合質(zhì)譜的情況進行求解，并給出非混合質(zhì)譜與混合質(zhì)譜的區(qū)分方法，提高了搜索質(zhì)譜庫的靈敏度。MSPLIT-DIA[9]計算歸一化點積，作為圖譜之間的相似度，結(jié)合色譜峰形、保留時間等相關(guān)特征來鑒定肽段。Specter[10]是在上述工作上進行了擴展，將DIA中混合二級質(zhì)譜的強度看作是不同肽段碎片離子強度的線性疊加，將混合二級質(zhì)譜和匹配到的肽段質(zhì)譜進行線性擬合，再將求解的肽段系數(shù)構(gòu)建色譜峰，提取峰特征，可以準(zhǔn)確地鑒定出相應(yīng)的肽段并進行定量分析，但線性求解過程中并不能完全擬合，存在很多誤差。使用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)提高定性效果的研究，例如DIA-NN[11]在定性時先構(gòu)建色譜峰，提取色譜峰相關(guān)的特征，用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)迭代尋找最佳的洗脫峰，從而獲取定性結(jié)果；定量時使用洗脫峰的積分結(jié)果，再進行校正處理，增加了定性和定量的肽段數(shù)量。但該方法在定性和定量時依然基于離子色譜圖的方式，流程復(fù)雜，結(jié)果會受到色譜圖復(fù)雜度和色譜時間的影響。FIGS[12]利用不同肽段質(zhì)譜中特有的峰對混合二級質(zhì)譜進行線性擬合，迭代求解每個肽段的系數(shù)，再構(gòu)建色譜峰，進行定性和定量，顯著提高了肽段定性和定量的準(zhǔn)確度，但該方法同樣存在求解時不能完全擬合，以及構(gòu)建色譜峰時存在誤差等問題。

這些基于離子色譜圖的方法都需要構(gòu)建離子色譜峰，經(jīng)過特征提取、積分等操作，會受到色譜維度的影響。色譜復(fù)雜度不同會對離子匹配和構(gòu)建出的色譜峰形產(chǎn)生影響；而色譜時間的長度和偏移會對離子間的色譜峰相關(guān)性產(chǎn)生影響，這些復(fù)雜流程中存在很多誤差，導(dǎo)致定性和定量結(jié)果不準(zhǔn)確。針對該方法存在的問題，課題組沒有使用色譜維度的信息，不需要構(gòu)建離子色譜峰，結(jié)合深度學(xué)習(xí)在分類和預(yù)測問題上的優(yōu)勢，提出了基于卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(convolutional neural network,CNN)的定性和定量模型，通過二分類和回歸預(yù)測的方式，直接獲取肽段的定性和定量結(jié)果，從而在減少色譜維度信息影響的同時，有效地進行蛋白質(zhì)組分析。

1 方法

1.1 預(yù)處理

混合二級質(zhì)譜和肽段的質(zhì)譜數(shù)據(jù)特征如圖1所示，橫軸為m/z，縱軸為峰強度。將肽段對應(yīng)的質(zhì)譜峰強度，轉(zhuǎn)換成一維向量形式，同時將肽段和多個混合二級質(zhì)譜進行峰匹配，將匹配后的峰強度轉(zhuǎn)換成多個一維向量形式，然后，經(jīng)過預(yù)處理和特征提取后輸入到CNN中。

圖1 質(zhì)譜數(shù)據(jù)示意圖Figure 1 Schematic diagram of mass spectrometry data

對于質(zhì)譜庫中的每個肽段母離子，記為Libi，在不同掃描時間點，都可能參與構(gòu)成其所在掃描窗口對應(yīng)的每個混合二級質(zhì)譜，為了找到和Libi最相關(guān)的混合二級質(zhì)譜，采用兩個條件進行過濾。

(1) 對于Libi的每個峰對應(yīng)的m/z值，匹配掃描窗口內(nèi)的每個混合二級質(zhì)譜，找到有峰重合的，并且重合數(shù)量大于5個的混合二級質(zhì)譜，僅保留混合二級質(zhì)譜中與Libi重合的峰。

(2) 將過濾后的每個混合二級質(zhì)譜，計算其和Libi的相關(guān)度，保留相關(guān)度最高的s個混合二級質(zhì)譜(不夠s個則用0填充)。使用2個信息進行相關(guān)度計算。

第1個信息：計算Libi和匹配到的混合二級質(zhì)譜的相似度。每個肽段母離子對應(yīng)質(zhì)譜的峰強度經(jīng)過歸一化(強度和為1)，先對匹配到的混合二級質(zhì)譜的峰強度做同樣的歸一化，記為MS2k。這樣二者的峰強度就都處于0到1之間了。理論上，對于其中一個混合二級質(zhì)譜MS2k，如果完全由肽段母離子Libi碎裂形成，即沒有其他肽段母離子的成分，則MS2k和Libi對應(yīng)m/z位置的歸一化后的峰強度應(yīng)該相同。所以計算Libi和MS2k的質(zhì)譜峰強度差的絕對值，然后求和作為二者間的距離，即：

(1)

第2個信息：肽段母離子Libi和匹配到的混合二級質(zhì)譜MS2k，理論上二者越相關(guān)，即如果該混合二級質(zhì)譜MS2k完全由肽段母離子Libi碎裂形成，則MS2k中和Libi對應(yīng)的峰的強度之和應(yīng)該越大。所以計算MS2k中和Libi對應(yīng)的質(zhì)譜峰的強度之和，作為二者間的距離，即：

(2)

為了同時使用這2個信息，對第2個信息進行處理，把Libi匹配到的混合二級質(zhì)譜計算得到的PeakSum，除以其中的最大值，這樣范圍處于0到1之間，與第1個信息的量級一樣，然后取負(fù)值和第1個信息相加。這樣得到的值越小，說明肽段母離子Libi和混合二級質(zhì)譜MS2k越相關(guān)。最后選擇最相關(guān)的s個混合二級質(zhì)譜保留下來。

1.2 定性模型

肽段定性需要使用前面預(yù)處理后的數(shù)據(jù)，利用肽段母離子的質(zhì)譜和該肽段匹配到的混合二級質(zhì)譜來判定該肽段母離子是否在實驗樣品中。設(shè)計1個基于CNN的二分類模型，若肽段屬于該樣品，則模型輸出的分?jǐn)?shù)接近于1，否則接近于0。這里采用CNN模型，是考慮到輸入的質(zhì)譜數(shù)據(jù)類似于彩色圖片的多通道，并且相鄰質(zhì)譜峰之間存在相關(guān)性。而傳統(tǒng)的機器學(xué)習(xí)模型需要提取大量相關(guān)的特征，并且會損失原始數(shù)據(jù)的信息，所以使用CNN，可以更好地提取深度特征。

利用前面預(yù)處理后的數(shù)據(jù)，進行特征提取。主要提取了2個特征，與預(yù)處理的相似度類似，但提取的是m/z維度的特征，沒有構(gòu)建色譜峰特征。

(1) 計算肽段匹配到的混合二級質(zhì)譜的m/z維度的峰強度的和，即將這些匹配到的混合二級質(zhì)譜合并為1個。

(3)

式中：s表示Libi匹配到的混合二級質(zhì)譜的個數(shù)；j表示Libi和MS2k對應(yīng)的第j個峰。

(2) 計算Libi和MS2k的質(zhì)譜峰強度差的絕對值。

(4)

模型結(jié)構(gòu)如圖2所示，首先將提取的特征輸入到CNN中去，再將提取的深度特征拼接到一起，然后經(jīng)過全連接層處理，最后經(jīng)過Sigmoid函數(shù)，獲取分類屬于正樣本的概率。使用二元交叉熵作為損失函數(shù)：

Loss=-[ylog2p+(1-y)log2(1-p)]

(5)

式中：y為真實標(biāo)簽，值為0或1；p為預(yù)測值，范圍是(0,1)。

網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)參數(shù)如表1所示。卷積層的輸出維度為：[batch size，卷積核個數(shù)，峰個數(shù)]，卷積層的參數(shù)個數(shù)等于卷積核的個數(shù)乘以核的大小。使用Adam算法優(yōu)化網(wǎng)絡(luò)參數(shù)。

表1 定性模型網(wǎng)絡(luò)參數(shù)Table 1 Network parameters of qualitative model

1.3 定量模型

定量模型的流程和定性模型類似，但是每一步的處理方式不同。肽段定量同樣利用前面預(yù)處理后的數(shù)據(jù)，這里不對該數(shù)據(jù)做其他處理，使用原始數(shù)據(jù)不會損失任何重要的信息，這樣能保證定量預(yù)測結(jié)果的準(zhǔn)確性。設(shè)計一個基于CNN的回歸模型，直接預(yù)測輸出該肽段的定量值。

模型結(jié)構(gòu)如圖3所示，將肽段質(zhì)譜和預(yù)處理后匹配到的混合二級質(zhì)譜分別輸入到CNN中去，將提取的特征拼接到一起，再經(jīng)過第二層CNN和全連接層處理，最后輸出一個值，作為肽段的定量值。使用均方誤差作為損失函數(shù)，即：

(6)

圖2 深度學(xué)習(xí)定性模型結(jié)構(gòu)圖Figure 2 Structure diagram of deep learning qualitative model

圖3 深度學(xué)習(xí)定量模型結(jié)構(gòu)圖Figure 3 Structure diagram of deep learning quantitative model

式中：y為肽段的定量值；y′i為預(yù)測值。

網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)參數(shù)如表2所示，表示方法與前面的定性模型相同。

表2 定量模型網(wǎng)絡(luò)參數(shù)Table 2 Network parameters of quantitative model

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)集

在LFQbench[13]論文中提供了很多DIA質(zhì)譜數(shù)據(jù)集，是專門用來評估蛋白質(zhì)組定性和定量準(zhǔn)確度而做的實驗數(shù)據(jù)集。質(zhì)譜數(shù)據(jù)由3個物種的蛋白質(zhì)酶解后的肽段，以2種比例分別混合后各進行3次重復(fù)SWATH-DIA[14]實驗采集得到(人類：[1∶1];酵母:[2∶1];大腸桿菌:[1∶4])。在不同窗口和儀器上進行實驗，得到不同的質(zhì)譜數(shù)據(jù)。選擇其中一個固定窗口的數(shù)據(jù)作為訓(xùn)練集，另一個可變窗口的數(shù)據(jù)作為測試集。

為了獲取訓(xùn)練數(shù)據(jù)集的標(biāo)簽，使用蛋白質(zhì)組定性和定量準(zhǔn)確度比較高的方法FIGS[12]，在訓(xùn)練集上計算得到定性和定量結(jié)果。對于定性模型，將FIGS定性到的肽段作為正樣本，將生成的decoy庫中的肽段作為負(fù)樣本(decoy庫中的質(zhì)譜不真實存在，用來混淆target庫中的質(zhì)譜，采用母離子交換-離子峰偏移的方式生成decoy[15])。對于定量模型，將FIGS得到的定量結(jié)果，選擇比較可靠且準(zhǔn)確的定量值作為訓(xùn)練目標(biāo)。使用LFQbench[13]論文中采用的定量精度評估指標(biāo)進行過濾，即先使用3次重復(fù)實驗的定量值計算變異系數(shù)(coefficient of variation,cv)，再使用cv<0.1過濾，選擇A樣品和B樣品中肽段定量比值比較好的結(jié)果。

2.2 定性結(jié)果

在肽段定性研究中，為了獲取比較可靠的定性肽段，需要同時對decoy庫中的肽段進行定性，通過控制錯誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate,FDR)來獲取最終定性到的肽段。使用深度學(xué)習(xí)定性模型在訓(xùn)練集上優(yōu)化網(wǎng)絡(luò)參數(shù)后，對測試集進行預(yù)測。target和decoy庫中的每個肽段都會預(yù)測得到一個概率分?jǐn)?shù)，然后計算FDR使其小于0.01。

為了驗證模型的準(zhǔn)確性，將模型最終定性到的肽段和FIGS定性到的肽段進行對比，如圖4所示?？梢钥吹剑瑑煞N方法定性到的肽段的交集數(shù)量為27 788，占深度學(xué)習(xí)定性肽段的比例為27 788/28 354=98.00%。這說明深度學(xué)習(xí)模型的定性結(jié)果比較可靠。

圖4 定性結(jié)果對比Figure 4 Comparison of qualitative results

同時，統(tǒng)計兩種方法在6個樣品中均定性到的肽段。FIGS定性交集為18 294個肽段，占總量的比例為18 294/40 978=44.64%；深度學(xué)習(xí)定性交集為13 680個肽段，占總量的比例為13 680/28 354=48.25%。統(tǒng)計FIGS在6個樣品中定性重復(fù)率均值為0.578 6；深度學(xué)習(xí)在6個樣品中定性重復(fù)率均值為0.662 9。說明深度學(xué)習(xí)在定性上的重復(fù)性很好，因此定性準(zhǔn)確度較高。

2.3 定量結(jié)果

在肽段定量研究中，為了證明定量方法的準(zhǔn)確性和可靠性，通常對重復(fù)實驗的數(shù)據(jù)集和不同比例混合肽段進行定量，查看比值結(jié)果。目前還沒有基于CNN利用DIA色譜信息直接進行肽段定量的研究工作，而FIGS論文使用肽段特有的離子構(gòu)建色譜峰，該方法的定量準(zhǔn)確度很高。所以為了評估深度學(xué)習(xí)定量模型的效果，使用深度學(xué)習(xí)模型和FIGS在測試集上分別進行定量。測試集一共有6個文件，包括A樣本和B樣本的3次重復(fù)實驗。先獲取A樣本和B樣本3次重復(fù)實驗均定性到的肽段的定量值，計算cv，保留cv<0.1的肽段，然后取均值作為該肽段的定量值。再計算A樣本和B樣本中同時出現(xiàn)的肽段的定量值比值，然后與FIGS進行對比，如圖5所示。

圖5 定量結(jié)果對比Figure 5 Comparison of quantitative results

FIGS在其論文中與主流DIA定量軟件進行了準(zhǔn)確度對比，包括Skyline[16]、OpenSWATH[6]、Spectronaut[17]、DIA-Umpire[18]和 Specter[10]。采用計算絕對中位差(median absolute deviation,MAD)的方式對比準(zhǔn)確度，效果明顯優(yōu)于主流軟件。本文采用同樣的方式與FIGS進行對比，將肽段在B樣品中的豐度等分為3部分，計算MAD。如圖5(a)所示，本文的深度學(xué)習(xí)模型與FIGS相比在定量準(zhǔn)確度上基本相當(dāng)。在圖5(b)和圖5(c)中繪制了肽段在A樣品和B樣品中的定量值的比值，虛線代表理論比值。從圖5(b)和圖5(c)中可以看到，深度學(xué)習(xí)模型定量準(zhǔn)確度高的肽段的數(shù)量比FIGS明顯增多，提高了19.33%[(5 290-4 433)/4 433]。說明與FIGS相比，深度學(xué)習(xí)能夠提高不同豐度下的肽段定量數(shù)量。

3 討論與結(jié)論

由于DIA數(shù)據(jù)是多個肽段同時碎裂產(chǎn)生的混合二級質(zhì)譜，比較復(fù)雜，給肽段定性和定量帶來了困難。目前主要基于提取離子色譜圖的方法進行定性和定量，但這種方法流程復(fù)雜，中間存在誤差，色譜圖復(fù)雜度和色譜時間的不同會導(dǎo)致定性和定量結(jié)果不準(zhǔn)確。針對該方法存在的問題，本文提出了一種新的肽段定性和定量方法，沒有使用色譜維度的信息。利用兩個基于CNN的深度學(xué)習(xí)模型(一個通過二分類的方式進行定性，另一個通過回歸預(yù)測的方式進行定量)，不需要構(gòu)建色譜峰，也沒有提取色譜峰相關(guān)的特征，從而減小復(fù)雜流程中存在的誤差，不受色譜相關(guān)因素的影響。本研究在公開數(shù)據(jù)集上進行了實驗，與FIGS對比表明，本文的模型能夠提高定性的準(zhǔn)確度，經(jīng)過cv過濾后，絕對中位差指標(biāo)與FIGS相當(dāng)?shù)耐瑫r，能夠顯著提高肽段定量的數(shù)量，比FIGS提高了約19%，可以有效地對肽段進行定性和定量。

本研究目前在公開數(shù)據(jù)集上進行了實驗，結(jié)果表明了方法的有效性，但沒有在更廣泛的數(shù)據(jù)集上進行實驗，因此本研究存在一定的局限性，需要對模型的泛化能力進一步測試研究。

在未來的工作中，課題組將進一步提高深度學(xué)習(xí)定性和定量模型的準(zhǔn)確度，同時擴展模型的適用性場景，解決更廣泛的蛋白質(zhì)組定性和定量問題。