彭勃，侯莎，周其洋，童星*

(1.廣東海天創(chuàng)新技術(shù)有限公司，廣東 佛山 528000；2.佛山市海天(高明)調(diào)味食品有限公司,廣東 佛山 528511；3.廣東省調(diào)味食品生物發(fā)酵先進(jìn)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 佛山 528000)

醬油是人們?nèi)粘Ｉ钪袘?yīng)用最廣泛的發(fā)酵調(diào)味品之一，在生活水平不斷提高的過程中，人們對醬油的品質(zhì)需求也日益提高。醬油的種類較多且制作工藝比較復(fù)雜，主要涉及制曲、鹽水發(fā)酵、壓榨或提取以及殺菌等階段[1]。在傳統(tǒng)醬油的生產(chǎn)過程中，主要生產(chǎn)的菌株是米曲霉，而乳酸菌等其他菌株基本上來自制曲、發(fā)酵器皿或空氣。在制曲階段，部分乳酸菌能夠與曲霉共同繁殖，而進(jìn)入鹽水發(fā)酵階段，高鹽體系抑制了大部分乳酸菌的生長，在此階段能夠繼續(xù)繁殖并發(fā)揮功能的乳酸菌，無論是自然條件下引入還是人為添加，都必須具有能夠在高滲透壓下生長繁殖的特點(diǎn)。受技術(shù)水平的限制，自古以來醬油中的乳酸菌一直處于自然繁殖狀態(tài)，隨著研究的不斷深入，如今醬油中乳酸菌的使用已經(jīng)越來越具有功能性和精確性。

1 醬油發(fā)酵中主要的乳酸菌種類

1.1 嗜鹽四聯(lián)球菌

1907年首次報(bào)道了在發(fā)酵醬油醪中存在一些形成四分體的球菌，經(jīng)過對四分體形成球菌的一系列研究，1958年將一組嗜鹽乳酸球菌定為新種——醬油片球菌[2]，它很快被重新分類為嗜鹽片球菌并在《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》中以此名稱被引用；1990 年，該物種被轉(zhuǎn)移到一個(gè)新屬并命名為嗜鹽四聯(lián)球菌(Tetragenococcushalophilusi)[3]。

嗜鹽四聯(lián)球菌一直以來被認(rèn)為是醬醪的優(yōu)勢種之一，在醬油制作過程中加入嗜鹽四聯(lián)球菌具有提升醬油風(fēng)味、改善醬油品質(zhì)的功能。根據(jù)醬油中微生物菌落種群研究發(fā)現(xiàn)，醬油發(fā)酵至第2周時(shí)就能夠檢測到嗜鹽四聯(lián)球菌，而在發(fā)酵后期的醬醪中含量較少[4-5]。從醬醪中分離得到的嗜鹽四聯(lián)球菌耐鹽性很強(qiáng)，能夠在18%的高鹽環(huán)境下產(chǎn)生乳酸，通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序和分析發(fā)現(xiàn)嗜鹽四聯(lián)球菌的ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)與其耐鹽性呈正相關(guān)[6]。

1.2 魏斯氏菌

魏斯氏菌(Weissella)屬于耐鹽型乳酸菌的一種，在發(fā)酵食品中用途廣泛，最早被分類為副腸系膜明串珠菌(Leuconostocparamesenteroides)，1993 年分類修改為魏斯氏菌。該類菌株的環(huán)境耐受力很強(qiáng)，可在20 g/dL鹽分下生長，pH耐受范圍為3.0～9.5[7-8]。魏斯氏菌是參與醬油發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌屬，在細(xì)菌總數(shù)中占比可達(dá)80%，能夠?qū)⒃现械钠咸烟寝D(zhuǎn)化為乳酸，并產(chǎn)生特有的香氣，使其口感更柔和濃厚、色澤紅潤，對醬油的發(fā)酵效果和風(fēng)味具有顯著的貢獻(xiàn)，其中融合魏斯氏菌(W.confusa)、類腸膜魏斯氏菌(W.paramesenteroides)和食竇魏斯氏菌(W.cibaria)是最具優(yōu)勢的3個(gè)菌種[9]。

研究顯示，從醬油中分離出的類腸膜魏斯氏菌能夠分泌耐高鹽的蛋白酶，食竇魏斯氏菌能夠在高鹽且pH較低的環(huán)境中產(chǎn)生較大量的富馬酸，因此魏斯氏菌十分具有提高醬油中氨基酸含量以及有機(jī)酸豐富度的潛力。此外，部分魏斯氏菌還能對白色念珠菌等致病菌起到一定的抑制作用，是醬油中的一類功能型微生物[10]。

1.3 其他種類

醬油發(fā)酵過程中還存在其他乳酸菌，例如：片球菌屬(Pediococcus)在醬油乳酸菌中占有較大比重，主要包括乳酸片球菌(P.acidilactici) 和戊糖片球菌(P.pentosaceus)，其耐鹽性較好且在發(fā)酵前期還參與有機(jī)酸及氨基酸代謝[11]；乳桿菌屬(Lactobacillus)在自然界中分布廣泛，包括多個(gè)種，在制曲階段適量生長能夠抑制有害物質(zhì)的產(chǎn)生，其中發(fā)酵乳桿菌(L.fermentum)等在醬醪中可成為優(yōu)勢菌種[12]，但大多數(shù)乳桿菌的耐鹽性較低，在醬醪中占比較小，從發(fā)酵起始階段含量逐漸降低。乳球菌屬(Lactococcus)是1985年Schleifer等提議設(shè)立的一個(gè)新菌屬[13]，也少量存在于醬油醪中，部分乳酸乳球菌(L.lactis)及其亞種能產(chǎn)生乳鏈菌肽，在食品中具有天然的抑菌功能[14]。

2 醬油發(fā)酵中乳酸菌的功能

2.1 制曲過程中的功能

制曲是傳統(tǒng)發(fā)酵制品如醬油、豆豉等的關(guān)鍵工序，傳統(tǒng)醬油采用米曲霉制曲，米曲霉在原料中生長繁殖，形成豐富的酶系，包括中性蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶等[15]。在傳統(tǒng)醬油半開放的生產(chǎn)過程中，實(shí)際參與到制曲過程中與米曲霉共同完成降解、轉(zhuǎn)化及代謝過程的微生物種類較多。制曲階段的乳酸菌通常以非耐鹽性乳酸菌為主，但目前為止對于曲料中乳酸菌作用的研究相對較少。

鐘方權(quán)等[16]從醬油中篩選到一株非耐鹽乳酸菌耐久腸球菌(Enterococusdurans)，能夠顯著影響曲料中酶系的豐富度和酶活力，并確定了其最佳接種比例為米曲霉接種量0.4%、乳酸菌接種量1.0%。米曲霉和乳酸菌的共同使用可顯著提高小麥曲料的中性、酸性蛋白酶活力，提高全氮、氨基酸態(tài)氮和谷氨酸含量，能夠有效增強(qiáng)醬油的鮮味[17]。孫莉等[18]在醬油制曲時(shí)加入非耐鹽的融合魏斯氏菌，使醬油中的酚類物質(zhì)顯著增加，提高了抗氧化活性，同時(shí)增加了風(fēng)味物質(zhì)和氨基酸含量，顯著改善了醬油的風(fēng)味。

除了直接提升醬油的品質(zhì)外，制曲過程中使用乳酸菌還能夠抑制曲料中雜菌的繁殖，或減少有害物質(zhì)的含量。在日本醬油生產(chǎn)過程中，常用溫度控制法提高制曲前期的乳酸菌生長活性，生成少量乳酸，抑制其他雜菌的生長，再逐漸升高溫度，使乳酸菌不至于過度消耗營養(yǎng)物質(zhì)而影響曲霉的生長。大豆在制曲過程中有污染黃曲霉毒素風(fēng)險(xiǎn)，將嗜酸乳桿菌(L.acidophilus)、植物乳桿菌(L.plantarum)和保加利亞乳桿菌(L.bulgaricus)的菌體和代謝產(chǎn)物作用于曲料中，能夠顯著抑制黃曲霉毒素的產(chǎn)生，同時(shí)不影響米曲霉的生長[19-20]。

2.2 與酵母菌發(fā)酵的相互促進(jìn)作用

當(dāng)醬油進(jìn)入鹽水發(fā)酵階段，米曲霉逐漸死亡，耐鹽的乳酸菌、酵母菌等愈發(fā)活躍，發(fā)揮其各自的作用，這些微生物的演替、代謝與醬油的風(fēng)味特征和產(chǎn)量密切相關(guān)[21]。醬油中的乳酸菌經(jīng)過長時(shí)間的馴化都屬于耐鹽或嗜鹽性菌種，但往往耐酸性不強(qiáng)，在鹽水發(fā)酵過程中，乳酸菌通過產(chǎn)生乳酸使pH值降至5.0以下后，自身無法繼續(xù)生長，而醬油中發(fā)揮主要作用的魯氏酵母(Saccharomycesrouxii)則適宜在pH 5.5以下生長。此外，在發(fā)酵初期乳酸菌的代謝活動可以促進(jìn)原料水解，產(chǎn)生更多的還原糖，也為酵母的快速生長提供了有利條件[22]。由此，醬油釀造過程中加入耐鹽乳酸菌能夠在一定程度上促進(jìn)酵母菌的發(fā)酵效果，從而間接改善醬油的發(fā)酵效果。

劉卓[23]研究證明，在高鹽稀態(tài)醬油中，耐鹽乳酸菌與球擬酵母(Torulopsis)能夠協(xié)同作用，改善風(fēng)味，而對其主要指標(biāo)的影響較小，可明顯增加乳酸等有機(jī)酸的含量，同時(shí)提升了酯類及4-EG (4-乙基愈創(chuàng)木酚)、HDMF(4-羥基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮)等風(fēng)味物質(zhì)的含量。此外有研究顯示，嗜鹽四聯(lián)球菌和耐鹽酵母菌共同作用能夠使醬油風(fēng)味物質(zhì)含量提高116.88%[24]。在鹽分只有12%的減鹽醬油中，復(fù)合使用乳酸菌、酵母菌，檢測到其關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)乙醇、2-甲基-1-丙醇、HDMF和 3-羥基-2-甲基-4H-吡喃-4-酮的含量顯著提高[25]。

然而，醬醪中兩類微生物的相互促進(jìn)作用在實(shí)際生產(chǎn)中更加復(fù)雜，乳酸菌和酵母菌之間不一定始終處于平衡狀態(tài)，也會因形成抑制作用而破裂。醬醪中的氮源有限，微生物對營養(yǎng)資源的利用屬于競爭關(guān)系，只有找到最合適的使用方法，才能促進(jìn)互補(bǔ)關(guān)系的建立。日本的研究人員認(rèn)為，為使乳酸菌正常發(fā)揮作用，酵母菌的接種量應(yīng)為105CFU/g，乳酸菌與酵母菌之比應(yīng)在100∶1～1000∶1范圍內(nèi)，并且醬醪中乳酸菌數(shù)達(dá)到107CFU/g再引入酵母菌，否則酵母將威脅乳酸菌的生長和代謝[26]。

2.3 改善有機(jī)酸結(jié)構(gòu)

能夠在醬油發(fā)酵過程中生長繁殖的耐鹽乳酸菌通常產(chǎn)酸能力較弱，耐酸性低，不會因?yàn)檫^度產(chǎn)酸而過度降低醬油的pH值，不會引起醬醪中的中性蛋白酶活性降低，從而影響醬油的品質(zhì)。這類菌株能夠利用糖產(chǎn)生適宜濃度的乳酸，提供柔和的酸味，對咸味起到中和作用，使醬油的口感更加溫和，同時(shí)，乳酸與醬油中的醇類反應(yīng)生成乳酸乙酯等酯類，也會成為香氣物質(zhì)的重要組成。據(jù)報(bào)道，當(dāng)醬油中乳酸的含量處于0.15 g/dL左右時(shí)，其具有較好的口感，而當(dāng)乳酸含量低于0.05 g/dL時(shí)，其口感明顯變差[27]。

以醬醪中存在最廣泛的嗜鹽四聯(lián)球菌為例，通常條件下，嗜鹽四聯(lián)球菌消耗1 mol葡萄糖會形成近2 mol的L-乳酸，少數(shù)菌株能形成正乳酸，而產(chǎn)生的乙酸量較少，乙酸與乳酸的比例因菌株而異，大多數(shù)嗜鹽四聯(lián)球菌也可以將檸檬酸轉(zhuǎn)化為乳酸和乙酸，這些檸檬酸來自于原料成曲霉[28]，多種類型有機(jī)酸的形成更加豐富了醬油的風(fēng)味。胡傳旺等從發(fā)酵醬醪中篩選了多株耐鹽乳酸菌，各菌株均能夠代謝產(chǎn)生除乳酸以外的其他有機(jī)酸，其中兩株片球菌屬均能產(chǎn)生豐富的乙酸、檸檬酸和富馬酸；一株食竇魏斯氏菌能產(chǎn)生乙酸和較多的丙酮酸。

2.4 提供特有的風(fēng)味物質(zhì)

醬油良好的風(fēng)味來自于有機(jī)酸、氨基酸、醇類、酯類等物質(zhì)，而這些風(fēng)味物質(zhì)的形成與微生物代謝密切相關(guān)。醬油中的乳酸菌對各種氨基酸具有脫碳作用，可能使醬油中的氨基酸組成發(fā)生變化，呈味物質(zhì)減少，但在一些情況下也可以根據(jù)需要利用乳酸菌改善氨基酸結(jié)構(gòu)。部分乳酸菌能夠?qū)⑵渌被徂D(zhuǎn)化為具有甜味的丙氨酸，從而提升醬油的風(fēng)味[29]；日本研究者在醬油制作過程中使用四聯(lián)球菌，最終增加了醬油的風(fēng)味物質(zhì)并且提高了醬油中游離氨基酸的含量[30]。

醬油中的乳酸菌自身也會產(chǎn)生具有香氣的揮發(fā)性物質(zhì)。Lee等[31]研究發(fā)現(xiàn)，在醬油中接種嗜鹽四聯(lián)球菌后，主要揮發(fā)性化合物為乙酸、甲酸、苯甲醛、2-羥基丙酸乙酯、3-(甲硫基)-丙酸、環(huán)丁烯和香草醛。相比之下，接種魯氏酵母的醬油中主要揮發(fā)性化合物為乙醇、HDMF、丙酸乙酯、3-甲基-2-丁醇、1-丁醇、2-苯基乙醇和2-甲基丙酸乙酯。由此可以發(fā)現(xiàn)，嗜鹽四聯(lián)球菌處理后產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)主要為酸性化合物，而酵母菌產(chǎn)生的揮發(fā)性化合物包括支鏈或芳香雜醇、醛類和酯類化合物，這一結(jié)論充分支持了酵母和乳酸菌具有不同代謝途徑的觀點(diǎn)，表明在醬油中乳酸菌自身也能夠產(chǎn)生其獨(dú)特的揮發(fā)性成分，從而影響醬油的感官品質(zhì)。戚晨晨等[32]研究發(fā)現(xiàn)，添加耐鹽乳酸菌能夠使醬油風(fēng)味物質(zhì)4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、苯乙醇和乙酸乙酯等揮發(fā)物含量提高，同時(shí)提高了醬油中無鹽固形物含量的。此外，本公司前期研究中在醬醪中篩選出了一株能夠增加4-乙烯基愈創(chuàng)木酚含量的嗜鹽四聯(lián)球菌，對醬油的香氣產(chǎn)生正面影響[33]。

2.5 減少有害物質(zhì)的產(chǎn)生

氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate, EC)是曾在醬油等多種發(fā)酵類食品中產(chǎn)生的有害物質(zhì)，食用后有致癌的風(fēng)險(xiǎn)，雖然醬油中該物質(zhì)的形成途徑尚不完全清晰，但其前體物質(zhì)乙醇、瓜氨酸和精氨酸等與微生物的活動有關(guān)[34]。部分乳酸菌能夠減少醬油中EC的前體物質(zhì)，對于控制或減少EC的產(chǎn)生、提高發(fā)酵類調(diào)味品的安全性意義重大。楊希飛[35]開發(fā)了一株嗜鹽四聯(lián)球菌，能夠顯著降低醬油中EC的含量，且對主要理化指標(biāo)沒有影響，最適添加量為106CFU/mL，EC含量降低了53.9%。廖淡宜等[36]從醬醪中篩選出一株嗜鹽四聯(lián)球菌株，能夠消耗EC前體物質(zhì)瓜氨酸和精氨酸，并將其轉(zhuǎn)化為具有優(yōu)質(zhì)風(fēng)味的鳥氨酸。

生物胺作為一類低分子量的活性生物堿，存在于多種發(fā)酵食品中，醬油在發(fā)酵過程中也存在形成生物胺的風(fēng)險(xiǎn)[37]。明串珠菌屬、短乳桿菌等乳酸菌都具有氨基脫羧酶活性，與生物胺的產(chǎn)生密切相關(guān)，然而一些乳酸菌能夠降低發(fā)酵食品中生物胺的生成。有文獻(xiàn)報(bào)道，部分嗜鹽四聯(lián)球菌添加至醬醪中能夠降低醬油中有害物質(zhì)組胺的形成[38]，楊明泉等[39]從醬醪中篩選得到一株嗜鹽片球菌，在發(fā)酵初期使用能夠顯著減少55.21%最終產(chǎn)品的總生物胺含量。

2.6 其他功能

近年來，關(guān)于醬油發(fā)酵過程中乳酸菌作用的研究逐漸豐富，除了以上幾種主要功能外也有其他發(fā)現(xiàn)。

醬油成品在貨架期過程中產(chǎn)生二次沉淀是一大難題，目前國內(nèi)已對國產(chǎn)醬油二次沉淀成分、形成機(jī)制和去除技術(shù)進(jìn)行了初步研究。楊明泉等篩選得到的嗜鹽片球菌在減少生物胺含量的同時(shí)也推遲了醬油二次沉淀出現(xiàn)時(shí)間，減少了其89.12%的生成量，顯著改善了醬油的外觀品質(zhì)?；瑲g歡等[40]通過篩選得到的一株乳酸菌也能明顯降低醬油二次沉淀的產(chǎn)生，沉淀量僅為對照樣的10%。

醬油呈紅褐色是氨基酸與糖類發(fā)生褐變反應(yīng)造成的，一些醬油中乳酸菌菌株能夠顯著降低其生長環(huán)境的氧化還原電位，在醬醪中部分抑制了褐變。這類乳酸菌的還原活性來源尚不清楚，但能在褐變反應(yīng)中還原一部分類醌類中間體，使醬油的色澤更加柔和[41]。

還有一些乳酸菌能夠提高醬油的營養(yǎng)價(jià)值，例如在食品發(fā)酵過程中，魏斯氏菌可將原料分解轉(zhuǎn)化，生成短鏈脂肪酸和胞外多糖，使醬油更富有營養(yǎng)價(jià)值[42]。

3 展望

乳酸菌雖不是醬油的主要生產(chǎn)菌株，但其功能卻不容忽視。隨著人們對醬油中乳酸菌研究的不斷深入，已經(jīng)有越來越多的研究者和生產(chǎn)廠家嘗試在醬油發(fā)酵過程中添加乳酸菌，提升具有特殊功能的乳酸菌的生長優(yōu)勢，從而起到改善風(fēng)味、提高發(fā)酵效率、抑制雜菌等作用。日本醬油在生產(chǎn)過程中大多已將乳酸菌的菌種和添加量作為關(guān)鍵控制因素，但是到目前為止，國內(nèi)對于醬油中乳酸菌的認(rèn)識更多停留在理論層面，在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用仍然較少。醬油發(fā)酵過程較為復(fù)雜、環(huán)境開放，若要使具有特定功能的乳酸菌菌株發(fā)揮應(yīng)有的作用則必須改善其發(fā)酵條件，對整個(gè)發(fā)酵過程精準(zhǔn)調(diào)控。本文對醬油中主要乳酸菌菌種類型及其功能進(jìn)行了綜述，期望能為醬油乳酸菌的功能應(yīng)用提供基礎(chǔ)，為乳酸菌最大程度地發(fā)揮功能作用、改善國內(nèi)醬油的生產(chǎn)工藝和產(chǎn)品品質(zhì)提供參考。