李朔，李瀟，張曉黎，賈瑤，吳興壯*

(1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，沈陽(yáng) 110866；2.遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 食品與加工研究所，沈陽(yáng) 110161)

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)是一種重要的非蛋白氨基酸，具備多種用途。研究表明，GABA不僅在農(nóng)業(yè)中被用于調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)、發(fā)育和應(yīng)激反應(yīng)，還在化學(xué)工業(yè)中作為前體物質(zhì)用于合成可生物降解尼龍[1]。同時(shí)，作為哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，GABA對(duì)健康的益處已被充分證實(shí)，其在治療高血壓、緩解壓力和預(yù)防糖尿病等方面起到了良好的治療效果。鑒于GABA在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域具有重要用途，我國(guó)衛(wèi)生部于2009年正式批準(zhǔn)GABA為新資源食品的生產(chǎn)原料。近年來(lái)，人們將其作為生物活性因子，已開(kāi)發(fā)出富含GABA的醬油、豆豉、食醋、豆醬、海鮮調(diào)味料等調(diào)味品以及發(fā)酵腌制品和奶制品[2]。然而，GABA在自然生物中濃度很低且不易提取，因此，為了實(shí)現(xiàn)GABA的有益功能，GABA的高效合成受到了極大關(guān)注。

谷氨酸脫羧酶(GAD)是生物體催化谷氨酸或鈉鹽經(jīng)過(guò)脫羧生成GABA的唯一關(guān)鍵酶。乳酸菌(LAB)作為一種公認(rèn)安全的細(xì)菌被廣泛應(yīng)用于食醋、腐乳、泡菜等食品生產(chǎn)中[3]，已有許多科學(xué)研究證實(shí)，乳酸菌存在谷氨酸脫羧酶活性，能夠催化谷氨酸脫羧生成GABA。目前，GABA主要通過(guò)生物合成法來(lái)生產(chǎn)，如在生物轉(zhuǎn)化方法中使用分離的GAD或在微生物直接發(fā)酵法中利用具有GAD活性的各種微生物菌株，這是因?yàn)樵摲ň哂蟹磻?yīng)程序簡(jiǎn)單、催化效率高、反應(yīng)條件溫和以及環(huán)境兼容性等優(yōu)點(diǎn)[4]。因此，通過(guò)利用食品安全級(jí)乳酸菌生物合成達(dá)到更高GABA生產(chǎn)目標(biāo)、開(kāi)發(fā)更多富含GABA種類的功能性食品正在吸引著世界各地的科學(xué)工作者。

1 γ-氨基丁酸的生理作用

GABA作為哺乳動(dòng)物的一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，起到分子信號(hào)的作用，并具有許多生理功能?？茖W(xué)研究已經(jīng)證實(shí)，GABA不但有降低神經(jīng)元活力、避免神經(jīng)細(xì)胞過(guò)熱、降血壓的功效，還可作為肝、腎和腸道的保護(hù)劑以及預(yù)防毒素引起的損傷，同時(shí)GABA對(duì)癲癇發(fā)作、驚厥、帕金森病等多種精神疾病都有一定的治療效果[5]。雖然GABA有多種生理功能，但由于人們壓力的增加和年紀(jì)的增長(zhǎng)，身體中的GABA含量也日益減少。因此，在飲食中補(bǔ)充GABA對(duì)人體保健具有很重要的意義。

GABA對(duì)生物體的影響主要通過(guò)其與相應(yīng)的受體融合而產(chǎn)生。

GABA受體一般有3類：(1)GABAA受體主要分布在神經(jīng)元細(xì)胞膜上，且具有高度敏感性。其被激活后使得突觸后電位發(fā)揮作用，抑制神經(jīng)元的興奮，保持大腦自我調(diào)節(jié)。因此，調(diào)節(jié)不平衡也可引起精神疾病、創(chuàng)傷后應(yīng)激功能障礙 (PTSD) 綜合征、癲癇等病癥，此外，與女性生殖周期及相關(guān)抑郁癥發(fā)作也有著密切的關(guān)系[6]。(2)GABAB受體主要產(chǎn)生在神經(jīng)元的突觸前、后部位，且在非突觸部位也有其存在。其受體被激活后，通過(guò)突觸后膜使得K+形成輸出電導(dǎo)，從而形成長(zhǎng)抑制性突觸后電位，相反，突觸前膜則抑制鈣離子電導(dǎo)，使興奮性或抑制性遞質(zhì)的釋放量降低，另外，該受體被激活后還與消化系統(tǒng)功能調(diào)節(jié)等許多作用有關(guān)[7]。(3)GABAC受體和GABAA受體相似，主要存在于視網(wǎng)膜雙極細(xì)胞中，另外也有研究表明，其在視網(wǎng)膜中視桿通路的信息傳導(dǎo)與調(diào)控中起重要作用[8]。

2 生產(chǎn)GABA乳酸菌的種類

乳酸菌是各種食品原料發(fā)酵過(guò)程中最重要的微生物之一，乳酸則是在發(fā)酵過(guò)程中形成的主要代謝產(chǎn)物之一，影響乳酸菌的生理活動(dòng)。許多原料或食品中都含有大量的谷氨酸，乳酸菌則可以利用谷氨酸來(lái)提高其對(duì)酸性條件的耐受性，這是因?yàn)樵谒嵝詶l件下，一些乳酸菌啟動(dòng)了不同的耐酸系統(tǒng)來(lái)維持細(xì)胞活力，如生產(chǎn)GABA則是利用了其體內(nèi)的GAD抗酸系統(tǒng)[9]。GAD是一種依賴5′-磷酸吡哆醛(PLP)的細(xì)胞內(nèi)酶，其催化谷氨酸向GABA的轉(zhuǎn)化，需要通過(guò)與H+結(jié)合將底物脫羧成中性化合物GABA，進(jìn)而保護(hù)乳酸菌不受酸脅迫的傷害[10]。目前，許多生產(chǎn)GABA的乳酸菌已從廣泛的發(fā)酵食品中分離出來(lái)，包括奶酪、酸奶、酸菜、泡菜、發(fā)酵香腸以及各種發(fā)酵魚(yú)制品[11]。生產(chǎn)GABA乳酸菌的起始菌株是影響GABA生產(chǎn)的最主要原因，具備合成GABA能力的乳酸菌較多，乳酸桿菌屬也被列為生產(chǎn)GABA的最主要種類，包括短乳桿菌、副干酪乳桿菌、保加利亞乳桿菌、布氏乳桿菌、植物乳桿菌、瑞士乳桿菌等，而在這些具備產(chǎn)GABA能力的乳酸菌株中，異型發(fā)酵的短乳桿菌是目前研究最佳的菌株，在適當(dāng)條件下可生產(chǎn)大量的GABA[12]。

表1 不同乳酸菌的發(fā)酵特性

3 提高GAD活性和GABA產(chǎn)量方法

3.1 通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基及發(fā)酵條件提高GABA生物合成產(chǎn)量

菌株間生成GABA的能力差異較大，同時(shí)菌株也受到碳氮源、底物濃度、起始pH值、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間和輔酶因子等因素的影響。因此，通過(guò)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件可以提高菌株生產(chǎn)GABA的效率。周青[20]的研究表明，在優(yōu)化碳氮源及添加量的條件下，植物乳桿菌WZ011能產(chǎn)生1.261 g/L的GABA。谷氨酸鈉(MSG)或L-谷氨酸是使用純化酶或產(chǎn)GABA能力的菌株來(lái)生產(chǎn)GABA的主要合成底物，其濃度能夠控制GAD的活性，進(jìn)而影響GABA的產(chǎn)量[21]，添加0.5%的MSG增加了屎腸球菌JK29的GABA產(chǎn)量，培養(yǎng)48 h后達(dá)到14.9 mmol/L。當(dāng)L-谷氨酸以10～20 g/L的濃度添加到嗜熱鏈球菌的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中時(shí)，不能有效增加GABA的產(chǎn)量，表明該菌株不能耐受高濃度的L-谷氨酸，這是因?yàn)楦邼舛鹊牡孜飼?huì)增加細(xì)胞滲透壓，干擾細(xì)菌代謝，影響GAD的活性[22]。因此，增加底物濃度的策略不能用于全部菌株。因?yàn)镻LP是GAD必需的輔酶，所以產(chǎn)生GAD活性的乳酸菌還必須在培養(yǎng)基中添加PLP以增加GABA的產(chǎn)量，Komatsuzaki等[23]研究證實(shí)，將PLP添加到初始培養(yǎng)基中可以極大地促進(jìn)副干酪乳桿菌的GABA生成。但是Yang等[24]研究表明，在初始發(fā)酵時(shí)加入PLP無(wú)法有效地提高唾液鏈球菌嗜熱亞種GABA的產(chǎn)生，然而在發(fā)酵進(jìn)行48 h后，添加PLP在提高GABA生產(chǎn)方面卻表現(xiàn)出了有效的功能，推測(cè)這或許是游離PLP在培養(yǎng)過(guò)程中很容易變性，失去了作為GAD輔酶的作用，因此補(bǔ)充PLP可以部分恢復(fù)GAD活性，增加GABA產(chǎn)量。發(fā)酵時(shí)間和溫度也是影響菌株生產(chǎn)GABA的關(guān)鍵因素，溫度過(guò)低或過(guò)高都會(huì)抑制菌株的生長(zhǎng)速度和產(chǎn)GABA能力，一般來(lái)說(shuō)，在25～45 ℃范圍內(nèi)，菌株產(chǎn)生GABA的含量最高[25]。Villegas等[26]通過(guò)短乳桿菌CRL1942研究了GABA的形成，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在30 ℃條件下使用270 mmol/L的MSG發(fā)酵48 h,MRS培養(yǎng)基中GABA的最大產(chǎn)量為255 mmol/L，表明GABA的產(chǎn)生有時(shí)間依賴性。這是因?yàn)橛蒑SG向GABA轉(zhuǎn)化需要菌株生長(zhǎng)，產(chǎn)生較高的細(xì)胞密度和合適的培養(yǎng)溫度[27]，另外，乳酸菌在發(fā)酵過(guò)程中會(huì)形成乳酸，導(dǎo)致發(fā)酵液pH下降，當(dāng)發(fā)酵液pH降至GAD活性范圍時(shí)，培養(yǎng)基中GABA才開(kāi)始出現(xiàn)。微生物中GAD的活性主要由pH值調(diào)節(jié)，pH值的升高或降低會(huì)造成GAD活性部分失活，從而影響GABA產(chǎn)量，由于各菌株GAD生化特性有所不同，所以不同菌株之間的GAD活性最佳pH值也不相同，總體來(lái)說(shuō)，GAD的最適pH值為4.0～5.0[28]。例如，pH為5.0時(shí)，布氏乳桿菌產(chǎn)生最多的GABA，產(chǎn)量達(dá)251 mmol/L；pH為6.5時(shí)，植物乳桿菌IFK10產(chǎn)GABA最多，達(dá)2.68 g/L。

3.2 采用補(bǔ)料分批發(fā)酵技術(shù)提高GABA生物合成產(chǎn)量

各菌株產(chǎn)生GABA的能力差異很大，一些產(chǎn)生GABA的菌株在大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)GABA方面顯示出巨大的潛力。由于發(fā)酵的主要目的是成本效益以及提高生產(chǎn)生物產(chǎn)品的效率，所以選擇適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵工藝來(lái)提高目標(biāo)產(chǎn)品的產(chǎn)量非常重要。在分批發(fā)酵時(shí)，底物通常在發(fā)酵罐中只放置1次，產(chǎn)生的主要問(wèn)題是較高的發(fā)酵底物初始濃度會(huì)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，而較低的底物濃度則無(wú)法適應(yīng)高生產(chǎn)的要求[29]，然而補(bǔ)料分批培養(yǎng)能夠克服這一問(wèn)題，已廣泛應(yīng)用于各種生物制品的生產(chǎn)中，在補(bǔ)料分批培養(yǎng)過(guò)程中，可選用不抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的適宜的初始底物濃度，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，一個(gè)或多個(gè)營(yíng)養(yǎng)成分被供應(yīng)到發(fā)酵罐中，產(chǎn)物則留在發(fā)酵罐中直到發(fā)酵結(jié)束，這種方法可以獲得高產(chǎn)量的目標(biāo)產(chǎn)物。Li等[30]設(shè)計(jì)了一種簡(jiǎn)單的分批補(bǔ)料發(fā)酵方法，當(dāng)菌株生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，在溫度32 ℃、攪拌速度100 r/min、pH 5.0、發(fā)酵時(shí)間48 h的條件下進(jìn)行補(bǔ)料發(fā)酵，且在12 h和24 h分別向發(fā)酵罐中加入280.70 g和224.56 g的谷氨酸，結(jié)果顯示，48 h 后GABA濃度達(dá)到(1005.81±47.88)mmol/L。由于GAD主要在酸性條件下具有活性且發(fā)酵液pH值會(huì)隨著時(shí)間的變化而變化，所以應(yīng)及時(shí)調(diào)整pH值，使菌株在最適宜pH值下生產(chǎn)GABA。李勝男[31]通過(guò)恒定pH分批補(bǔ)料發(fā)酵建立了高效合成GABA的發(fā)酵工藝體系，在恒定pH 5.0條件下，GABA的產(chǎn)量由不控制pH的30.34 g/L增加到44.73 g/L，增長(zhǎng)了47.43%，且發(fā)酵后期的培養(yǎng)液中仍保持著較高的細(xì)胞濃度，另外發(fā)現(xiàn)與未控制pH相比，發(fā)酵液中的葡萄糖以及底物幾乎被耗盡，表明恒定pH分批補(bǔ)料發(fā)酵有利于提高GAD的活性，進(jìn)一步提高GABA的產(chǎn)量。

3.3 復(fù)合菌培養(yǎng)提高GABA生物合成產(chǎn)量

復(fù)合菌培養(yǎng)旨在提高GABA的產(chǎn)量。不同菌株可以相互利用各自的發(fā)酵特性，克服單一菌株發(fā)酵的缺點(diǎn)，已在食品、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥等行業(yè)中得到廣泛應(yīng)用[32]。Kim等[33]將產(chǎn)GABA的短乳桿菌GABA 100與不產(chǎn)GABA的雙歧桿菌BGN4復(fù)合培養(yǎng)發(fā)酵天麻，培養(yǎng)過(guò)程中觀察到的GABA產(chǎn)量高于只接種短乳桿菌GABA 100，在報(bào)道中，并未闡明復(fù)合培養(yǎng)對(duì)GABA產(chǎn)生影響的確切機(jī)制，推測(cè)雙歧桿菌BGN4在復(fù)合培養(yǎng)過(guò)程中降低pH值的幅度大于短乳桿菌GABA 100單獨(dú)培養(yǎng)，從而導(dǎo)致GABA產(chǎn)量增加。張恕銘等[34]通過(guò)植物乳桿菌BC112與屎腸球菌AB157復(fù)合培養(yǎng)并優(yōu)化試驗(yàn)條件提高了GABA產(chǎn)量。Kwon等[35]以水芹菜為主要原料，采用腸膜明串珠菌與植物乳桿菌復(fù)合發(fā)酵，并通過(guò)優(yōu)化增加了水芹中GABA的含量，成功生產(chǎn)了這種同時(shí)富含葡聚糖和GABA的新型功能性水芹。

另外，微生物復(fù)合培養(yǎng)技術(shù)不僅有利于食品生產(chǎn)，而且有利于人類健康，這是因?yàn)閯?dòng)物腸道內(nèi)存在大量的微生物，不同的微生物通過(guò)合作執(zhí)行重要的生物學(xué)功能。然而，人們對(duì)復(fù)合培養(yǎng)機(jī)制的了解很少。因此，不同微生物復(fù)合培養(yǎng)的機(jī)理有待探索，研究結(jié)果可推廣到工業(yè)應(yīng)用和改善人類健康方面。

3.4 實(shí)施現(xiàn)代生物技術(shù)提高GABA生物合成產(chǎn)量

研究表明，GABA是利用生物體內(nèi)的谷氨酸脫羧酶作為催化劑對(duì)谷氨酸進(jìn)行脫羧反應(yīng)而產(chǎn)生的，許多細(xì)菌的GAD在pH為4.0～5.0時(shí)表現(xiàn)出最優(yōu)活性，而在近中性pH時(shí)，活性急劇下降。在大多數(shù)情況下，直接發(fā)酵法的GABA產(chǎn)量相對(duì)較低，前期的研究者主要通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件來(lái)提高GABA含量，因此，GABA的生物合成通過(guò)基因工程、代謝工程以及純化或固定化GAD等生物技術(shù)的研究越來(lái)越受到人們的關(guān)注[36]。

不同來(lái)源的乳酸菌的GAD基因已在不同宿主中過(guò)度表達(dá)，包括大腸桿菌、谷氨酸棒桿菌以及枯草芽孢桿菌[37]，許多乳酸菌GABA合成的效率基本上取決于GadC和GadB的活性，而GadC和GadB的活性受到培養(yǎng)條件的極大影響。Tajabadi等[38]為了提高GABA的合成，將獲得的GAD基因克隆到pMG36e-LbGAD載體中，并且通過(guò)SDS-PAGE和GAD活性證實(shí)了在植物乳桿菌Taj-Apis362 細(xì)胞中進(jìn)行過(guò)度表達(dá)，與原始GAD活性相比，其酶活性提高了7倍，達(dá)到了53 kDa蛋白。Yang等[39]將基于大腸桿菌表達(dá)乳酸乳桿菌GadB基因的全細(xì)胞生物催化劑用于代謝途徑工程方法的起點(diǎn)：(1)通過(guò)向GadB中引入突變，使其脫羧活性向中性pH方向轉(zhuǎn)移，構(gòu)建了工程菌株；(2)通過(guò)修飾谷氨酸/GABA逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GadC，促進(jìn)中性pH下的轉(zhuǎn)運(yùn)；(3)通過(guò)過(guò)度表達(dá)GroESL分子伴侶，增強(qiáng)可溶性GadB的表達(dá)；(4)通過(guò)使大腸桿菌基因組中的gadA和gadB失活來(lái)抑制GABA的降解，最終該工程菌株每小時(shí)產(chǎn)GABA量為44.04 g/L。Liu等[40]開(kāi)發(fā)了一種乳酸鏈球菌發(fā)酵系統(tǒng)，可以同時(shí)生產(chǎn)乳酸鏈球菌肽(一種抗菌肽)和 GABA(一種抗氧化劑)，在此研究中通過(guò)表達(dá)谷氨酸脫羧酶和谷氨酸/GABA逆轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白代謝工程改造了乳酸鏈球菌素生產(chǎn)菌株L.lactisF44用于 GABA 生產(chǎn)，GABA 生物合成可以通過(guò)增強(qiáng)菌株的耐酸性來(lái)促進(jìn)乳酸鏈球菌素的產(chǎn)生，通過(guò)采用兩階段 pH 控制發(fā)酵策略，工程菌株GABA產(chǎn)量高達(dá)9.12 g/L，是恒定pH值發(fā)酵的2.2倍。

一些突變方法，如定向進(jìn)化和定點(diǎn)突變被認(rèn)為是優(yōu)化或改善GAD催化活性的有力工具，并應(yīng)用于全細(xì)胞生物催化。谷氨酸棒桿菌是谷氨酸的工業(yè)生產(chǎn)菌，且在中性pH值附近生長(zhǎng)最好，Shi等[41]為了在擴(kuò)大的pH范圍內(nèi)提高短乳桿菌Lb85的GAD活性，通過(guò)表達(dá)短乳桿菌Lb85 GadB變體獲得重組谷氨酸棒桿菌細(xì)胞，由于變體是通過(guò)結(jié)合GadB的定向進(jìn)化和位點(diǎn)特異性突變來(lái)構(gòu)建的，通過(guò)將這些GadB變體引入該生物體，在簡(jiǎn)單的葡萄糖基培養(yǎng)基上無(wú)需外源谷氨酸即可生產(chǎn)GABA，產(chǎn)量高達(dá)7.13 g/L，且該重組細(xì)胞在較高pH值范圍內(nèi)仍表現(xiàn)出較高的催化能力。GadC對(duì)底物運(yùn)輸具備嚴(yán)格的pH依賴性，在pH 6.5及以上時(shí)沒(méi)有可檢測(cè)到的運(yùn)輸活性，Shin等[42]利用誘變研究了植物乳桿菌GadC的C末端依賴pH的催化作用，通過(guò)截短C端區(qū)域Ile454-Thr468中的Δ3和Δ11變體，該酶在pH 5～7范圍內(nèi)增加了活性，其中Δ11變體明顯顯示出更好的結(jié)果，在pH值為5.0和7.0時(shí)，變體的催化效力分別提高了1.26倍和28.5倍，推測(cè)由于pH誘導(dǎo)的構(gòu)象變化，C端區(qū)域通過(guò)關(guān)閉催化位點(diǎn)，使得植物乳桿菌GAD的活性在較低或較高pH值下增加。Lyu等[43]將短乳桿菌GadC的C末端Δ14變體通過(guò)定向突變被截短，使得該變體在較高的中性pH值下表現(xiàn)出更好的活性。這些研究表明，在較高pH值下，GadC的C末端對(duì)于改善酶活性位點(diǎn)以及增加活性具有重要影響，因此GadC在波動(dòng)的pH條件下通過(guò)代謝途徑工程是產(chǎn)生GABA的重要途徑。

熱穩(wěn)定性不足是酶的常見(jiàn)問(wèn)題，大多數(shù)GAD即使在中等溫度下也表現(xiàn)出低穩(wěn)定性。改進(jìn)熱穩(wěn)定性的一個(gè)合理策略是通過(guò)序列比對(duì)來(lái)識(shí)別關(guān)鍵區(qū)域或氨基酸殘基，林玲等[44]從短乳桿菌中獲得GAD1407基因，并通過(guò)克隆在大腸桿菌中表達(dá)，然后將GAD1407的氨基酸序列與擬南芥的GAD1進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)影響GAD1407催化pH特性的關(guān)鍵位點(diǎn)S307，然后對(duì)這個(gè)關(guān)鍵位點(diǎn)進(jìn)行飽和突變和篩選，最后確定S307N擴(kuò)大了該酶催化的最佳pH范圍。另外，鑒定共有序列也可以提高蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性，Zhang等[45]對(duì)短乳桿菌CGMCC 1306 GAD的基因開(kāi)發(fā)了一種并行策略，通過(guò)比較這種嗜熱性GAD與同源嗜熱性酶的序列和結(jié)構(gòu)，確定影響穩(wěn)定性的氨基酸殘基并獲得了兩種突變酶，結(jié)果表明，兩種突變酶的半失活溫度分別比野生型高2.3 ℃和1.4 ℃，表現(xiàn)出較高的熱穩(wěn)定性，此外，在60 ℃孵育20 min期間，變體的活性增加了1.67倍。汪鐘[46]通過(guò)與嗜熱GAD進(jìn)行多序列比對(duì)，首先鑒定出了最有可能提高酶熱穩(wěn)定性的氨基酸殘基替換位點(diǎn)及類型，然后又計(jì)算了這些突變對(duì)蛋白質(zhì)自由能的影響，最后制定了最佳的酶分子改造方法，他推測(cè)這種方法是提高GAD熱穩(wěn)定性的有效工具。

研究表明，通過(guò)全細(xì)胞將谷氨酸生物催化為GABA有一些不足之處，這是因?yàn)镚ABA在中性環(huán)境下經(jīng)GABA轉(zhuǎn)氨酶(GABA-T)和琥珀酸半醛脫氫酶(SSADH)連續(xù)催化兩步反應(yīng)后轉(zhuǎn)變成琥珀酸,從而導(dǎo)致分解[47]。另外，全細(xì)胞生物催化需要加入一些緩沖液，使得發(fā)酵體系保持一定的酸性條件，這種化學(xué)緩沖液不利于后期GABA的純化。由于簡(jiǎn)化了從不太復(fù)雜的反應(yīng)混合物中對(duì)該化合物的下游純化，因此在生產(chǎn)純GABA時(shí)，使用純化或固定化技術(shù)似乎比全細(xì)胞生物催化更經(jīng)濟(jì)可行。研究表明，許多固定化技術(shù)已應(yīng)用于生物催化劑的重復(fù)使用，例如將GadB固定在海藻酸鈣中，然后將其用于生物反應(yīng)器，將GAD/纖維素融合蛋白固定在纖維素上以及將GAD固定在卡拉膠上[48]。Lin等[49]在補(bǔ)料分批反應(yīng)器中對(duì)固定化GAD的性能進(jìn)行了評(píng)估，結(jié)果表明，當(dāng)培養(yǎng)基中的底物濃度通過(guò)添加固體谷氨酸保持恒定時(shí)，GABA的產(chǎn)率較高，此外，通過(guò)向反應(yīng)器中添加少量的α-酮戊二酸，避免了催化過(guò)程中PLP對(duì)琥珀酸半醛的失活反應(yīng)，從而再生輔助因子PLP，且在反應(yīng)過(guò)程中未觀察到酶活性的顯著降低。Lee等[50]使用共價(jià)偶聯(lián)多孔硅固定植物乳桿菌GAD，并在酸性和堿性條件下表現(xiàn)出高穩(wěn)定性，熱穩(wěn)定性得到改善。這些結(jié)果表明，當(dāng)使用(部分)純化的GAD從谷氨酸生產(chǎn)GABA時(shí)，固定化技術(shù)為工業(yè)應(yīng)用提供了有利的依據(jù)。

4 展望

綜上所述，GABA作為一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，被視為藥物和食品中的生物活性成分，具有促進(jìn)身體健康的特性。同時(shí)生產(chǎn)GABA的乳酸菌也為研發(fā)含有GABA的功能性食品創(chuàng)造了有利條件，已受到國(guó)內(nèi)外研究者的重點(diǎn)關(guān)注。GAD在GABA的生物合成中起著重要作用，乳酸菌GAD結(jié)構(gòu)信息將有助于酶工程提高GAD的熱穩(wěn)定性以及在廣泛的pH范圍內(nèi)提高其活性和催化效率。雖然現(xiàn)在已有研究對(duì)部分乳酸菌GAD的結(jié)構(gòu)信息進(jìn)行了闡明，但是主要集中在對(duì)短乳桿菌GAD的研究。然而現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展能夠使我們更深入地了解其他乳酸菌的GAD結(jié)構(gòu)性質(zhì)和催化特性。未來(lái)，GABA資源的開(kāi)發(fā)方向之一是通過(guò)對(duì)GABA產(chǎn)生的分子機(jī)制、調(diào)控機(jī)制以及對(duì)產(chǎn)GABA的細(xì)胞生理學(xué)的深入研究，使GAD在遺傳和代謝水平上具有較高的轉(zhuǎn)化效率，從而促進(jìn)GABA產(chǎn)量的增加。另一方向是開(kāi)發(fā)出不同類型富含GABA的功能性食品，如開(kāi)發(fā)功能性谷薯類食品(面包、饅頭、米胚芽、米糠等)、功能性動(dòng)物性食品(發(fā)酵香腸、發(fā)酵酸奶、發(fā)酵奶酪等)、功能性蔬菜食品(發(fā)酵酸菜、綠豆芽等)、功能性調(diào)味品(醬油、腐乳、豆瓣醬、食醋、大豆醬等)，以期在人們的日常飲食中通過(guò)攝入富含GABA的食品來(lái)達(dá)到對(duì)人體的保健效果。