陳山喬

（寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江寧波 315040）

臭氧是一種不穩(wěn)定的氧化劑，在短時(shí)間內(nèi)會(huì)降解為氧氣，其溶于水形成的臭氧水具有潛在的殺菌作用[1]。臭氧殺菌過程屬于生物化學(xué)氧化反應(yīng)[1-2]，主要機(jī)理是其氧化性導(dǎo)致微生物的膜結(jié)構(gòu)等的完整性降低，造成細(xì)胞的通透性改變，或干擾其物質(zhì)能量代謝，從而抑制其增殖[2]。擴(kuò)展青霉菌（Penicilliumexpansum，PE）在自然界中廣泛分布，是多種食品腐爛發(fā)霉的重要原因之一，且具有潛在的致癌毒性風(fēng)險(xiǎn)，因此在研究中需要特別關(guān)注[3]。椰毒假單胞菌（Pseudomonas cocovenenans，PC）為革蘭氏陰性短桿菌，有食用含有由椰毒假單胞菌屬酵米面亞種產(chǎn)生的“米酵菌酸”的“酸湯子”而發(fā)生慘劇的案例[4]。因此其在研究中也需要特別的關(guān)注。

以年糕為代表的米制品由于其天然缺乏抑菌活性物質(zhì)，微生物易于攝取利用，因此在生產(chǎn)后的貯藏和流通過程中，極易由于微生物的增殖而腐敗，造成嚴(yán)重的食品安全問題。因此，目前行業(yè)內(nèi)普遍在年糕包裝后進(jìn)行水熱殺菌，但其會(huì)使年糕質(zhì)構(gòu)和口感發(fā)生變化，使得產(chǎn)品發(fā)硬，彈性降低。針對(duì)這一問題，本研究引入臭氧冷殺菌工藝，以PC、PE為研究對(duì)象，驗(yàn)證了臭氧對(duì)PC與PE的殺滅作用，并使用年糕樣本作為材料進(jìn)行了滅菌效果驗(yàn)證，得出了濃度、溫度對(duì)臭氧在年糕中殺菌效果的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

可控恒溫式反應(yīng)器（水套式自動(dòng)溫控，帶有T形攪拌，容積30 L），賽默飛世爾科技（中國）有限公司；臭氧發(fā)生器（氧氣源電暈式），深圳市飛立電器科技有限公司；臭氧濃度測(cè)定儀，邦億精密量儀（上海）有限公司；PE菌株、PC菌株，中國普通微生物菌種保藏管理中心；培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿，上海生工生物有限公司；麥?zhǔn)媳葷峁埽瑥V東環(huán)凱生物科技有限公司；無菌水、臭氧，實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)場(chǎng)制備。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 臭氧水體外殺菌試驗(yàn)

分別使用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基搖瓶液體培養(yǎng)PC和PE至平臺(tái)期。在恒溫反應(yīng)器中加20 L滅菌水并開啟攪拌。待其達(dá)到設(shè)定的溫度（15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃及35 ℃）后，通入臭氧并用臭氧檢測(cè)儀實(shí)時(shí)測(cè)定水中臭氧濃度，達(dá)到設(shè)置濃度（0.50 mg·L-1、1.00 mg·L-1、2.00 mg·L-1、4.00 mg·L-1、8.00 mg·L-1、10.00 mg·L-1、20.00 mg·L-1）后，加入通過麥?zhǔn)奖葷岱y(cè)定并稀釋的前述培養(yǎng)菌液，使最終水中的菌體濃度為1×105CUF·mL-1，開始計(jì)時(shí)的同時(shí)關(guān)閉臭氧發(fā)生器。處理前5 min以10 s為間隔對(duì)反應(yīng)器中的水進(jìn)行5 mL每次的周期性采樣，5～15 min以30 s為 間 隔，15～30 min以1 min為 間 隔，30～60 min以2 min為間隔。采集結(jié)束后記錄反應(yīng)器中殘余的臭氧濃度。采集水樣，分別對(duì)被試菌進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，以菌落總數(shù)為未檢出（ND）所對(duì)應(yīng)的時(shí)間為最小殺滅接觸時(shí)間，計(jì)算其殺菌半衰期，用以衡量殺菌速度。

1.2.2 菌落總數(shù)檢測(cè)

采用平板記數(shù)法，PC使用平板菌落計(jì)數(shù)培養(yǎng)基，PE使用孟加拉紅培養(yǎng)基。

1.2.3 臭氧水在年糕殺菌中的驗(yàn)證

年糕成型后，通過表面涂抹前述由麥?zhǔn)奖葷岱ǘ肯♂尯蟮木?，接種被試微生物，之后置于3種濃度臭氧水中冷卻浸泡10 min（12.5 mg·L-1、10.0 mg·L-1、7.5 mg·L-1），晾干后進(jìn)行真空包裝。之后在室溫下貯藏，每3 d進(jìn)行一次采樣，檢測(cè)其菌落總數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 臭氧水的滅菌效果

2.1.1 臭氧水對(duì)被試微生物的殺滅作用

為了考察臭氧水對(duì)PC和擴(kuò)展青霉菌的殺滅作用，本文以臭氧濃度為變量，在25 ℃下，由低到高設(shè)置了8個(gè)試驗(yàn)組，以完全殺滅被試微生物的最小接觸時(shí)間作為表現(xiàn)殺菌能力的特征指標(biāo)進(jìn)行了試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

由表1可知，臭氧濃度越高，其最小殺滅接觸時(shí)間越短，半衰期也越短。對(duì)于PC，在20.0 mg·L-1的臭氧質(zhì)量濃度下，達(dá)到未檢出的接觸時(shí)間僅為2.67 min，在臭氧質(zhì)量濃度為0.50 mg·L-1時(shí)，為了獲得同樣的消毒效果，接觸時(shí)間則應(yīng)該不少于44 min。對(duì)于PE，同樣濃度的臭氧水，其殺滅速度較PC更慢，在20.0 mg·L-1的臭氧質(zhì)量濃度下，達(dá)到未檢出的接觸時(shí)間為3.17 min，在臭氧濃度為0.50 mg·L-1時(shí)，必需的接觸時(shí)間則高達(dá)54.00 min。對(duì)于這兩種不同的被試微生物，其臭氧水殺菌效率的不同，可能是由于其細(xì)胞結(jié)構(gòu)存在差異。例如，真菌細(xì)胞有著更完善的抗氧化系統(tǒng)[5]，以及抗逆性更強(qiáng)的細(xì)胞壁[6]。

2.1.2 不同溫度臭氧水對(duì)微生物殺滅作用的影響

在不同溫度下，10.0 mg·L-1的臭氧水，其最小殺滅接觸時(shí)間和滅菌終止時(shí)水中的臭氧殘留如表2所示。隨著溫度的上升，兩種被試菌株的最小殺滅接觸時(shí)間有略微上升，即其殺菌性能有所下降。結(jié)合終止時(shí)臭氧殘留量可知，出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因可能在于隨著溫度的升高，臭氧在水中的降解、析出速度加快?？紤]到殺滅接觸時(shí)間的變化幅度較小，因此在實(shí)際工藝中無需對(duì)溫度進(jìn)行額外的控制。

表2 不同溫度下臭氧的質(zhì)量濃度

2.2 臭氧水在年糕殺菌中的驗(yàn)證

如表3所示，7.5 mg·L-1的臭氧水處理未能完全將年糕殺菌至無檢出，而10.0 mg·L-1的臭氧水處理能夠維持無檢出3 d，12.5 mg·L-1的臭氧水處理則可以維持6 d。根據(jù)《年糕》（SB/T 10507—2008）[7]和《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 速凍面米與調(diào)制食品》（GB 19295—2021）[8]的要求，7.5 mg·L-1、10.0 mg·L-1、12.5 mg·L-1的臭氧水處理分別維持年糕中被試微生物菌落總數(shù)合格的天數(shù)為0 d、6 d、12 d（以上）。從實(shí)際接種后年糕的殺菌結(jié)果來看，臭氧的實(shí)際滅菌效果低于純粹的水環(huán)境，這可能是一部分菌體埋入了年糕中，減少了實(shí)際與其作用的臭氧含量所致。

表3 貯藏年糕的菌落總數(shù)

3 結(jié)論

臭氧能夠有效殺滅年糕中的主要致腐菌。體外滅菌試驗(yàn)表明PC和PE與臭氧水的最小殺滅接觸時(shí)間隨臭氧濃度的增加而減小，殺菌半衰期也隨濃度的增加而減小。殺菌過程中的溫度升高會(huì)輕微的減小臭氧水的滅菌效果，但是其變化幅度較小，實(shí)際生產(chǎn)工藝開發(fā)中無需進(jìn)行控制。對(duì)接種被試菌的年糕進(jìn)行殺菌的試驗(yàn)表明，10.0 mg·L-1以上的臭氧濃度才能夠徹底殺滅年糕中的致腐菌，且12.5 mg·L-1的濃度才可以將其菌落總數(shù)維持在合格水平12 d以上。