張?jiān)拢w崇杰，韓先磊，孫楊，羅學(xué)剛，霍金海，張同存，王偉明，王楠*

1.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院 教育部工業(yè)發(fā)酵微生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；

2.天津市微生物代謝與發(fā)酵過(guò)程控制工程研究中心，天津 300457；

3.黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院 中藥研究所，黑龍江 哈爾濱 150036

桔梗（Platycodonis Radix）為桔?？平酃僦参锝酃latycodon grandiflorum（Jacq.）A.DC.的干燥根，屬于藥食同源的中藥材[1]。桔梗種植廣泛，在我國(guó)主要產(chǎn)于安徽、河南、湖北、遼寧、吉林等地，以東北、華北產(chǎn)量最高[2]。桔梗始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，性微溫，味甘、苦、辛，入肺經(jīng)，具有宣肺利咽、祛痰排膿之功效[1]。由于其含有豐富的黃酮、多酚、皂苷、多糖類(lèi)物質(zhì)，因此具有較強(qiáng)的抗氧化、抗腫瘤、抗炎、降血糖、調(diào)血脂等功效[3-5]。除了富含這些藥效物質(zhì)外，鮮桔梗中還含有蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物等營(yíng)養(yǎng)成分及鈣、磷、鐵等礦物質(zhì)[6]。

近年來(lái)，越來(lái)越多的研究報(bào)道了桔梗提取物的抗氧化作用[7-10]。孫曉春等[7]對(duì)安徽、吉林和陜西3個(gè)產(chǎn)地桔梗水提物、醇提物和桔梗多糖中主要成分的含量進(jìn)行測(cè)定，分析不同提取物的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)桔梗醇提物中總黃酮含量與多糖含量均為安徽＞吉林＞陜西，同時(shí)對(duì)1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基和羥自由基的清除率也為安徽＞吉林＞陜西。劉華麗等[8]采用正交設(shè)計(jì)法優(yōu)化桔梗多酚的提取工藝，并測(cè)定了其抗氧化作用。王曉林等[9]優(yōu)化了利用大孔吸附樹(shù)脂純化桔梗莖總黃酮的工藝條件，同時(shí)檢測(cè)了其體外抗氧化活性。李根等[10]通過(guò)酶解法制備桔梗汁，對(duì)出汁率和多酚含量進(jìn)行測(cè)定，并評(píng)價(jià)其抗氧化活性，證實(shí)酶解工藝制備的桔梗汁具有較強(qiáng)的體外抗氧化活性。

發(fā)酵中藥成分經(jīng)微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化是其發(fā)揮藥理作用的關(guān)鍵過(guò)程[11]。微生物發(fā)酵中藥具有提高有效成分含量、增強(qiáng)療效、擴(kuò)大適應(yīng)證、減少不良反應(yīng)、產(chǎn)生新的藥用資源等作用[12]。然而，目前關(guān)于微生物發(fā)酵桔梗的研究中針對(duì)適用菌種的研究較少。因此，本研究選用多個(gè)菌株對(duì)桔梗進(jìn)行發(fā)酵，對(duì)比發(fā)酵前后桔梗提取液中總多酚、總黃酮、總多糖含量變化，篩選出優(yōu)勢(shì)菌株并分析發(fā)酵液的抗氧化活性，為桔梗的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料

1.1 菌株

巨大芽孢桿菌Bacillus megateriumZY2104 和人參芽孢桿菌B.ginsengisoliZY2103 來(lái)源于新鮮桔梗根部土壤；類(lèi)腸膜魏斯菌Weissella paramesenteroidesZY2101 和綠色魏斯菌W.viridescensZY2102 來(lái)源于桔梗泡菜；鼠李糖乳桿菌Lactobacillus rhamnosussw01 和枯草芽孢桿菌B.SubtilisRZ001 為本實(shí)驗(yàn)室自有菌株；啤酒酵母Saccharomyces pastorianusS5、釀酒酵母S.CerevisiaeAY12 和S.CerevisiaeBY14 由天津科技大學(xué)現(xiàn)代釀造課題組饋贈(zèng)；菌株均保藏于天津科技大學(xué)工業(yè)微生物菌種資源平臺(tái)。

1.2 試藥

干燥桔梗藥材購(gòu)于河北安國(guó)藥材基地，由天津科技大學(xué)王楠教授鑒定為桔?？平酃僦参锝酃latycodon grandiflorum（Jacq.）A.DC.的干燥根；對(duì)照品蘆丁（批號(hào)：A27GB146690，純度≥98%）、MRS 培養(yǎng)基、瓊脂粉、七葉苷、總抗氧化能力（TAOC）檢測(cè)試劑盒、福林酚（北京索萊寶科技有限公司）；R2A液體培養(yǎng)基（青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司）；蛋白胨、酵母提取物（賽默飛世爾科技公司）；對(duì)照品沒(méi)食子酸（批號(hào)：C10271829，純度≥99%）、K3[Fe(CN)5]（上海麥克林生化科技有限公司）；鄰苯三酚、Al(NO3)3、濃硫酸、NaNO2、C2HCl3O2（天津市江天化工技術(shù)股份有限公司）；檸檬酸鐵、水楊酸（上海阿拉丁生化科技有限公司）；苯酚（上海生工生物工程有限公司）；無(wú)水乙醇（天津市立元化工有限公司）；對(duì)照品桔梗皂苷D（批號(hào)：414K024，純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司）；FeSO4（天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠(chǎng)）；H2O2（山東利爾康醫(yī)療科技股份有限公司）；FeCl3（天津渤化化學(xué)試劑有限公司）；DPPH（上海吉至生化科技有限公司）；HCl、NaOH（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）。

1.3 儀器

TMC 型恒溫孵育器（合肥艾本森科學(xué)儀器有限公司）；S.VS-840U型超凈工作臺(tái)（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠(chǎng)）；SPX-150 型生化培養(yǎng)箱（上海精天儀器有限公司）；S30408 型立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng)）；Hybrid Technology?型多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)伯騰儀器有限公司）；JIDI-18D型離心機(jī)（廣州吉迪儀器有限公司）。

2 方法

2.1 培養(yǎng)基配制

MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、牛肉粉5 g、酵母粉4 g、葡萄糖20 g、聚山梨酯-80 1 mL、磷酸氫二鉀2 g、乙酸鈉5 g、檸檬酸三銨2 g、硫酸鎂0.2 g、硫酸錳0.05 g，加蒸餾水至1 L。調(diào)節(jié)pH 至7.0，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，用于乳酸菌活化和培養(yǎng)。

MRS瓊脂固體培養(yǎng)基：在MRS液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加瓊脂15 g·L-1，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。用于乳酸菌的分離和純化。

YPD 培養(yǎng)基：蛋白胨20 g、葡萄糖20 g、酵母提取物10 g。加蒸餾水至1 L。調(diào)節(jié)pH 至7.0，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。用于酵母的活化和培養(yǎng)。

YPD 瓊脂固體培養(yǎng)基：在YPD 液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加瓊脂15 g·L-1，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。用于乳酸菌的分離和純化。

E-R2A固體培養(yǎng)基：R2A液體3.2 g、瓊脂20 g、七葉苷1 g、檸檬酸鐵0.5 g，加蒸餾水至1 L。用于判斷微生物的β-D-葡萄糖苷酶活力。

2.2 桔梗發(fā)酵液中多酚、黃酮、多糖含量測(cè)定

2.2.1 發(fā)酵桔梗的制備 將桔梗片粉碎，過(guò)40 目篩，精確稱(chēng)量桔梗粉末2.5 g 和蒸餾水50 mL，充分混勻后于121 ℃滅菌20 min，按2%的接種量分別向其中接入各菌種，未發(fā)酵組加入等量蒸餾水作為對(duì)照組。于37 ℃發(fā)酵72 h，將對(duì)照組和發(fā)酵液組離心后，取全部上清液，用蒸餾水定容到50 mL，滅菌后于4 ℃保存，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2.2 總多酚含量的測(cè)定 采用福林酚測(cè)定法[13]測(cè)定多酚的含量。精確稱(chēng)取沒(méi)食子酸對(duì)照品5 mg，用蒸餾水溶解并定容至50 mL 量瓶中，配制成質(zhì)量濃度為0.1 mg·mL-1的沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液。分別將沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液0、1、2、3、4、5、6、7 mL置于試管中，并加入蒸餾水至10 mL，配成0、10、20、30、40、50、60、70 μg·mL-1的系列沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液。分別從上述系列對(duì)照品溶液中吸1.0 mL于試管中，分別加入蒸餾水5 mL、福林酚試劑1 mL、Na2CO3溶液（0.075 g·mL-1）3 mL，振蕩顯色1 h后，在760 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（A）并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。將待測(cè)樣品稀釋后取1 mL，按照上述步驟分別加入各種試劑測(cè)定A，進(jìn)行3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)取平均值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出樣品中的總多酚含量。

2.2.3 總黃酮含量的測(cè)定 用硝酸鋁分光光度法[14]測(cè)定樣品中總黃酮含量。精密稱(chēng)取對(duì)照品蘆丁5 mg，用70%乙醇溶解并定容在25 mL 量瓶中，配制成0.2 mg·mL-1蘆丁對(duì)照品溶液。分別吸取蘆丁對(duì)照品溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL置于試管中，分別加入70%乙醇至2 mL，再加入5%的NaNO2溶液0.3 mL，搖勻、靜置6 min 后再加入10%的Al(NO3)3溶液0.3 mL，搖勻、靜置6 min，加入4%NaOH溶液2 mL，搖勻、靜置10 min后，于510 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定A并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。取待測(cè)樣品溶液1 mL加入70%乙醇1 mL，如果A過(guò)高，則將樣品倍數(shù)稀釋?zhuān)侔凑丈鲜霾襟E測(cè)定，每個(gè)樣品測(cè)3次取平均值。由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出樣品中的總黃酮含量。

2.2.4 總多糖含量的測(cè)定 采用苯酚-硫酸法[15]測(cè)定多糖的含量。稱(chēng)取葡萄糖50 mg 放入100 mL 量瓶中，加水將葡萄糖溶解；再分別吸取葡萄糖溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL，加蒸餾水至2.0 mL，分別加入6%苯酚1.0 mL 和濃硫酸5.0 mL，振蕩搖勻，沸水浴中加熱15 min 顯色，冷卻后用紫外分光光度計(jì)測(cè)490 nm 波長(zhǎng)處的A，用水作為空白對(duì)照，制得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，將樣品倍數(shù)稀釋后，按照上述步驟測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算多糖的含量。

2.3 桔梗發(fā)酵液皂苷含量、體外抗氧化能力測(cè)定

2.3.1 七葉苷顯色平板法確定產(chǎn)酶菌 分別取不同微生物，采用三區(qū)劃線(xiàn)方法接種于含有E-R2A 固體培養(yǎng)基的平板上，37 ℃倒置培養(yǎng)48 h。利用七葉苷顯色原理，根據(jù)顏色變化（變黑）評(píng)估其β-D-葡萄糖苷酶的活性。

2.3.2 菌株生長(zhǎng)曲線(xiàn) 取活化后的巨大芽孢桿菌ZY2014 在37 ℃培養(yǎng)24 h，每隔2 h 取1 次樣品，以空白培養(yǎng)基為對(duì)照，600 nm 下測(cè)得樣品的A。以生長(zhǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，A為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

2.3.3 皂苷含量的測(cè)定 采用香草醛-濃硫酸法[16]，精密稱(chēng)取桔梗皂苷D 對(duì)照品3 mg，溶于70%甲醇1 mL，充分溶解。分別吸取對(duì)照品溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，水浴蒸發(fā)至干燥，分別加入10%香草醛甲醇溶液0.5 mL 和60%硫酸5 mL，60 ℃水浴加熱15 min，冰水浴冷卻3 min。于472 nm 波長(zhǎng)測(cè)定A并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。取待測(cè)樣品1 mL，按照上述步驟測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出樣品中桔梗皂苷D的含量。

2.3.4 T-AOC 的測(cè)定 桔梗發(fā)酵液的T-AOC 檢測(cè)方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2.3.5 DPPH 自由基清除率測(cè)定 加入稀釋0、2、4、8 倍樣品4 mL 和0.15 mmol·L-1DPPH-乙醇溶液4 mL，混勻避光后靜止30 min。以蒸餾水為空白組，于517 nm 處測(cè)A，按照公式（1）計(jì)算DPPH 自由基清除率。

式中A0為空白組吸光度，A1為樣品吸光度，A2為對(duì)照組吸光度（以乙醇代替DPPH-乙醇溶液）。

2.3.6 羥自由基清除率測(cè)定 配制稀釋0、2、4、8 倍樣品，取2 mL 置于試管中，加入6 mmol·L-1FeSO4溶液和6 mmol·L-1H2O2溶液各2 mL，室溫下靜置10 min后，再加入6 mmol·L-1水楊酸溶液2 mL，搖勻；室溫下靜置30 min，于510 nm 處測(cè)A。以蒸餾水為空白組，按照公式（2）計(jì)算羥自由基清除率。

式中A0為空白組吸光度，A1為樣品吸光度，A2為對(duì)照組吸光度（以蒸餾水代替水楊酸）。

2.3.7 Fe3+還原能力測(cè)定 配制不同質(zhì)量濃度的樣品，分別取1 mL 于試管中。加入pH 6.6 的磷酸鹽緩沖液2.5 mL，搖勻后加入K3[Fe(CN)5] 水溶液2.5 mL，充分混勻后于50 ℃反應(yīng)20 min。再加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL，3000 r·min-1離心10 min（離心半徑為4 cm）。取上清液5 mL，加入蒸餾水5 mL 和0.1% FeCl3溶液1 mL。反應(yīng)30 min 后，于700 nm 處測(cè)定A，以蒸餾水作為空白組，每個(gè)樣品測(cè)3次取平均值，按照公式（3）計(jì)算還原能力。

式中A為樣品的吸光度，A0為空白組吸光度。

2.4 數(shù)據(jù)處理

3 結(jié)果

3.1 桔梗發(fā)酵前后提取液中總多酚含量

微生物發(fā)酵對(duì)桔梗提取液中總多酚含量的影響如圖1 所示，其中巨大芽孢桿菌ZY2104 發(fā)酵組總多酚質(zhì)量濃度最高，為（5.06±0.05）mg·mL-1，其次是枯草芽孢桿菌RZ001、啤酒酵母S5 發(fā)酵組，分別為（4.83±0.01）、（4.37±0.01）mg·mL-1，而其他發(fā)酵組總多酚質(zhì)量濃度與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 不同菌株發(fā)酵前后桔梗提取液中總多酚質(zhì)量濃度變化（,n=3）

3.2 桔梗發(fā)酵前后提取液中總黃酮含量

微生物發(fā)酵對(duì)桔梗提取液中總黃酮含量的影響如圖2 所示，其中巨大芽孢桿菌ZY2104 發(fā)酵組的總黃酮質(zhì)量濃度最高，為（5.83±0.06）mg·mL-1，其次是釀酒酵母AY12、類(lèi)腸膜魏斯菌ZY2101、枯草芽孢桿菌RZ001、人參芽孢桿菌ZY2103發(fā)酵組，總黃酮質(zhì)量濃度分別為（5.66±0.03）、（5.65±0.01）、（5.60±0.05）、（5.57±0.06）mg·mL-1，而釀酒酵母BY14、鼠李糖桿菌sw01、綠色魏斯菌ZY2102、啤酒酵母S5 發(fā)酵組總黃酮含量與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 不同菌株發(fā)酵前后桔梗提取液中總黃酮質(zhì)量濃度變化（,n=3）

3.3 桔梗發(fā)酵前后提取液中總多糖含量

微生物發(fā)酵對(duì)桔梗提取液中總多糖含量的影響如圖3 所示，其中鼠李糖桿菌sw01 發(fā)酵組的多糖質(zhì)量濃度最高，為（11.84±0.87）mg·mL-1，其次是釀酒酵母AY12、釀酒酵母BY14、類(lèi)腸膜魏斯菌ZY2101發(fā)酵組，分別為（10.95±0.37）、（10.89±0.49）、（10.85±1.02）mg·mL-1。而巨大芽孢桿菌ZY2104發(fā)酵組多糖質(zhì)量濃度為（8.96±0.14）mg·mL-1，也顯著高于對(duì)照組 [（5.55±0.43）mg·mL-1]?？莶菅挎邨U菌RZ001 發(fā)酵組多糖含量與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3 不同菌株發(fā)酵前后桔梗提取液中總多糖質(zhì)量濃度變化（,n=3）

相對(duì)于對(duì)照組及其他微生物發(fā)酵組，巨大芽孢桿菌ZY2104發(fā)酵組總多酚、總黃酮含量均最高，總多糖含量也處于較高水平。有研究報(bào)道[5,7]，桔梗皂苷是桔梗中的主要成分，具有抗氧化作用，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)測(cè)定了對(duì)照組及發(fā)酵組中桔梗皂苷D的含量，并對(duì)巨大芽孢桿菌ZY2104是否具有β-D-葡萄糖苷酶活性進(jìn)行了驗(yàn)證，同時(shí)也對(duì)巨大芽孢桿菌ZY2104發(fā)酵桔梗提取液進(jìn)行抗氧化活性測(cè)定。

3.4 巨大芽孢桿菌ZY2104的基本形態(tài)和生長(zhǎng)曲線(xiàn)

菌落呈圓形、灰白色，表面光滑濕潤(rùn)（圖4A）。革蘭染色呈紫色，棒狀桿菌，單個(gè)或呈短鏈排列（圖4B）。巨大芽孢桿菌ZY2104 的生長(zhǎng)曲線(xiàn)如圖5所示，培養(yǎng)至18 h時(shí)，菌體生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期。

圖4 巨大芽孢桿菌ZY2104的形態(tài)

圖5 巨大芽孢桿菌ZY2104的生長(zhǎng)曲線(xiàn)

3.5 巨大芽孢桿菌ZY2104 產(chǎn)β-D-葡萄糖苷酶活性檢測(cè)

利用七葉苷顯色培養(yǎng)基對(duì)生物菌株產(chǎn)β-D-葡萄糖苷酶的情況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)巨大芽孢桿菌ZY2104 可以在七葉苷顯色培養(yǎng)基中產(chǎn)黑色水解斑，且顏色較深，說(shuō)明其β-D-葡萄糖苷酶活性較強(qiáng)（圖6）。

圖6 七葉苷顯色培養(yǎng)基中的巨大芽孢桿菌ZY2104

3.6 巨大芽孢桿菌ZY2104 發(fā)酵前后桔梗提取液中桔梗皂苷D含量

對(duì)照組桔梗提取液中桔梗皂苷D 質(zhì)量濃度為（34.07±1.47）μg·mL-1，巨大芽孢桿菌ZY2104 發(fā)酵后桔梗提取液桔梗皂苷D 質(zhì)量濃度降至（26.70±1.57）μg·mL-1（P＜0.05）。

3.7 發(fā)酵前后桔梗提取液抗氧化活性

巨大芽孢桿菌ZY2104發(fā)酵前后桔梗提取液的抗氧化能力變化情況見(jiàn)表1。不同的稀釋倍數(shù)下，發(fā)酵組T-AOC、DPPH 自由基的清除率與對(duì)照組比較均顯著提高（P＜0.05）；發(fā)酵組羥自由基清除率與對(duì)照組比較均提高。在未稀釋情況下，發(fā)酵組TAOC、還原能力與對(duì)照組比較顯著提高（P＜0.05），其他稀釋倍數(shù)下均有提高的趨勢(shì)。說(shuō)明巨大芽孢桿菌ZY2104發(fā)酵能夠提高桔梗的抗氧化能力。

表1 發(fā)酵對(duì)桔梗提取液抗氧化能力的影響（,n=3）

表1 發(fā)酵對(duì)桔梗提取液抗氧化能力的影響（,n=3）

注：同列不同字母代表與相同稀釋倍數(shù)的對(duì)照組比較P＜0.05。

4 討論

中藥發(fā)酵主要是指在一定的環(huán)境條件下（如濕度、溫度等）借助微生物的作用使中藥的藥性、活性成分和功效應(yīng)用均發(fā)生了變化，從而達(dá)到增強(qiáng)療效、減少不良反應(yīng)、擴(kuò)大用藥品種，適應(yīng)臨床用藥的需要[17]。微生物發(fā)酵可以提高中藥有效成分的溶出，同時(shí)模擬體內(nèi)微生物轉(zhuǎn)化過(guò)程，在體外把藥物轉(zhuǎn)化為人體能迅速吸收的有效成分，并產(chǎn)生豐富的次生代謝產(chǎn)物。

微生物含有多種豐富酶系，可以利用中藥中的蛋白質(zhì)、多糖、微量元素、維生素等多種營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)中藥成分進(jìn)行轉(zhuǎn)化。微生物可以通過(guò)利用降解苷類(lèi)物質(zhì)產(chǎn)生的糖類(lèi)作為碳源，為其發(fā)酵生長(zhǎng)提供能量。微生物發(fā)酵也可以提升多種中藥中黃酮、多酚類(lèi)物質(zhì)的含量。劉鋒等[18]研究表明，淡豆豉發(fā)酵過(guò)程中總黃酮和多糖含量隨發(fā)酵時(shí)間累積呈上升趨勢(shì)，總黃酮含量在發(fā)酵9 d 達(dá)到最高，多糖含量在發(fā)酵13 d 達(dá)到峰值。曾玲等[19]發(fā)現(xiàn)利用貝萊斯芽孢桿菌和庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母菌株2 種菌株發(fā)酵桔梗提取液后，總黃酮、總酚含量均顯著升高，同時(shí)發(fā)酵液的抗氧化活性也顯著提升，其中貝萊斯芽孢桿菌菌株發(fā)酵后的體外抗氧化能力最強(qiáng)。Wang 等[20]利用鼠李糖乳桿菌217-1發(fā)酵桔梗根，制備的發(fā)酵液中桔梗皂苷D、類(lèi)黃酮和多酚的質(zhì)量濃度均顯著增加，同時(shí)DPPH 自由基清除率顯著提高，并且這種桔梗根發(fā)酵液可以降低葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生。

本研究中篩選出的活性較好的巨大芽孢桿菌ZY2104 是從新鮮桔梗的土壤中獲得，屬于植株內(nèi)生菌。與其他菌株相比，其發(fā)酵桔梗提取液顯示了較高的多酚、黃酮和多糖含量。同時(shí)七葉苷平板實(shí)驗(yàn)中也展示了巨大芽孢桿菌ZY2104 具有較高的β-D-葡萄糖苷酶活性。巨大芽孢桿菌ZY2104 發(fā)酵桔梗后，提取液中桔梗皂苷D 質(zhì)量濃度從（34.07±1.47）μg·mL-1下降到（26.70±1.57）μg·mL-1。已有研究報(bào)道，五環(huán)三萜皂苷類(lèi)成分由于口服吸收較差及機(jī)體代謝作用致使其生物利用度普遍較低[21-22]。大多數(shù)皂苷主要經(jīng)各種酶系、菌群等轉(zhuǎn)化為次級(jí)苷、苷元及氧化還原產(chǎn)物等而產(chǎn)生生物活性[23-25]。已知β-D-葡萄糖苷酶可以將桔梗中桔梗皂苷E 依次通過(guò)去掉1 個(gè)葡萄糖基分別生成桔梗皂苷D3和桔梗皂苷D，而桔梗皂苷D 在β-D-葡萄糖苷酶的作用下繼續(xù)生成去糖基化桔梗皂苷D[26-27]。桔梗皂苷D 在細(xì)胞酶PCL5 的作用下也可以通過(guò)去除1 個(gè)芹糖基和1 個(gè)木糖基分別生成去芹糖桔梗皂苷D 和脫脂木糖桔梗皂苷D[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，在巨大芽孢桿菌ZY2104 發(fā)酵桔梗后提取液中桔梗皂苷D 的含量降低，可能是由于其在β-D-葡萄糖苷酶或其他酶的作用下繼續(xù)轉(zhuǎn)化生成了其他有功能活性的物質(zhì)。

巨大芽孢桿菌具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。李秀穎等[29]將提取完皂苷后的黃姜藥渣、沸石粉、豆餅、過(guò)硫酸鈣等制成的固體培養(yǎng)基為原料，通過(guò)添加巨大芽孢桿菌、膠質(zhì)芽孢桿菌、圓褐固氮菌等多種益生菌進(jìn)行發(fā)酵，得到的生物有機(jī)肥料不僅生產(chǎn)成本低，還減少了藥渣對(duì)環(huán)境的污染。劉虎等[30]篩選出的1 株巨大芽孢桿菌具有高產(chǎn)β-D-葡萄糖苷酶能力，該酶可選擇性地將甜菊苷轉(zhuǎn)化，進(jìn)而使甜菊糖（RA）的純度得到提高。本研究中也發(fā)現(xiàn)巨大芽孢桿菌ZY2104 顯著提高了桔梗發(fā)酵液的T-AOC、DPPH自由基清除率、羥自由基清除率和還原能力。

綜上所述，本研究利用多種不同來(lái)源的微生物對(duì)桔梗提取物進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果發(fā)現(xiàn)內(nèi)生菌巨大芽孢桿菌ZY2104是發(fā)酵桔梗的優(yōu)勢(shì)菌種，可以顯著提高桔梗提取物中有效成分的含量，提高其抗氧化活性，為桔梗發(fā)酵研究與應(yīng)用開(kāi)發(fā)提供參考。