史紫娟,林碧珊,陳錦霞,劉勇,高永堅(jiān),區(qū)淑蘊(yùn),曾杉
國藥集團(tuán) 廣東環(huán)球制藥有限公司,廣東 佛山 528305
火麻仁又名大麻仁、麻子仁、線麻子、大麻子等,為??? 年生草本植物大麻Cannabis sativaL.的干燥成熟果實(shí)或成熟去殼的種子。炒火麻仁為火麻仁清炒后的炮制品,具有潤腸燥、滋陰血之功效[1]。炒火麻仁的主要活性成分有脂肪油、生物堿等。脂肪油為其主要藥效成分之一,包含飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸及其酯類等,具有降血壓、利尿、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗血栓形成的功效[2]。炒火麻仁中含有的主要生物堿成分為胡蘆巴堿,是一種廣泛分布的季銨鹽生物堿。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,胡蘆巴堿具有抗腫瘤、降低膽固醇及降血糖等藥理活性[3],被視為炒火麻仁的特征性指標(biāo)成分。關(guān)于炒火麻仁的成分含量測定的文獻(xiàn)報(bào)道不多,現(xiàn)有文獻(xiàn)只針對火麻仁中的脂肪酸或胡蘆巴堿進(jìn)行單方面研究[4-5],但由于樣品前處理復(fù)雜和高溫下易發(fā)生雙鍵異構(gòu)化而難以準(zhǔn)確測定等原因,《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)2020 年版尚未建立炒火麻仁的含量測定指標(biāo)。
中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑是在中醫(yī)理論指導(dǎo)下以臨床實(shí)際應(yīng)用為參考,使用現(xiàn)代中藥提取方法并通過標(biāo)準(zhǔn)化工藝規(guī)程制備而成的單味中藥飲片水煎液,是中藥配方顆粒生產(chǎn)工藝和質(zhì)量的“基準(zhǔn)”[6]。本研究制備了20 批炒火麻仁飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑,考察了炒火麻仁飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的出膏率、總脂肪酸和葫蘆巴堿含量及轉(zhuǎn)移率,并進(jìn)行特征圖譜相似度研究,為炒火麻仁配方顆粒的質(zhì)量控制提供參考。
H-Class 型超高效液相色譜儀(美國Waters 公司);MS105DU 型十萬分之一天平、AL104 型萬分之一天平、PL203 型千分之一天平(瑞士梅特勒-托利多公司);KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);FTS-40F 型陶瓷保健壺(潮州市一壺百飲電器實(shí)業(yè)有限公司);TRL-0.5 型真空冷凍干燥機(jī)(大連雙瑞科技有限公司);Synergy UV型超純水儀(美國Millipore公司)。
對照品α-亞麻酸(批號(hào):111631-201605,純度:99.8%)、亞油酸(批號(hào):111622-201203,純度:99.1%)、鳥苷(批號(hào):111977-201501,純度:93.6%)、胡蘆巴堿(批號(hào):110883-201604,純度:78.4%)均購自中國食品藥品檢定研究院;色譜純甲醇和乙腈;色譜純冰乙酸和十二烷基磺酸鈉(Aladdin公司);石油醚為分析純;水為超純水。
20 批火麻仁藥材分別產(chǎn)自山西、河南、陜西、甘肅等地,經(jīng)江陰天江藥業(yè)有限公司唐波研究員鑒定為桑科植物大麻Cannabis sativaL.的干燥成熟果實(shí),按《中國藥典》2020 年版標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)全部合格,參考《中國藥典》2020 年版火麻仁項(xiàng)下炮制方法制成炒火麻仁飲片[1],具體炮制方法:除去雜質(zhì)和果皮,文火清炒至微黃。依據(jù)“逢籽必破”原則,用中藥飲片機(jī)將炒火麻仁飲片打碎至全部通過10 目篩。20批飲片信息見表1。
表1 20批炒火麻仁飲片信息
取炒火麻仁飲片100 g,加入8倍量水浸泡30 min,煎煮30 min,趁熱濾過,藥渣再加入6 倍量水,煎煮25 min,濾過,合并濾液。減壓濃縮至約200 g的浸膏,即得炒火麻仁飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑。浸膏加水稀釋至固含率約為15%,再進(jìn)行冷凍干燥,即得炒火麻仁飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉。
《中國藥典》2020 年版火麻仁藥材、飲片及炒火麻仁飲片均沒有相應(yīng)的含量測定項(xiàng),本研究參考文獻(xiàn)[7-8],采用油重法測定炒火麻仁飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑中總脂肪的含量。另參照《中國藥典》2020 年版(一部)胡蘆巴項(xiàng)下胡蘆巴堿含量測定色譜條件建立了炒火麻仁飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑中胡蘆巴堿的含量測定方法,為制定炒火麻仁配方顆粒的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供參考[1]。
2.2.1 總脂肪含量測定
2.2.1.1 飲片供試品的制備 稱取打碎后炒火麻仁飲片(過二號(hào)篩)約2.0 g,移入濾紙筒內(nèi),將濾紙筒放入索氏提取器的抽提筒內(nèi),由提取器冷凝管上端加入石油醚至接收瓶內(nèi)容積的1/2處,于水浴上加熱,使石油醚不斷回流抽提至6 h。將抽提液減壓濃縮,分別轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿,置水浴鍋上蒸干,再于100 ℃烘箱中干燥1 h,于干燥器內(nèi)冷卻0.5 h 后稱質(zhì)量,蒸發(fā)皿增加的質(zhì)量即為總脂肪質(zhì)量。
2.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品的制備 取炒火麻仁飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉約1.0 g,以下與2.2.1.1 項(xiàng)下“移入濾紙筒內(nèi)”后操作相同,蒸發(fā)皿增加的質(zhì)量即為總脂肪質(zhì)量。
2.2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)湯劑總脂肪含量平行樣驗(yàn)證 取同一批炒火麻仁飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉,平行3 份,按2.2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品,測定總脂肪含量。結(jié)果3 批標(biāo)準(zhǔn)湯劑的總脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為32.08%、32.75%、31.89%,均值為32.24%,RSD為1.40%。結(jié)果表明,同一批炒火麻仁飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑平行樣總脂肪含量的RSD<2%,表明各平行樣間差異較小,標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備工藝可靠,總脂肪含量測定方法穩(wěn)定。
2.2.2 胡蘆巴堿含量測定
2.2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm),以甲醇-0.05%十二烷基磺酸鈉溶液-冰乙酸(20.0∶80.0∶0.1)為流動(dòng)相,檢測波長為265 nm,柱溫為30 ℃,流速為0.30 mL·min-1,進(jìn)樣量為1 μL,理論板數(shù)按胡蘆巴堿峰計(jì)算應(yīng)不低于4000。
2.2.2.2 對照品溶液的制備 取胡蘆巴堿對照品適量,精密稱定,加50%甲醇制成質(zhì)量濃度為20 μg·mL-1的溶液,即得。
2.2.2.3 飲片供試品溶液的制備 取炒火麻仁飲片粉末(過二號(hào)篩)約1.0 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入50%甲醇25 mL,密塞,稱定質(zhì)量,超聲處理(500 W,40 kHz)30 min,取出,放冷,再稱定質(zhì)量,用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。
2.2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液的制備 取本品凍干粉約0.2 g,精密稱定,以下與2.2.2.3 項(xiàng)下“置具塞錐形瓶中”后相同操作,取續(xù)濾液,即得。
2.2.2.5 方法學(xué)考察 線性關(guān)系考察:精密稱取胡蘆巴堿對照品12.23 mg,置100 mL量瓶中,加50%甲醇溶解并定容至刻度,作為對照品儲(chǔ)備溶液。分別精密量取上述儲(chǔ)備液,稀釋成質(zhì)量濃度為0.006 1、0.012 2、0.024 5、0.048 9、0.097 8、0.122 3 mg·mL-1的對照溶液,按2.2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定,記錄色譜峰面積。以胡蘆巴堿峰面積為縱坐標(biāo)(Y),質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程:Y=168.35X+0.012 3(r=1.000 0),表明質(zhì)量濃度為0.006 1~0.122 3 mg·mL-1時(shí)與峰面積線性關(guān)系良好。
精密度試驗(yàn):取胡蘆巴堿對照品溶液,按2.2.2.1 項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次,計(jì)算胡蘆巴堿峰面積的RSD為0.4%,表明儀器精密度良好。
穩(wěn)定性試驗(yàn):取炒火麻仁飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉約0.2 g,精密稱定,按2.2.2.4 項(xiàng)下方法制備供試品溶液,精密吸取供試品溶液,按2.2.2.1 項(xiàng)下色譜條件,分別在0、2、6、12、24 h進(jìn)樣,計(jì)算胡蘆巴堿峰面積的RSD為1.1%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
重復(fù)性試驗(yàn):取同一批炒火麻仁飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉約0.2 g,精密稱定,按2.2.2.4 項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液,精密吸取供試品溶液,按2.2.2.1項(xiàng)下色譜條件測定,計(jì)算供試品溶液中胡蘆巴堿含量的RSD為0.8%,表明該方法重復(fù)性良好。
加樣回收率試驗(yàn):取同一批已知含量的炒火麻仁飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉約0.1 g,平行稱取6 份,精密稱定,置圓底燒瓶中,分別按1∶1 加入胡蘆巴堿對照品溶液,按2.2.2.4 項(xiàng)下方法制備供試品溶液,精密吸取供試品溶液,按2.2.2.1 項(xiàng)下色譜條件測定,計(jì)算胡蘆巴堿平均回收率和RSD,結(jié)果胡蘆巴堿的平均回收率為97.7%,RSD 為0.3%,表明該方法回收率良好。
2.2.2.6 炒火麻仁飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率測定 將20批炒火麻仁飲片制備成標(biāo)準(zhǔn)湯劑,取標(biāo)準(zhǔn)湯劑約10 g,置質(zhì)量恒定的蒸發(fā)皿中,水浴蒸干,再放置105 ℃烘箱中干燥3 h,取出,置于干燥器中放冷30 min,測定干固物并按公式(1)計(jì)算出膏率。結(jié)果見表2。結(jié)果表明,20 批炒火麻仁飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率為15.55%~22.04%,均值為18.80%。
2.2.2.7 炒火麻仁飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品測定 根據(jù)已建立的含量測定方法對20批炒火麻仁飲片及其標(biāo)準(zhǔn)湯劑進(jìn)行定量測定并按公式(2)、(3)計(jì)算轉(zhuǎn)移率,結(jié)果見表2。
表2 炒火麻仁飲片及標(biāo)準(zhǔn)湯劑測定結(jié)果
結(jié)果表明,20 批炒火麻仁飲片總脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)為37.98%~53.88%,均值為48.58%,;20 批炒火麻仁飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑總脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16.38%~36.76%,均值為26.15%;20批炒火麻仁飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑總脂肪含量轉(zhuǎn)移率為5.61%~17.33%,均值為10.87%。
20 批炒火麻仁飲片中胡蘆巴堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.057%~0.119%,均值為0.074%;20批炒火麻仁飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑胡蘆巴堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.234%~0.460%,均值為0.336%;20批炒火麻仁飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑胡蘆巴堿含量轉(zhuǎn)移率為83.93%~98.72%,均值為91.11%。
2.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm),流動(dòng)相為乙腈(A)-水(B),梯度洗脫(0~6 min,2%~12%A;6~14 min,12%~40%A;14~16 min,40%~80%A;16~21 min,80%A;21~24 min,80%~100%A;24~26 min,100%A);流速為0.30 mL·min-1;檢測波長為205 nm;柱溫為35 ℃;進(jìn)樣量為1 μL。
2.3.2 對照品溶液的制備 分別取對照品α-亞麻酸和亞油酸適量,精密稱定,加甲醇制成質(zhì)量濃度為10 μg·mL-1的溶液;取鳥苷對照品適量,精密稱定,加水制成質(zhì)量濃度為20 μg·mL-1的溶液,作為對照品溶液。
2.3.3 供試品溶液的制備 取炒火麻仁飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉,研細(xì),取約0.1 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入50%甲醇10 mL,密塞,稱定質(zhì)量,超聲(500 W,40 kHz)30 min,取出,放冷,再稱定質(zhì)量,用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。
2.3.4 對照品指認(rèn) 精密吸取2.3.2 項(xiàng)下對照品溶液和2.3.3 項(xiàng)下供試品溶液各1 μL,進(jìn)樣測定,記錄色譜圖,結(jié)果見圖1。
圖1 對照品及炒火麻仁飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的UPLC圖
結(jié)果表明,在炒火麻仁飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征圖譜中,分別呈現(xiàn)與鳥苷(峰1)、α-亞麻酸(峰5)和亞油酸(峰6)保留時(shí)間一致的特征峰。
2.3.5 特征圖譜方法學(xué)考察 精密度試驗(yàn):取同一份炒火麻仁飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液,按照2.3.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄色譜圖,并以α-亞麻酸峰(峰5)為參照峰,計(jì)算各特征峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積,結(jié)果其RSD 均小于2%,表明儀器精密度良好。
穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一份炒火麻仁飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液,分別在0、2、4、8、10、12、16、20、24 h按2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定,以α-亞麻酸峰(峰5)為參照峰,計(jì)算各特征峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積,結(jié)果其RSD 均小于2%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。
重復(fù)性試驗(yàn):取同一批炒火麻仁飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉,按2.3.3 項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液,按照2.3.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定,以α-亞麻酸峰(峰5)為參照峰,計(jì)算各特征峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積,結(jié)果其RSD 均小于3%,表明該方法重復(fù)性良好。
取20 批炒火麻仁飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉,按2.3.3 項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按2.3.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定,記錄色譜圖。將20 批樣品色譜圖導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)”(2012 版)軟件中進(jìn)行色譜峰匹配及相似度分析,選擇峰面積穩(wěn)定的色譜峰作為共有峰,最終確定6 個(gè)共有峰。20 批炒火麻仁飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的特征圖譜見圖2,對照特征圖譜見圖3,相似度結(jié)果見表3。結(jié)果顯示,20 批炒火麻仁飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征圖譜與對照特征圖譜之間的相似度均在0.90 以上,表明各批次炒火麻仁飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑具有較好的一致性。
表3 20批炒火麻仁飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征圖譜相似度結(jié)果
圖2 20批炒火麻仁飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑UPLC特征圖譜
圖3 炒火麻仁飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑對照特征圖譜
本研究選取20 批合格的炒火麻仁飲片,參照《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求》[9]和《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》[10]的煎煮方法,以水為提取溶劑,煎煮2 次,經(jīng)固液分離、低溫減壓濃縮、冷凍干燥后制得樣品。炒火麻仁以果實(shí)入藥,為瀉下藥,不屬于清熱、滋補(bǔ)類藥。所以炒火麻仁飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑一煎煮沸后再煎煮30 min,二煎時(shí)間適當(dāng)縮短為25 min。本研究考察了過濾方式及不同目數(shù)篩網(wǎng)的過濾效果,水煎液直接過篩時(shí),會(huì)殘留較多油脂在篩網(wǎng)上。因此,通過先將水煎液油層吸取出來,再將剩余水煎液過篩的方式,可以盡量收集水煎液中的油脂。通過對200目和350目篩網(wǎng)的比較發(fā)現(xiàn),兩者濾液中均無明顯可見固體雜質(zhì),為了提高過濾效率,選擇了200 目篩網(wǎng)進(jìn)行固液分離。同時(shí)通過比較不同濃縮溫度下炒火麻仁飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的密度、出膏率及濃縮液狀態(tài),發(fā)現(xiàn)在65 ℃減壓條件下進(jìn)行濃縮時(shí),濃縮液可正常起泡蒸發(fā),終密度為1.00~1.02 g·mL-1,為了保證標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量的穩(wěn)定性,最終采用65 ℃減壓進(jìn)行濃縮。
通過二極管陣列檢測器對炒火麻仁飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑中特征圖譜色譜峰信號(hào)進(jìn)行全波長(190~400 nm)掃描,再結(jié)合炒火麻仁飲片中油脂類成分,如亞油酸、α-亞麻酸等分子結(jié)構(gòu)中僅含有非共軛雙鍵,因此只有末端吸收,全波長掃描結(jié)果也顯示,炒火麻仁飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑在205 nm 附近具有較強(qiáng)吸收,因此選擇205 nm 作為特征圖譜的檢測波長。流動(dòng)相考察了乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液和甲醇-水3 種不同體系,標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液在乙腈-0.1%磷酸水溶液和甲醇-水流動(dòng)相體系中基線漂移較大,在乙腈-水體系中特征峰個(gè)數(shù)、響應(yīng)值及基線平穩(wěn)程度均較優(yōu),因此采用乙腈-水作為炒火麻仁飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征圖譜的流動(dòng)相體系??疾炝?0、35、40 ℃柱溫的差異,結(jié)果在柱溫35 ℃時(shí)火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑主要色譜峰的分離度更好。
供試品溶液制備方法時(shí)考察了無水乙醇、甲醇、50%乙醇水溶液和水4 種溶劑對炒火麻仁飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的提取效率,結(jié)果50%甲醇提取的峰個(gè)數(shù)最多,提取效率最高;同時(shí)比較了超聲提取和回流提取2種方式對提取效率的影響,結(jié)果2 種提取方式差異不大,從操作方便考慮,選擇超聲提取。
參考文獻(xiàn)[11]中關(guān)于火麻仁飲片中胡蘆巴堿的研究采用的是高效液相色譜法(HPLC),樣品處理過程復(fù)雜,且對色譜柱的要求較高??紤]到色譜柱的通用性和普及性,本研究選用了C18反向鍵合色譜柱,簡化了樣品的處理過程,并且隨著儀器的普及和檢測器的多樣化,UPLC 以其高效、快速、靈敏、節(jié)省溶劑等優(yōu)點(diǎn),在中藥指紋圖譜和有效成分的分析上占據(jù)明顯優(yōu)勢[12]。本研究采用UPLC 技術(shù),建立了炒火麻仁飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑中胡蘆巴堿的含量測定方法,該法簡便、易行,可有效測定炒火麻仁飲片中胡蘆巴堿的含量。
20 批炒火麻仁飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的特征圖譜,通過擬合共確定了6 個(gè)特征峰,并通過對照品指認(rèn)了鳥苷、α-亞麻酸和亞油酸3 個(gè)成分,將多批結(jié)果導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)”(2012 版)進(jìn)行計(jì)算,結(jié)果20 批炒火麻仁飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品的特征圖譜相似度均高于0.90,表明該方法簡便準(zhǔn)確、重復(fù)性好,可用于炒火麻仁飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量控制。
本研究根據(jù)《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求》[9]中相關(guān)規(guī)定,確定了炒火麻仁飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備的相應(yīng)工藝參數(shù),制備了20 批不同產(chǎn)地的炒火麻仁飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑,并從指標(biāo)性成分的定量檢測及其出膏率、轉(zhuǎn)移率和特征圖譜等方面進(jìn)行了系統(tǒng)研究,建立的指標(biāo)性成分的定量檢測方法和特征圖譜方法可同時(shí)用于炒火麻仁飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑的檢測,研究結(jié)果可為炒火麻仁飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑和配方顆粒的制備及質(zhì)量控制研究提供參考,從而提高產(chǎn)品質(zhì)量控制水平。