楊浩綜述；趙侃侃，王夢(mèng)川審閱（南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院 普通外科，廣東 廣州 510282）

外泌體（exosome）是一種由細(xì)胞分泌的、直徑約為30～150 nm的囊泡結(jié)構(gòu)，其內(nèi)包含蛋白質(zhì)、DNA和RNA 等物質(zhì)[1-3]。外泌體被不同的細(xì)胞（例如腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、造血細(xì)胞和上皮細(xì)胞等）攝取后，其可與這些細(xì)胞進(jìn)行信息傳遞和物質(zhì)交換[4-6]。目前，現(xiàn)已被證實(shí)的外泌體與細(xì)胞結(jié)合方式包括兩大類：一是外泌體與細(xì)胞膜直接融合；二是外泌體通過細(xì)胞表面受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)[7-10]。在體內(nèi)條件下，腫瘤細(xì)胞并非孤立存在，而是存在于腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）中[11]。TME 由腫瘤細(xì)胞、腫瘤間質(zhì)細(xì)胞和非細(xì)胞成分組成[11-12]，而腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancer-associated fibroblast，CAF）屬于腫瘤間質(zhì)細(xì)胞的一種[13-15]。值得一提的是，正常人體內(nèi)并不存在CAF，而一旦體內(nèi)發(fā)生腫瘤后，腫瘤細(xì)胞可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CAF，同時(shí)CAF 又進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，從而形成惡性循環(huán)[16-18]。近年的研究結(jié)果[19-20]表明，腫瘤來源外泌體（tumor-derived exosome，TDE）亦可誘導(dǎo)CAF 的生成，因此，本綜述旨在闡述TDE 的提取和鑒定方法、TDE 誘導(dǎo)CAF 的具體機(jī)制和對(duì)TME 的作用，通過深入了解上述過程，期望能從CAF 入手為將來基于TME的靶向治療提供新的思路。

1 TDE的提取和鑒定

TDE的高效提取和準(zhǔn)確鑒定是研究外泌體誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞分化為CAF 的先決條件。目前，絕大多數(shù)的研究均是從腫瘤細(xì)胞中提取外泌體，這些細(xì)胞系包括：肝癌細(xì)胞系HepG2、CSQT-2、MHCC-97L、HCC-LM3和SMMC-7721，前列腺癌細(xì)胞系LNCAP、Du145、PC3 和22Rv1，膀胱癌細(xì)胞系HT1376、RT4、T24和SW1710，乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231和MDA-MB-468，結(jié)直腸癌細(xì)胞系CaCo2、舌癌細(xì)胞系HSC-3、子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系Ishikawa和霍奇金淋巴瘤細(xì)胞系KM-H2 等[21-22]。僅有極少數(shù)研究是從人原代腫瘤細(xì)胞中提取外泌體，兩者各有利弊。從細(xì)胞中提取外泌體的優(yōu)勢(shì)在于細(xì)胞來源單一，獲得的外泌體干擾較少，劣勢(shì)是不能反映腫瘤患者的自身情況；從原代腫瘤細(xì)胞中提取外泌體的優(yōu)點(diǎn)是能真實(shí)地反映患者的情況，其缺點(diǎn)是原代腫瘤細(xì)胞僅代表某一個(gè)個(gè)體，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能不具有普遍性[22]。另外，由于外泌體常與其他細(xì)胞外囊泡混合在一起，在提取過程中難免混雜其他成分，如何提取高純度的外泌體亦是一個(gè)問題[23-24]。目前，公認(rèn)的提取方法包括超速離心法和ExoQuick-TC試劑盒法（亦有部分研究采用蔗糖緩沖法），但無論哪一種提取方法，都或多或少地?fù)诫s有其他細(xì)胞的外囊泡，所以準(zhǔn)確地鑒定外泌體亦是非常重要的一個(gè)步驟[19，25]。由于外泌體的直徑遠(yuǎn)小于細(xì)胞和細(xì)菌，在光學(xué)顯微鏡下無法直接觀察其形態(tài)，因此常需借助透射電鏡或Nanosight激光粒度儀鑒定其大小，后者還可用于外泌體的定量檢測(cè)[26-28]。除了形態(tài)學(xué)的觀察方法外，研究者[29-30]還采用納米顆粒跟蹤分析法或BCA蛋白定量法檢測(cè)某些特征性蛋白腫瘤易感基因-101、CD9、CD63、CD81、HSP70 和脂筏特征蛋白flotillin 等來鑒定外泌體。

2 成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CAF的研究現(xiàn)狀

目前的研究所采用的成纖維細(xì)胞主要來源于兩大類：一類是來源于成纖維細(xì)胞系，例如人肺成纖維細(xì)胞系A(chǔ)G02262、AG02262 和MRC5，人表皮成纖維細(xì)胞系HDFn和NHDF，人前列腺間質(zhì)成纖維細(xì)胞系WPMY-1和小鼠胚胎成纖維細(xì)胞系NIH/3T3等；另一類是從人體原代組織中提取成纖維細(xì)胞，例如人肺成纖維細(xì)胞、前列腺間質(zhì)細(xì)胞、子宮內(nèi)膜細(xì)胞和膀胱成纖維細(xì)胞等。值得注意的是，成纖維細(xì)胞并非永生細(xì)胞，在培養(yǎng)傳代過程中會(huì)逐漸失去其特性，因此，無論是原代細(xì)胞還是培養(yǎng)傳代的細(xì)胞，通常選用十代之內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行研究[31-32]。另外，雖然成纖維細(xì)胞和CAF 的形態(tài)具有相似性，但由于CAF 表達(dá)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（alpha-smooth muscle actin，α-SMA）等特征性蛋白，可通過檢測(cè)特征性蛋白的表達(dá)來區(qū)分兩者[33-34]。

如前所述，研究TDE 誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)镃AF 的重要環(huán)節(jié)之一是觀察成纖維細(xì)胞是否攝取TDE。對(duì)于該問題，通常利用PKH26或CFSE標(biāo)記外泌體，然后將標(biāo)記的外泌體與成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)，最后利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的熒光信號(hào)，或者采用免疫熒光法觀察細(xì)胞是否顯色來判斷成纖維細(xì)胞是否捕獲和攝取外泌體[35]。一旦成纖維細(xì)胞攝取外泌體后，將可能轉(zhuǎn)變?yōu)镃AF，雖然兩者在形態(tài)上難以區(qū)別，但可通過檢測(cè)CAF 的特征蛋白，包括α-SMA、成纖維細(xì)胞活化蛋白（fibroblast activation protein，F(xiàn)AP）、半乳糖結(jié)合蛋白、纖維連接蛋白和組織金屬蛋白酶抑制因子-2 等來進(jìn)行區(qū)分[36]。并且，CAF 的遷移、侵襲以及分泌的細(xì)胞因子的能力均顯著提高，這些細(xì)胞因子包括促炎癥因子IL-1α、IL-6、IL-8和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、促血管生成因子VEGF、HGF 和FGF2，以及生長因子G-CSF、GM-CSF、EGF和Pro-MMP等[37]。

3 TDE誘導(dǎo)CAF生成的機(jī)制

3.1 外泌體攜帶蛋白誘導(dǎo)CAF生成

在TME 內(nèi)，腫瘤細(xì)胞可通過轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）/SMAD 通路誘導(dǎo)CAF 的生成，其具體機(jī)制是腫瘤細(xì)胞分泌的游離TGF-β 與成纖維細(xì)胞的TGF-βⅠ型和Ⅱ型受體結(jié)合，促使下游的SMAD2 和SMAD3磷酸化，并進(jìn)一步與SMAD4形成復(fù)合物，該復(fù)合物再進(jìn)入成纖維細(xì)胞核內(nèi)，通過上調(diào)α-SMA 的轉(zhuǎn)錄進(jìn)而促使成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)镃AF。WEBBER等[19]研究發(fā)現(xiàn)，TDE 亦攜帶TGF-β，不同之處在于TGF-β 并非游離而是與外泌體包膜上的TGF-β Ⅲ型受體形成三聚體，當(dāng)外泌體與成纖維細(xì)胞接觸后，TGF-β Ⅲ型受體可將TGF-β 傳遞至成纖維細(xì)胞的TGF-βⅠ型和Ⅱ型受體，從而激活成纖維細(xì)胞下游的SMAD通路。從上述研究結(jié)果不難看出，TGF-β似乎需要在外泌體的包膜表面才能發(fā)揮作用，但有研究者[31]的結(jié)果則截然相反，為了明確TGF-β 的定位，用蛋白酶K 和Triton X-100 處理膀胱癌細(xì)胞來源外泌體，其原理是蛋白酶K具備降解包膜內(nèi)蛋白的功能，但無法通過磷脂雙分子層，而Triton X-100 可破壞外泌體的磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)，進(jìn)而協(xié)助蛋白酶K進(jìn)入外泌體內(nèi)，并降解包膜內(nèi)蛋白。此外，他們將蛋白酶K單獨(dú)加入外泌體，發(fā)現(xiàn)外泌體攜帶的TGF-β 并未減少，且仍可誘導(dǎo)CAF的生成，說明TGF-β并非位于外泌體的包膜上；而同時(shí)加入蛋白酶K 和Triton X-100后，絕大多數(shù)外泌體所攜帶的TGF-β 被降解，且外泌體不能誘導(dǎo)CAF 的生成，表明TGF-β 定位于外泌體的包膜內(nèi)。上述兩項(xiàng)研究結(jié)果表明，外泌體可通過TGF-β/SMAD 通路誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)镃AF，但不同類型的TDE 所攜帶TGF-β 的部位可能有所不同。

除了經(jīng)典的TGF-β/SMAD 通路以外，越來越多的通路亦逐漸被發(fā)現(xiàn)，例如，霍奇金淋巴瘤來源外泌體可引起成纖維細(xì)胞TNF-α 蛋白的表達(dá)，后者進(jìn)一步上調(diào)核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）的表達(dá)，從而參與CAF 的生成[33]；ZHAO 等[35]發(fā)現(xiàn)，黑色素瘤細(xì)胞來源外泌體可促進(jìn)成纖維細(xì)胞細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（ERK1/2）蛋白磷酸化，并提高其血管細(xì)胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）的表達(dá)，而ERK1/2/VCAM-1通路的活化可能與CAF形成相關(guān)；SUNG等[38]通過三陰性乳腺癌MBA-MB-231細(xì)胞過表達(dá)整合素β4（integrin beta 4，ITGB4），使其細(xì)胞來源外泌體攜帶高表達(dá)的ITGB4，后者可經(jīng)BNIP3L 依賴的自噬途徑促進(jìn)CAF 的生成；YEUNG等[39]的研究結(jié)果表明，前列腺癌來源外泌體攜帶的囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)因子Ras 超家族三磷酸鳥苷激酶-35（Rab35）通過改變成纖維細(xì)胞MMP1和MMP3的表達(dá)來調(diào)控其α-SMA 的轉(zhuǎn)錄，而一旦敲除腫瘤細(xì)胞中Rab35 基因，其分泌的外泌體則不能誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞分化為CAF，說明Rab35/MMP1/MMP3 亦可能是一條重要的信號(hào)通路。

3.2 外泌體miRNA可誘導(dǎo)CAF生成

miRNA 屬于小分子非編碼RNA，其主要功能是抑制信使RNA 的轉(zhuǎn)錄[40]。TDE 攜帶大量miRNA，這些miRNA 參與腫瘤細(xì)胞的免疫調(diào)控、耐藥及轉(zhuǎn)移等過程[41]。當(dāng)外泌體被成纖維細(xì)胞攝取后，前者通過釋放其中的miRNA 可影響后者的基因轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而促使其分化為CAF[40-42]。例如，雌激素受體陽性乳腺癌MCF-7細(xì)胞和三陰性乳腺癌MBA-MB-231細(xì)胞來源外泌體攜帶的miR-146a可靶向抑制成纖維細(xì)胞中的硫氧還蛋白互作蛋白（thioredoxin-interacting protein，TXNIP）的基因轉(zhuǎn)錄，并進(jìn)一步活化下游的Wnt/βcatenin 通路，從而促使成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CAF[43]；FANG 等[44]研究發(fā)現(xiàn)，肝癌細(xì)胞來源外泌體攜帶的miR-1247-3p 通過下調(diào)成纖維細(xì)胞β-1,4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶Ⅲ，進(jìn)一步激活下游的ITGBβ1/NF-κB 信號(hào)通路，從而促使成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CAF。此外，MAIDA等[45]研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞來源外泌體攜帶有miR-141-3p 和miR-200b-3p，當(dāng)這些外泌體被子宮內(nèi)膜成纖維細(xì)胞攝取后，釋放出大量的miR-141-3p 和miR-200b-3p 可顯著降低靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而促使子宮內(nèi)膜成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)镃AF。進(jìn)一步采用miRNA質(zhì)譜分析法比較子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞和其分泌的外泌體miRNA水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)約23%的miRNA僅存在于外泌體而并未存在于子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞，該現(xiàn)象說明，TDE 所攜帶的miRNA 種類與腫瘤細(xì)胞自身攜帶的miRNA不盡相同。

4 CAF對(duì)TME的促進(jìn)作用

在體外環(huán)境下，CAF 通過分泌各種細(xì)胞因子作用于不同細(xì)胞，包括腫瘤細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等，其綜合效應(yīng)是促進(jìn)腫瘤的生長。例如，結(jié)腸癌SW480 細(xì)胞來源外泌體可促進(jìn)CAF 生成，而后者又可破壞TME 中的細(xì)胞外基質(zhì)成分，從而促進(jìn)SW480細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[46]；GIUSTI等[37]的研究結(jié)果表明，人源性卵巢癌CABA I 和SKOV3 細(xì)胞來源外泌體促使人皮膚成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)镃AF，CAF又可提高CABA I和SKOV3 細(xì)胞的遷移和侵襲能力；FANG 等[44]發(fā)現(xiàn)，高轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞通過分泌富含miR-1247-3p 的外泌體促使成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)镃AF，而CAF 釋放的IL-6和IL-8 會(huì)促進(jìn)肝癌細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，并提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性。此外，CAF 尚具有促進(jìn)血管生成的作用。例如，有研究[47]發(fā)現(xiàn)肺癌細(xì)胞來源外泌體通過激活CAF的非受體型蛋白酪氨酸激酶2（Janus kinase 2，JAK2）/STAT3通路，可促進(jìn)TME內(nèi)的微血管生成；WEBBER 等[19]利用血管生成實(shí)驗(yàn)證實(shí)，經(jīng)TDE作用后，TME內(nèi)的血管長度和厚度均顯著增加；無獨(dú)有偶，GIUSTI 等[37]用卵巢癌CABA I 細(xì)胞來源外泌體誘導(dǎo)生成的CAF與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)，通過細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)證實(shí)CAF 可提高人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移能力。

在體內(nèi)環(huán)境下，CAF 同樣具有促腫瘤的作用。例如，TP53 基因缺失的結(jié)腸癌細(xì)胞外泌體可促進(jìn)小鼠移植瘤內(nèi)CAF 的增殖，而后者可進(jìn)一步提高小鼠的成瘤能力[16]；FANG等[44]用CAF條件培養(yǎng)基培養(yǎng)高轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞，再將這些肝癌細(xì)胞注入裸鼠皮下建立異種移植瘤模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與普通肝癌細(xì)胞相比，經(jīng)CAF 預(yù)處理的肝癌細(xì)胞其皮下成瘤能力顯著增強(qiáng)，并且更易發(fā)生肺部轉(zhuǎn)移；D?RSAM等[33]將CAF和霍奇金淋巴瘤細(xì)胞一起接種至NOD免疫缺陷小鼠皮下，并通過鼠尾靜脈輸注霍奇金淋巴瘤來源外泌體，經(jīng)病理檢查證實(shí)上述小鼠體內(nèi)成瘤的微血管生成較對(duì)照組顯著增多。

5 結(jié)語

目前的研究已證實(shí)，TDE 可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞分化為CAF，該作用可進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的生長和進(jìn)展。然而目前仍有一些亟待解決的問題，例如依據(jù)分子標(biāo)志物α-SMA 和FAP 的表達(dá)差異，可將CAF 細(xì)分為不同的亞型，這些亞型的CAF 功能不盡相同甚至截然相反，因此采用分子生物學(xué)和生物信息學(xué)相結(jié)合的方式對(duì)CAF 的亞型進(jìn)行深入挖掘和分析，將有助于人們加深對(duì)CAF的理解和認(rèn)識(shí)。除了CAF自身以外，探討CAF與TME其他細(xì)胞的關(guān)系亦是未來研究的方向之一，例如CAF 可影響TME 內(nèi)免疫細(xì)胞（包括具有抑癌作用的效應(yīng)T 細(xì)胞和促癌作用的調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞等）的代謝過程，而T 細(xì)胞的代謝與其針對(duì)腫瘤抗原的免疫識(shí)別和免疫應(yīng)答又息息相關(guān)；此外，CAF 還具有重塑細(xì)胞外基質(zhì)的作用，其結(jié)果是阻止免疫細(xì)胞浸潤，對(duì)腫瘤細(xì)胞的局部侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移發(fā)揮功效，說明CAF 可能會(huì)影響腫瘤免疫治療的療效[48-49]?？傊?，隨著對(duì)CAF 作用機(jī)制和TME 內(nèi)細(xì)胞間相互作用的深入研究，將為基于TME 的靶向治療和免疫治療提供新的思路和方向。