虞淦軍，吳艷峰，曹雪濤（海軍軍醫(yī)大學(xué) 免疫學(xué)研究所暨醫(yī)學(xué)免疫學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200433）

新抗原（neoantigen）通常是指由腫瘤細(xì)胞突變基因編碼產(chǎn)生的，并能被免疫細(xì)胞所識(shí)別，激活機(jī)體免疫應(yīng)答的一類(lèi)異常蛋白質(zhì)[1]。此外，致瘤病毒整合進(jìn)基因組而編碼產(chǎn)生的蛋白質(zhì)也可稱(chēng)之為新抗原。近年來(lái)，高通量基因組測(cè)序和生物信息學(xué)分析技術(shù)的飛速發(fā)展極大地推動(dòng)了新抗原的篩選和鑒定，對(duì)于將其應(yīng)用于缺乏腫瘤特異性抗原作為優(yōu)質(zhì)靶標(biāo)的腫瘤免疫治療具有重要的意義。隨著以新抗原為基礎(chǔ)的腫瘤治療性疫苗取得了一定的臨床療效，并展示了良好的應(yīng)用前景，腫瘤免疫治療2.0時(shí)代正在拉開(kāi)大幕[2]。然而，作為一種新興的治療方法，個(gè)性化新抗原腫瘤疫苗還尚未成熟，依然面臨著諸多阻礙和挑戰(zhàn)。如何克服這些挑戰(zhàn)，最終切實(shí)提高實(shí)體瘤的治療有效率和延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間，是目前亟待解決、也是決定個(gè)性化新抗原腫瘤疫苗發(fā)展走向的重要問(wèn)題。綜觀新抗原腫瘤疫苗從抗原篩選、疫苗設(shè)計(jì)到臨床應(yīng)用及評(píng)價(jià)的完整鏈條，本文從新抗原的鑒定、新抗原腫瘤疫苗、臨床應(yīng)用現(xiàn)狀、面臨的挑戰(zhàn)和未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)與策略等五個(gè)方面，系統(tǒng)地總結(jié)個(gè)性化新抗原腫瘤疫苗這一新興的個(gè)性化免疫治療方法的發(fā)展歷程，并分析其未來(lái)發(fā)展方向。

1 新抗原的鑒定

新抗原具有以下特點(diǎn)：（1）高度特異性，與傳統(tǒng)的腫瘤相關(guān)抗原相比，新抗原只表達(dá)于腫瘤組織而不表達(dá)于正常組織，具有高度特異性;（2）顯著外源性，致瘤病毒作為外源性病原體，其基因編碼產(chǎn)生的新抗原與機(jī)體自身組織細(xì)胞的蛋白質(zhì)差異較大，而腫瘤細(xì)胞突變產(chǎn)生的新抗原，通常未經(jīng)胸腺陰性選擇，因此，具有顯著的外源性；（3）突變隨機(jī)性，根據(jù)目前的認(rèn)知，腫瘤突變的位點(diǎn)和類(lèi)型是隨機(jī)的，并無(wú)規(guī)律可循，這也給新抗原的預(yù)測(cè)帶來(lái)了極大的困難和不確定性；（4）分布集落性，大多數(shù)的腫瘤細(xì)胞都存在新抗原的表達(dá)，由于突變隨機(jī)性的存在，并非所有腫瘤細(xì)胞表達(dá)的新抗原是相同的，因此，新抗原在腫瘤中的分布通常是集落性或克隆性的[2]。通常，新抗原被認(rèn)為是腫瘤特異性抗原，是免疫治療的理想靶標(biāo)。

1.1 鑒定方法

早期新抗原的鑒定主要采用cDNA文庫(kù)篩選的方法，但是此方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力、效率低下，因此難以推廣。隨著測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)的發(fā)展，使得快速有效地篩選個(gè)性化新抗原成為可能，為新抗原疫苗的臨床應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。目前，新抗原的鑒定主要依賴(lài)于二代測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)分析平臺(tái)。

新抗原鑒定的一般流程是采集患者的腫瘤組織和非腫瘤組織（如癌旁組織或外周血單個(gè)核細(xì)胞），將提取的組織細(xì)胞DNA進(jìn)行二代測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析，根據(jù)腫瘤類(lèi)型，通常可以找到大量腫瘤特異性突變；再結(jié)合RNA測(cè)序的結(jié)果，分析突變基因的表達(dá)豐度，進(jìn)一步確認(rèn)突變的有效性。然后通過(guò)生物信息學(xué)分析平臺(tái)，對(duì)突變基因編碼產(chǎn)生的新抗原進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，篩選出可能具有免疫原性的新抗原[3]。

目前，主流的新抗原鑒定方法之一是根據(jù)基因測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，找到非同義突變的位點(diǎn)，通過(guò)計(jì)算機(jī)算法和分析，預(yù)測(cè)該位點(diǎn)可能形成的新抗原表位。根據(jù)抗原提呈機(jī)制，目前新抗原預(yù)測(cè)算法主要考慮的因素包括蛋白酶體對(duì)突變蛋白的剪切、肽段轉(zhuǎn)運(yùn)及與MHCⅠ類(lèi)分子的親和力等[4-5]。通常認(rèn)為，與HLA有較強(qiáng)親和力（IC50<150 nmol/L）的多肽更有可能誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。迄今為止，新抗原預(yù)測(cè)主要關(guān)注MHCⅠ類(lèi)分子結(jié)合表位，MHCⅡ類(lèi)分子結(jié)合表位由于其彈性較大、復(fù)雜性更強(qiáng)而甚少進(jìn)行預(yù)測(cè)。

另一種新抗原鑒定方法是基于質(zhì)譜測(cè)序的篩選預(yù)測(cè)模型[6-8]，其原理是將細(xì)胞表面的抗原肽從HLA分子上洗脫下來(lái)進(jìn)行質(zhì)譜測(cè)序。這種方法的優(yōu)勢(shì)是極大地縮小了新抗原的候選范圍，并且不具偏向性。但該法的顯著缺點(diǎn)是靈敏度低，一些低豐度的肽段容易被忽略。有研究[9-12]報(bào)道，基于對(duì)腫瘤細(xì)胞表面真實(shí)新抗原（true neoantigen）肽段的質(zhì)譜測(cè)序數(shù)據(jù)，配合HLA分型信息，建立計(jì)算機(jī)深度學(xué)習(xí)（deep learning）模型，可能進(jìn)一步提高預(yù)測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性。

目前，許多研究機(jī)構(gòu)和生物技術(shù)公司都建立了各自的MHCⅠ類(lèi)途徑提呈表位預(yù)測(cè)算法平臺(tái)，包括利用質(zhì)譜進(jìn)一步改進(jìn)預(yù)測(cè)算法。代表性分析工具有：（1）NetChop，通過(guò)計(jì)算機(jī)人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)人類(lèi)蛋白酶體的剪切位點(diǎn)；（2）NetMHC，通過(guò)計(jì)算機(jī)人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)肽段和MHCⅠ類(lèi)分子結(jié)合的親和力；（3）NetMHCpan，同時(shí)整合了親和力以及質(zhì)譜洗脫配體（MS eluted ligand）數(shù)據(jù)進(jìn)行訓(xùn)練，預(yù)測(cè)結(jié)果更加可靠；（4）NetCTL，預(yù)測(cè)蛋白酶體剪切位點(diǎn)、TAP轉(zhuǎn)運(yùn)效率，以及肽段與MHCⅠ類(lèi)分子結(jié)合的親和力。

隨著測(cè)序深度的不斷提高和生物信息學(xué)的不斷發(fā)展，更多鑒定新抗原的新型高通量篩選方法也逐漸被建立，如JOGLEKAR 等[13]利用NFAT-GFP報(bào)告系統(tǒng)開(kāi)發(fā)了一種基于TCR與pMHC相互作用的T細(xì)胞抗原平臺(tái)——SABR（signaling and antigen-presenting bifunctional receptor）；KISIELOW等[14]開(kāi)發(fā)的專(zhuān)門(mén)針對(duì)MHCⅡ類(lèi)分子抗原表位的MCR（MHC-TCR chimeric receptor）等技術(shù)。但這些方法目前還處于概念驗(yàn)證階段，存在一定的局限性。例如，SABR和MCR方法需要知道TCR的序列信息，構(gòu)建信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和抗原提呈雙功能受體的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)復(fù)雜、操作繁瑣及不易推廣應(yīng)用。

總體來(lái)說(shuō)，新抗原鑒定的流程相對(duì)簡(jiǎn)單，其難點(diǎn)是基于對(duì)抗原提呈途徑的理解而開(kāi)發(fā)的生物信息分析和算法及其系統(tǒng)化和標(biāo)準(zhǔn)化。由于現(xiàn)有的認(rèn)知限制，蛋白酶體對(duì)新抗原剪切、加工成多肽表位的過(guò)程相當(dāng)于一個(gè)“黑匣子”，也成了限制新抗原預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性的瓶頸之一。此外，鑒于HLA 的多態(tài)性，新抗原的預(yù)測(cè)不僅要考慮其本身的特性，如外源性、集落性、表達(dá)豐度等，還應(yīng)考慮與其對(duì)應(yīng)的MHCⅠ類(lèi)分子的表達(dá)豐度和親和力[15-18]。

1.2 驗(yàn)證方法

對(duì)預(yù)測(cè)、篩選得到的新抗原，還需評(píng)估和驗(yàn)證其免疫原性[19]。目前，大多采用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)（ELISPOT）、四聚體（tetramer）等細(xì)胞免疫應(yīng)答相關(guān)的檢測(cè)技術(shù)，通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證新抗原免疫原性和免疫反應(yīng)性；小樣本的臨床研究結(jié)果也提供了重要且寶貴的驗(yàn)證數(shù)據(jù)。這些驗(yàn)證數(shù)據(jù)將為真實(shí)新抗原數(shù)據(jù)庫(kù)的建立和新抗原預(yù)測(cè)篩選體系的完善提供重要的依據(jù)，但新抗原的個(gè)性化特性給驗(yàn)證帶來(lái)了較大的挑戰(zhàn)，如人源化動(dòng)物模型的構(gòu)建、T細(xì)胞來(lái)源、靶細(xì)胞的選擇及來(lái)源等。

總體上，對(duì)于新抗原的驗(yàn)證，目前尚缺乏高通量、有效、快速的方法，也缺乏相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)化體系。較為合理、可行的方法是建立和擴(kuò)大真實(shí)新抗原數(shù)據(jù)庫(kù)，即體外或動(dòng)物或臨床試驗(yàn)中已驗(yàn)證的新抗原數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)海量數(shù)據(jù)積累并結(jié)合人工智能神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)學(xué)習(xí)算法，不斷總結(jié)和分析真實(shí)新抗原的特征，進(jìn)而提高新抗原的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性。準(zhǔn)確性的提高則將有助于縮小新抗原篩選范圍、集中篩選目標(biāo)，進(jìn)而提高篩選的效率，最大限度地為腫瘤患者的治療爭(zhēng)取時(shí)間。

2 新抗原腫瘤疫苗

不同于傳統(tǒng)的預(yù)防性疫苗，腫瘤治療性疫苗是指在腫瘤患者體內(nèi)，通過(guò)誘導(dǎo)機(jī)體自身的特異性的細(xì)胞或體液免疫應(yīng)答，達(dá)到控制或清除腫瘤的天然、人工合成或用基因重組技術(shù)表達(dá)的產(chǎn)品或制品。腫瘤疫苗由于其主動(dòng)性和特異性，被認(rèn)為是最安全、有效的腫瘤免疫治療手段，其關(guān)鍵點(diǎn)在于疫苗中的腫瘤抗原信息。但是，長(zhǎng)期以來(lái)，腫瘤特異性抗原的缺乏是阻礙腫瘤免疫治療的瓶頸，基于腫瘤新抗原的疫苗是一種真正的個(gè)性化治療方案，不僅能增強(qiáng)特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)，還可以降低或徹底規(guī)避脫靶效應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，疫苗中所包含的腫瘤特異性信息被免疫系統(tǒng)提呈、識(shí)別，并激發(fā)特異性抗腫瘤免疫應(yīng)答。新抗原作為一種高度個(gè)性化的腫瘤特異性抗原，以其為基礎(chǔ)的治療性疫苗在腫瘤精準(zhǔn)治療策略中必將占有非常重要的地位。

2.1 疫苗類(lèi)型

新抗原腫瘤疫苗有多種形式，主要有多肽/蛋白疫苗、DC 疫苗和核酸疫苗等，目前以多肽/蛋白疫苗居多[20-22]。

多肽/蛋白疫苗目前在新抗原腫瘤疫苗中應(yīng)用最為廣泛。多肽疫苗序列明確、易于制備和保存，其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，不經(jīng)APC提呈過(guò)程即可直接與MHC分子結(jié)合，激活T 細(xì)胞，產(chǎn)生較強(qiáng)的CD8+T 細(xì)胞反應(yīng)。普通的多肽抗原由于所含表位單一、分子量小及易降解等因素導(dǎo)致免疫原性較弱，不能獲得理想的抗腫瘤效果，故通常采用佐劑配合或設(shè)計(jì)長(zhǎng)肽疫苗的方法提高其免疫原性。而蛋白疫苗相較于多肽疫苗含有更多的抗原表位信息，免疫原性和穩(wěn)定性強(qiáng)于多肽疫苗，且可以同時(shí)誘導(dǎo)CD8+T 和CD4+T 細(xì)胞反應(yīng)，在新抗原測(cè)序比對(duì)的過(guò)程中可以直接選取差異表達(dá)的蛋白進(jìn)行設(shè)計(jì)。但是新抗原疫苗的高度個(gè)性化特點(diǎn)導(dǎo)致多肽/蛋白的生產(chǎn)周期較長(zhǎng)，且很多預(yù)測(cè)得到的表位序列往往無(wú)法達(dá)到臨床級(jí)的生產(chǎn)要求，在實(shí)際應(yīng)用中受到一定的限制。

DC 作為體內(nèi)抗原提呈能力最強(qiáng)的細(xì)胞，處于人體免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)，可以負(fù)載多種形式的抗原，如腫瘤裂解物、多肽、mRNA 等，具有廣泛的免疫刺激活性，免疫應(yīng)答更持久，其制成的DC疫苗是主動(dòng)性免疫治療策略中最重要的方法。多種DC疫苗已經(jīng)在臨床應(yīng)用和研究中證實(shí)了其有效性。新抗原負(fù)載的DC疫苗無(wú)疑是非常理想的主動(dòng)治療性疫苗。

核酸疫苗主要有DNA 和mRNA 兩種形式。DNA 疫苗具有生產(chǎn)方便、制劑穩(wěn)定和可編碼所有表位等優(yōu)勢(shì)，且DNA 疫苗具有內(nèi)在佐劑效應(yīng)，可以更好地激發(fā)抗腫瘤免疫應(yīng)答。但是DNA 疫苗也存在插入致突變的潛在風(fēng)險(xiǎn)，且DNA 轉(zhuǎn)染效率低。mRNA 疫苗具有高效、不良反應(yīng)少和生產(chǎn)成本低等優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)在新型冠狀病毒等傳染病和腫瘤臨床試驗(yàn)中驗(yàn)證和應(yīng)用。RNA 合成技術(shù)、低溫/常溫保存技術(shù)和遞送載體技術(shù)的進(jìn)步掃清了多個(gè)阻礙mRNA 疫苗開(kāi)發(fā)的障礙，如基因翻譯、易降解和體內(nèi)遞送效率低等問(wèn)題，還進(jìn)一步改善了mRNA的免疫原性[23]。mRNA疫苗是一種多用途且功能強(qiáng)大的平臺(tái)，已被廣泛證明是一種富有前景的免疫治療手段[24]。

2.2 疫苗設(shè)計(jì)與免疫方案

新抗原腫瘤疫苗通常包含腫瘤抗原、免疫佐劑、輔料和遞送工具等[20]，其遞送形式是疫苗設(shè)計(jì)首先要考慮的因素。不同類(lèi)型的腫瘤疫苗設(shè)計(jì)需要考慮的因素也不盡相同，如多肽/蛋白疫苗的設(shè)計(jì)要考慮新抗原表位的理化屬性、合成純化的可行性、免疫佐劑的選擇、是否與DC聯(lián)用等。

新抗原腫瘤疫苗的制備周期是目前其臨床實(shí)際應(yīng)用的一個(gè)限制因素。不同疫苗平臺(tái)的制備周期不同，最快的是核酸疫苗，其次是多肽/蛋白疫苗和DC疫苗。對(duì)于晚期腫瘤患者，生存期往往較短，過(guò)長(zhǎng)的疫苗制備周期可能導(dǎo)致患者錯(cuò)失治療機(jī)會(huì)。

除了新抗原疫苗的設(shè)計(jì)，免疫方案的制訂也是影響療效的關(guān)鍵[2]。根據(jù)免疫學(xué)基礎(chǔ)理論，抗原進(jìn)入機(jī)體的量、途徑、次數(shù)、頻率等均可顯著影響機(jī)體對(duì)抗原的免疫應(yīng)答類(lèi)型和強(qiáng)度。因此，免疫方案的制訂包括免疫劑量、免疫方式、免疫時(shí)間、免疫周期等。適中的抗原劑量可誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，而過(guò)低或過(guò)高的抗原劑量可誘導(dǎo)免疫耐受。另外，免疫劑量的選擇還應(yīng)綜合考慮免疫方式、臨床有效性和安全性等因素。皮內(nèi)注射和皮下注射最容易誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，肌內(nèi)注射次之，而靜脈注射效果較差，但是免疫方式的選擇還應(yīng)考慮疫苗類(lèi)型和臨床應(yīng)用實(shí)際情況。疫苗的起效通常需要較長(zhǎng)的時(shí)間，且依賴(lài)于患者本身的免疫功能狀態(tài)，因此最好在腫瘤的早期進(jìn)行新抗原疫苗治療。另外，當(dāng)新抗原疫苗與其他治療方式聯(lián)用時(shí)，還應(yīng)考慮其他治療對(duì)疫苗療效的影響，如許多化療藥物使用前會(huì)進(jìn)行糖皮質(zhì)激素的預(yù)處理，這會(huì)大大抑制免疫系統(tǒng)的功能，進(jìn)而影響疫苗的療效[25]。

3 新抗原疫苗的臨床應(yīng)用現(xiàn)況

腫瘤治療性疫苗歷經(jīng)多年發(fā)展，其出現(xiàn)稱(chēng)得上是腫瘤治療領(lǐng)域的一次革命。而新抗原將掀開(kāi)腫瘤個(gè)性化免疫治療的新篇章，使得患者的免疫細(xì)胞如T細(xì)胞能夠像導(dǎo)彈一樣自主追蹤和精準(zhǔn)攻擊腫瘤細(xì)胞。多肽疫苗、DC疫苗、mRNA疫苗等不同路徑的嘗試，已經(jīng)在惡性黑色素瘤、肺癌、腦膠質(zhì)瘤等腫瘤治療領(lǐng)域取得了一定的臨床療效，展示了良好的應(yīng)用前景（表1）。截至2021年12月31日，在國(guó)際臨床試驗(yàn)注冊(cè)平臺(tái)（http://www.clinicaltrials.gov）上注冊(cè)的新抗原疫苗相關(guān)的臨床試驗(yàn)共90項(xiàng)（關(guān)鍵詞：neoantigen vaccine）。其中，美國(guó)49項(xiàng)居首位，中國(guó)24項(xiàng)位列第二。在適應(yīng)證方面，主要集中在突變負(fù)荷較高的惡性黑色素瘤（12%）、肺癌（9%）等實(shí)體瘤類(lèi)型中。在疫苗類(lèi)型方面，一半以上（47項(xiàng)）的臨床試驗(yàn)采用的是多肽/蛋白疫苗，其次是DC疫苗（20項(xiàng)）和核酸疫苗（DNA疫苗10項(xiàng)，mRNA疫苗7項(xiàng)）。在研究進(jìn)展方面，大部分（86項(xiàng)）的臨床試驗(yàn)仍處于Ⅰ期或Ⅱ期，只有少數(shù)幾項(xiàng)進(jìn)入Ⅲ期。

表1 代表性的新抗原腫瘤疫苗臨床研究

目前，以新抗原為基礎(chǔ)的腫瘤疫苗臨床試驗(yàn)正在如火如荼地開(kāi)展，在不同腫瘤類(lèi)型中取得療效突破的好消息也不斷傳來(lái)。個(gè)性化新抗原腫瘤疫苗已經(jīng)在延長(zhǎng)晚期實(shí)體瘤患者生存期方面展現(xiàn)了不錯(cuò)的實(shí)力。

4 腫瘤新抗原疫苗面臨的挑戰(zhàn)

4.1 異質(zhì)性

4.1.1 腫瘤異質(zhì)性 腫瘤的異質(zhì)性非常復(fù)雜，包括空間異質(zhì)性和時(shí)間異質(zhì)性[33-34]?？臻g異質(zhì)性一般是指不同腫瘤類(lèi)型之間的異質(zhì)性、相同腫瘤在不同患者之間的異質(zhì)性、腫瘤原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶之間的異質(zhì)性、同種腫瘤在同一器官組織的不同原發(fā)灶之間的異質(zhì)性和腫瘤內(nèi)部細(xì)胞間的異質(zhì)性等。時(shí)間異質(zhì)性是指同一腫瘤病灶在不同的發(fā)生發(fā)展階段可能呈現(xiàn)不同的表型和特征。這種高度復(fù)雜的異質(zhì)性，很大程度上限制了腫瘤免疫治療的療效。現(xiàn)有的免疫治療方法幾乎不可能覆蓋腫瘤中所有腫瘤細(xì)胞的表型或靶點(diǎn)。另外，用于腫瘤新抗原預(yù)測(cè)的樣本只是腫瘤病灶的極小部分，無(wú)法呈現(xiàn)腫瘤的完整基因突變信息，增加了新抗原腫瘤疫苗療效的不確定性。腫瘤異質(zhì)性是個(gè)性化腫瘤新抗原疫苗所面臨的最主要問(wèn)題之一。

4.1.2 患者HLA 異質(zhì)性 腫瘤新抗原的提呈和識(shí)別具有MHC限制性，而MHC具有高度多態(tài)性和顯著的個(gè)體差異，這種異質(zhì)性不僅增加了新抗原篩選和鑒定的難度，也導(dǎo)致不同個(gè)體對(duì)腫瘤抗原的親和力和反應(yīng)性千差萬(wàn)別，直接影響抗腫瘤免疫應(yīng)答的產(chǎn)生和強(qiáng)度[35]。這是以新抗原為基礎(chǔ)的免疫治療高度個(gè)性化的重要原因之一，也在很大程度上限制了新抗原腫瘤疫苗的廣泛應(yīng)用[36-37]，尤其對(duì)未來(lái)腫瘤新抗原疫苗成為“貨架產(chǎn)品”提出了挑戰(zhàn)。

4.2 腫瘤微環(huán)境

腫瘤微環(huán)境是腫瘤免疫治療研究的重要影響因素，其與腫瘤本身構(gòu)成完整的生態(tài)系統(tǒng)，具有異質(zhì)性、抑制性、相對(duì)獨(dú)立性和綜合性等特點(diǎn)，是實(shí)體瘤免疫治療取得突破性療效所必須逾越的一座大山[38-40]。高壓、低氧、偏酸的惡劣環(huán)境，一方面使免疫細(xì)胞很難進(jìn)入，另一方面也使浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞很難發(fā)揮正常的功能。此外，成纖維細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞等將腫瘤細(xì)胞團(tuán)團(tuán)包裹，形成了一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的“腫瘤器官”[39]。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，腫瘤與免疫系統(tǒng)不斷博弈，由抑制性分子（如PD-L1、TIM-3 等）、抑制性細(xì)胞（如Treg細(xì)胞、MDSC、TAM等）、抑制性細(xì)胞因子（如IL-10、TGF-β 等）等成分組成的免疫抑制性環(huán)境逐漸形成，為腫瘤細(xì)胞自身的發(fā)展和免疫逃逸創(chuàng)造了良好的生長(zhǎng)環(huán)境。為了逃避免疫監(jiān)視，腫瘤細(xì)胞還會(huì)下調(diào)MHCⅠ類(lèi)分子的表達(dá)，即使有新抗原的產(chǎn)生，也無(wú)法提呈到腫瘤細(xì)胞表面供免疫細(xì)胞識(shí)別[36]。針對(duì)實(shí)體瘤，新抗原疫苗與其他種類(lèi)的免疫治療方法一樣，都需要克服腫瘤微環(huán)境的阻礙[41]。

4.3 新抗原的預(yù)測(cè)和驗(yàn)證

新抗原的預(yù)測(cè)主要依賴(lài)于二代測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)分析，尤其是預(yù)測(cè)算法和模型。目前的算法還存在諸多不足，如主流的二代測(cè)序技術(shù)僅對(duì)單核苷酸突變的測(cè)定結(jié)果較為準(zhǔn)確，而對(duì)插入、缺失等突變的檢測(cè)能力非常有限[42]；HLA的高度異質(zhì)性加大了新抗原表位肽的篩選難度，只能部分預(yù)測(cè)MHCⅠ類(lèi)分子抗原，難以預(yù)測(cè)MHCⅡ類(lèi)分子抗原；庫(kù)容量不足，僅有部分MHC 等位基因的親和力數(shù)據(jù)等。這些因素都限制了算法預(yù)測(cè)腫瘤新抗原的準(zhǔn)確性。不同的技術(shù)平臺(tái)有不同的算法，由于沒(méi)有統(tǒng)一的流程和標(biāo)準(zhǔn)，因此結(jié)果的準(zhǔn)確性無(wú)法判別?？傮w來(lái)說(shuō)，目前新抗原預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性都相對(duì)較低，且缺乏大規(guī)模臨床研究的驗(yàn)證。以常用的NetMHCpan/NetMHC 算法為例，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)[19]顯示，該算法預(yù)測(cè)出的新抗原可被提呈到細(xì)胞表面的不足5%，而能被MHC結(jié)合并識(shí)別的還不到1%。在一項(xiàng)臨床試驗(yàn)[43]中，研究者對(duì)3例黑色素瘤患者的組織標(biāo)本進(jìn)行了新抗原預(yù)測(cè)分析，結(jié)果共預(yù)測(cè)出HLA-A*02∶01 限制性新抗原表位46～111 個(gè)/例，根據(jù)其表達(dá)情況進(jìn)一步篩選得到11～24 個(gè)/例，再經(jīng)過(guò)一系列算法，選出7個(gè)/例新抗原表位制備成DC疫苗并予以治療，最終在患者體內(nèi)只檢測(cè)到了針對(duì)9個(gè)新抗原表位的免疫反應(yīng)。多項(xiàng)臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果[8，44]顯示，真正能激發(fā)機(jī)體特異性免疫應(yīng)答的新抗原不足突變總量的1%。

目前，基于人工智能的算法能夠快速聚焦，節(jié)省成本，如Neon Therapeutics 公司開(kāi)發(fā)的RECONTMBioinformatics Engine 和Gritstone Oncology 公司開(kāi)發(fā)的EDGE人工智能分析平臺(tái)。但由于缺乏海量的數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證，人工智能算法還需要進(jìn)一步發(fā)展和完善。

4.4 生產(chǎn)周期與成本

與化學(xué)藥物和抗體藥物等的生產(chǎn)方式不同，免疫治療常常具有個(gè)性化的特點(diǎn)，其制備周期往往較長(zhǎng)。以目前制備體系較為成熟的個(gè)性化CAR-T 細(xì)胞為例，其平均生產(chǎn)周期在2～4 周，有超過(guò)30%的患者最終無(wú)法接受治療。新抗原腫瘤疫苗的個(gè)性化程度更高，其制備流程從采集腫瘤標(biāo)本、測(cè)序、生物信息學(xué)分析至疫苗制備，一般需要3～5 個(gè)月[26，31]，很多晚期腫瘤患者等不到疫苗的“出世”便已經(jīng)遺憾離世。如何縮短個(gè)性化新抗原腫瘤疫苗的制備周期是其投入臨床應(yīng)用迫切需要解決的問(wèn)題[45]。

此外，高度個(gè)性化的新抗原腫瘤疫苗通常需要“一對(duì)一”定制，導(dǎo)致其制備成本高昂，令絕大多數(shù)腫瘤患者家庭望而卻步，同時(shí)還要面對(duì)預(yù)測(cè)失敗而導(dǎo)致疫苗“無(wú)效”的風(fēng)險(xiǎn)。據(jù)粗略估算，一位患者的新抗原腫瘤疫苗的成本在6 萬(wàn)～10 萬(wàn)美元，同樣屬于個(gè)性化治療的CAR-T 細(xì)胞療法（Kymriah）的成本在4 萬(wàn)～10 萬(wàn)美元，新抗原腫瘤疫苗的定價(jià)應(yīng)該不會(huì)低于Kymriah。高昂的價(jià)格和漫長(zhǎng)的制備周期將會(huì)在很大程度上限制個(gè)性化新抗原腫瘤疫苗的臨床應(yīng)用。

4.5 療效評(píng)價(jià)體系

腫瘤治療性疫苗，包括新抗原腫瘤疫苗，屬于主動(dòng)性免疫療法，具有其特殊的藥物動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)，疫苗本身的有效成分（新抗原）激發(fā)和誘導(dǎo)機(jī)體自身產(chǎn)生的特異性T 細(xì)胞或抗體等免疫效應(yīng)物質(zhì)而發(fā)揮抗腫瘤作用需要一定的時(shí)間，在此期間，患者甚至可能表現(xiàn)出因炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)而帶來(lái)的腫瘤假性進(jìn)展的現(xiàn)象。

對(duì)于腫瘤治療性疫苗的療效評(píng)估中的免疫學(xué)檢測(cè)，目前應(yīng)用的大多是間接反映免疫應(yīng)答產(chǎn)生并發(fā)揮效能的指標(biāo)，如一些細(xì)胞因子的分泌等。盡管目前有免疫相關(guān)反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)來(lái)評(píng)價(jià)腫瘤免疫療法的療效[46-47]，但還缺乏一些可測(cè)量的直接的免疫學(xué)效應(yīng)指標(biāo)，以及可提示臨床療效的可靠免疫應(yīng)答生物標(biāo)志物來(lái)監(jiān)測(cè)疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答反應(yīng)。尤其是當(dāng)患者出現(xiàn)腫瘤假性進(jìn)展時(shí)，具有預(yù)測(cè)價(jià)值的標(biāo)志物更為至關(guān)重要，其直接決定患者下一步治療方案的制定。

從現(xiàn)有的腫瘤治療性疫苗的臨床試驗(yàn)中觀察到，以WHO 或RECIST 療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)來(lái)評(píng)價(jià)疫苗的療效并不完全客觀。腫瘤治療性疫苗的安全性優(yōu)于其他治療方式，引發(fā)的免疫應(yīng)答反應(yīng)持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，在短期應(yīng)答和腫瘤消退方面可能并不顯著，但對(duì)延長(zhǎng)患者OS 貢獻(xiàn)明顯。對(duì)于腫瘤治療性疫苗的療效，以O(shè)S 聯(lián)合其他的免疫指標(biāo)作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)更為科學(xué)和客觀。

5 未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)與研究策略

5.1 尋找通用型新抗原

新抗原為基礎(chǔ)的疫苗是一種高度個(gè)性化的新型治療方法。由于突變的隨機(jī)性，每一個(gè)個(gè)體的和每一種腫瘤突變產(chǎn)生的新抗原幾乎是獨(dú)一無(wú)二的[48]，高度特異性的優(yōu)勢(shì)同時(shí)也伴隨著制備周期長(zhǎng)和生產(chǎn)成本高的劣勢(shì)，大大限制了其臨床應(yīng)用。是否也如同目前科學(xué)家所熱衷研發(fā)的第五代CAR-T 細(xì)胞即通用型CAR-T 細(xì)胞一樣，尋找及制備通用型新抗原，從而使通用型新抗原疫苗的“貨架產(chǎn)品”成為可能。

實(shí)際情況是，在不同患者之間存在通用型新抗原的概率非常小，不同腫瘤個(gè)體出現(xiàn)相同新抗原的概率不到0.005%。一項(xiàng)大規(guī)模的研究結(jié)果[49]顯示，在大約20 000 個(gè)惡性黑色素瘤標(biāo)本中只發(fā)現(xiàn)了21種新抗原，在其中存在通用型抗原的概率則更低。雖然結(jié)果有些令人沮喪，但依然能夠從中發(fā)現(xiàn)一些規(guī)律和啟示。

驅(qū)動(dòng)基因是與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的關(guān)鍵必需基因。如果驅(qū)動(dòng)基因發(fā)生突變并產(chǎn)生新抗原，那么同一腫瘤病灶內(nèi)幾乎所有腫瘤細(xì)胞都可能表達(dá)該新抗原，以此推測(cè)，誘導(dǎo)針對(duì)該新抗原的特異性殺傷性T細(xì)胞就有可能完全清除該腫瘤。遺憾的是，驅(qū)動(dòng)基因突變很少產(chǎn)生新抗原，目前已知絕大部分（92%）的新抗原來(lái)自非驅(qū)動(dòng)基因突變，而只有8%的新抗原來(lái)自驅(qū)動(dòng)基因突變[1]。盡管數(shù)量少、概率低，但這些驅(qū)動(dòng)基因突變產(chǎn)生的新抗原確實(shí)展現(xiàn)了其應(yīng)用價(jià)值，如KRAS（G12D）、TP53（R175H）[50-51]、IDH1（R132H）[27]等，并且已經(jīng)得到了驗(yàn)證[50，52-54]。而且，這些突變?cè)谀[瘤中并不罕見(jiàn)，如KRAS（G12D）突變?cè)谝认賹?dǎo)管癌中占33.8%，在膽管癌中占10.9%，在直腸癌中占12.0%[55]。基于驅(qū)動(dòng)基因突變產(chǎn)生的通用型新抗原制備的腫瘤疫苗可能成為“貨架產(chǎn)品”，顯著縮短了制備時(shí)間和成本，給特定基因突變的患者人群提供快速有效的治療[56-57]，因此可能成為新抗原腫瘤疫苗未來(lái)發(fā)展的一個(gè)重要方向。

5.2 提高預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性

目前的新抗原預(yù)測(cè)算法應(yīng)用還比較局限，以預(yù)測(cè)MHCⅠ類(lèi)分子抗原表位為主，且不同的平臺(tái)算法不一，準(zhǔn)確性各異。新抗原預(yù)測(cè)算法需要進(jìn)一步統(tǒng)一化和標(biāo)準(zhǔn)化，并納入基因融合、缺失、插入等影響因素，同時(shí)也要加大MHCⅡ類(lèi)分子新抗原的比重，尋找與發(fā)現(xiàn)非編碼區(qū)新抗原等[58]。研究[59-62]發(fā)現(xiàn)，CD4+T細(xì)胞對(duì)新抗原腫瘤疫苗的反應(yīng)也具有至關(guān)重要甚至決定性的作用，提高其相關(guān)分子新抗原的篩選比重也有助于提升預(yù)測(cè)的效率和準(zhǔn)確性[63]。

此外，通過(guò)大數(shù)據(jù)和人工智能分析，一些經(jīng)驗(yàn)證的具有強(qiáng)免疫原性新抗原的共同特征逐漸被挖掘，如新抗原與MHC形成復(fù)合物的穩(wěn)定性高[64]、突變位點(diǎn)暴露于可溶性環(huán)境中更易被TCR 識(shí)別[8]、新抗原表位疏水性高的更易被提呈和識(shí)別[65-67]等。隨著新抗原預(yù)測(cè)和鑒定技術(shù)的發(fā)展，新抗原的共同特征經(jīng)過(guò)整合，再結(jié)合人工智能平臺(tái)，將極大地推動(dòng)通用型新抗原的發(fā)現(xiàn)，進(jìn)而擴(kuò)大新抗原疫苗的適用人群和范圍[68-69]。

5.3 優(yōu)化疫苗設(shè)計(jì)

盡管已有研究證實(shí)，單一的新抗原即可激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗腫瘤免疫應(yīng)答，并取得良好的療效[70-71]，但是單一新抗原可能很快會(huì)引起腫瘤免疫逃逸、形成免疫耐受，導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)。因此，采用多表位疫苗可以覆蓋更廣泛的腫瘤細(xì)胞，降低免疫逃逸的可能性[72-74]。

此外，免疫佐劑具有增強(qiáng)免疫原性、改變免疫反應(yīng)類(lèi)型、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)強(qiáng)度等作用，是腫瘤疫苗重要組成部分[75]。常見(jiàn)的佐劑有Montanide、Poly-ICLC、CPG-ODN、STING 激動(dòng)劑等。新型佐劑的出現(xiàn)無(wú)疑增加了疫苗的應(yīng)用范圍及效能，如熱激蛋白家族的HSP70L1分子所具有的Th1型佐劑樣效應(yīng)可以顯著增強(qiáng)抗原的MHCⅠ類(lèi)分子提呈，同時(shí)還有刺激DC成熟的效應(yīng)[76]。腫瘤治療性疫苗與不同的佐劑配伍，或與不同的佐劑組合聯(lián)用，可能會(huì)有不同的效果，借助佐劑發(fā)揮疫苗最大的效應(yīng)，也是提高新抗原免疫原性的重要策略[22]。

5.4 探索聯(lián)合治療方案

聯(lián)合治療才是治愈腫瘤的有效方式已經(jīng)成為共識(shí)。鑒于腫瘤治療性疫苗本身的作用機(jī)制，其可以和多種治療手段相配合，并成為優(yōu)秀的抗腫瘤“助手”[77-79]。例如，腫瘤治療性疫苗可以誘導(dǎo)抗腫瘤特異性T 細(xì)胞的產(chǎn)生，為PD-1 單抗等免疫檢查點(diǎn)抑制劑提供更多的“兵源”，發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤的效應(yīng)[80-81]；在與化療聯(lián)用時(shí)，可以降低化療藥物的劑量和不良反應(yīng)的發(fā)生率，提高患者的生活質(zhì)量；和靶向藥物聯(lián)用可通過(guò)減小腫瘤負(fù)荷及瘤內(nèi)壓力獲得更好療效。

在一項(xiàng)新抗原疫苗聯(lián)合化療治療腦膠質(zhì)瘤的臨床試驗(yàn)[82]中，患者接受靶向pp65 的DC 疫苗與劑量強(qiáng)化的替莫唑胺聯(lián)合治療后，中位PFS 達(dá)到了25.3 個(gè)月，OS達(dá)到了41.1個(gè)月，兩者都遠(yuǎn)高于初診膠質(zhì)瘤患者的中位OS（小于15 個(gè)月）。另一項(xiàng)新抗原mRNA 疫苗與PD-1 抑制劑派姆單抗（pembrolizumab）聯(lián)合治療20 例不可切除的晚期實(shí)體瘤患者的臨床試驗(yàn)[83]中，觀察到5 例PR（包括2 例先前接受免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療的患者）、6 例SD。目前，多項(xiàng)臨床研究數(shù)據(jù)[84-87]均表明，新抗原腫瘤疫苗與免疫檢查點(diǎn)抑制劑等療法聯(lián)用，可延緩和控制腫瘤的進(jìn)展，比單一的治療方式產(chǎn)生更大的臨床益處，是未來(lái)腫瘤治療的重要發(fā)展方向。

總的來(lái)說(shuō)，腫瘤新抗原疫苗可能是取得腫瘤治療長(zhǎng)期療效的下一個(gè)首選聯(lián)合伙伴。它具有較低的生物毒性和良好的安全性，可以很容易地與現(xiàn)有的其他腫瘤治療方法結(jié)合起來(lái)，并發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)[88-89]。

隨著腫瘤和免疫相互作用機(jī)制的深入理解，腫瘤新抗原疫苗將開(kāi)啟精準(zhǔn)治療的新時(shí)代。盡管個(gè)性化新抗原腫瘤疫苗的研發(fā)和應(yīng)用還存在諸多的挑戰(zhàn)，但是隨著對(duì)新抗原預(yù)測(cè)研究的持續(xù)深入和驗(yàn)證數(shù)據(jù)庫(kù)不斷積累，以及DC疫苗、mRNA疫苗等不同路徑的嘗試已經(jīng)在臨床上得到積極驗(yàn)證，新抗原腫瘤疫苗的研發(fā)腳步正在不斷加快，預(yù)計(jì)未來(lái)幾年將迎來(lái)飛速發(fā)展，給廣大腫瘤患者帶來(lái)福音。