劉秀盈，馮婭茹，周雅婷，王建勛,2（.北京中醫(yī)藥大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，北京 02488;2.深圳北京中醫(yī)藥大學(xué)研究院，廣東 深圳 588）

嵌合抗原受體基因修飾T（CAR-T）細(xì)胞療法是將T 細(xì)胞進(jìn)行改造，使其表達(dá)一個(gè)包括抗原識別域、共刺激域和T 細(xì)胞激活域的融合蛋白，經(jīng)過改造的CAR-T細(xì)胞可以特異性識別并消除表達(dá)靶抗原的腫瘤細(xì)胞，這項(xiàng)免疫療法被譽(yù)為未來腫瘤治療的希望[1-2]。2020年修訂的《中國多發(fā)性骨髓瘤診治指南》在難治復(fù)發(fā)多發(fā)性骨髓瘤治療中增加了CAR-T細(xì)胞療法[3]。人類CD38 抗原是一種Ⅱ型穿膜糖蛋白，在各種類型血液腫瘤細(xì)胞中表達(dá)[4-5]，但也存在于T細(xì)胞表面，因此這些T 細(xì)胞在CAR-T 細(xì)胞治療過程中可能發(fā)生自殺，影響抗CD38 CAR-T 細(xì)胞的抗腫瘤效果[5-8]。載體介導(dǎo)的短發(fā)夾狀RNA（short hairpin RNA，shRNA）通過RNA干擾誘導(dǎo)穩(wěn)定的靶向特異性抑制，由聚合酶Pol Ⅲ啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。shRNA長度相對較短，便于設(shè)計(jì)，具有較強(qiáng)的抑制效率和維持時(shí)間，容易被克隆并包裝進(jìn)入表達(dá)載體，在基因編輯領(lǐng)域有很廣泛的應(yīng)用[9-10]。本研究在實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建成功的抗CD38 CAR-T細(xì)胞[11]的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了shRNA靶向抑制CD38 的抗CD38 CAR-T 細(xì)胞，并對其增殖和抗腫瘤能力進(jìn)行觀察，旨在為抗CD38 CAR-T細(xì)胞療法治療血液腫瘤提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系及主要試劑

逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞系以及人多發(fā)性骨髓瘤外周血B淋巴細(xì)胞RPMI-8226-luc購自美國ATCC細(xì)胞庫，人Burkitt 淋巴瘤細(xì)胞Raji-luc購自北京維通達(dá)生物技術(shù)有限公司。RPMI 1640 培養(yǎng)基、AIM-Ⅴ培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）及PBS 均購自美國Gibco 公司，F(xiàn)u Gene HD 轉(zhuǎn)染試劑購自美國Promega 公司，淋巴細(xì)胞分離液購自北京友誼中聯(lián)生物科技有限公司，IL-2、CD3 單克隆抗體（OKT-3）購自北京義翹神州科技股份有限公司，MluⅠ酶、NotⅠ酶、T4 連接酶、DH-5α感受態(tài)和質(zhì)粒提取試劑盒、熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒、SYBR Green PCR 試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京蘭博利德科技有限公司，膠回收試劑盒、RNA提取試劑盒購自上海優(yōu)寧維公司，IFN-γ ELISA試劑盒購自北京百諾威生物公司，MYC-PE、CD38-APC、CD3-APC、PD-1-PE等抗體均購自美國BD公司。

1.2 shRNA靶向抑制CD38的抗CD38 CAR分子構(gòu)建

實(shí)驗(yàn)室前期通過噬菌體展示技術(shù)篩選出親和力較強(qiáng)的Anti-CD38-CAR，其結(jié)構(gòu)為經(jīng)典的第二代CAR 分子結(jié)構(gòu)，將CD38 ScFv、CD8 鉸鏈區(qū)和穿膜區(qū)、CD28 胞內(nèi)區(qū)和CD3ζ 胞內(nèi)區(qū)依次串聯(lián)而成。通過GPP Web Portal 網(wǎng)址設(shè)計(jì)靶向CD38 CAR-T 的shRNA 序列，挑選評分最高的兩條序列，并設(shè)計(jì)一段不針對任何靶點(diǎn)的無意義RNA 序列作為對照（shR-NC），在之前串聯(lián)U6啟動(dòng)子序列，由通用生物公司合成。由此構(gòu)建shRNA靶向抑制CD38的抗CD38 CAR分子，區(qū)別于添加了無意義RNA 序列的抗CD38 CAR（shR-NC-CD38 CAR），命名為shRNA1-CD38 CAR和shRNA2-CD38 CAR，具體分子結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 CAR分子結(jié)構(gòu)

1.3 pMFG-CD38 shRNA-MYC-CD38-CAR 質(zhì)粒載體構(gòu)建

shRNA 靶向抑制CD38 的抗CD38 CAR 分子構(gòu)建完成后，將序列與載體由MluⅠ和NotⅠ雙酶切，以凝膠電泳方式回收酶切后的目的片段與載體并純化，16 ℃條件下用T4 連接酶連接1 h。用DH-5α 感受態(tài)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，挑取單克隆加入有氨芐抗性的LB 培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)12～16 h。提取質(zhì)粒DNA，酶切鑒定正確后進(jìn)行測序，測序正確的質(zhì)粒載體被命名為pMFG-shR-NC-MYC-CD38-CAR、pMFG-shRNA1 CD38-MYC-CD38-CAR 和pMFGshRNA2 CD38-MYC-CD38-CAR。

1.4 原代T細(xì)胞提取

抽取健康志愿者外周血10 mL，采用Ficoll 密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），重懸于AIM-Ⅴ完全培養(yǎng)基（添加10%FBS和1%青-鏈霉素溶液），同時(shí)加入終質(zhì)量濃度為100 ng/mL OKT-3和100 U/mL IL-2 刺激T 細(xì)胞活化增殖，置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中無菌培養(yǎng)，此后每隔48 h 用含有100 U/mL IL-2的AIM-Ⅴ完全培養(yǎng)基傳代。

1.5 CAR-T細(xì)胞制備

將培養(yǎng)48 h后的原代T細(xì)胞分為未轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞、shR-NC-CD38 CAR-T、shRNA1-CD38 CAR-T 和shRNA2-CD38 CAR-T 細(xì)胞，共計(jì)4 組。將pMFGshR-NC-MYC-CD38-CAR、pMFG-shRNA1 CD38-MYC-CD38-CAR 和 pMFG-shRNA2 CD38-MYCCD38-CAR 質(zhì)粒載體分別包裝成逆轉(zhuǎn)錄病毒載體并轉(zhuǎn)導(dǎo)人原代T 細(xì)胞即為shR-NC-CD38 CAR-T、shRNA1-CD38 CAR-T 和shRNA2-CD38 CAR-T。未轉(zhuǎn)導(dǎo)T 細(xì)胞不做處理，正常傳代。轉(zhuǎn)導(dǎo)48 h 后用MYC-PE抗體通過FCM檢測MYC抗原表達(dá)，計(jì)算轉(zhuǎn)導(dǎo)效率（即MYC表達(dá)率）。轉(zhuǎn)導(dǎo)效率＝MYC-PE陽性細(xì)胞數(shù)/總活細(xì)胞數(shù)×100%。

1.6 qPCR 法檢測CAR-T 細(xì)胞CD38 mRNA 的相對表達(dá)水平

在轉(zhuǎn)導(dǎo)后24 h，3組細(xì)胞分別取5×106個(gè)活細(xì)胞提取RNA，電泳驗(yàn)證完整性后，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用SYBR Green進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)。qPCR采用兩步法，反應(yīng)條件：95 ℃2 min，95 ℃15 s，60 ℃30 s，共計(jì)40 個(gè)循環(huán)。引物序列：GAPDH 上游為CATGTT CGTCATGGGTGTGAACCA，下游為ATGGCATGG ACTGTGGTCATGAGT；CD38 上游為CGCCCCTAG GAAGAGAGGCAGAAAGAAGCT，下 游 為 ATC GATGCGGCCGCTCATTATC。以GAPDH作為內(nèi)參照基因，通過2-ΔΔCt方法計(jì)算CD38 mRNA的相對表達(dá)量。

1.7 顯微鏡計(jì)數(shù)法檢測CAR-T細(xì)胞的增殖能力

以提取PBMC當(dāng)天記為第0天，48 h時(shí)計(jì)數(shù)傳代1 次，維持細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL，單次增殖倍數(shù)為計(jì)數(shù)時(shí)細(xì)胞密度與上次計(jì)數(shù)時(shí)細(xì)胞密度的比值，增殖倍數(shù)為單次增殖倍數(shù)的乘積，第0天單次增殖倍數(shù)和增殖倍數(shù)均定為1。分別計(jì)算CAR-T 細(xì)胞體外培養(yǎng)0～14 d的增殖倍數(shù)，并繪制增殖曲線。

1.8 CFSE 染色法檢測CAR-T 細(xì)胞與靶細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)的增殖能力

將Raji-luc 和RPMI-8226-luc 細(xì)胞用CD38-APC抗體通過FCM 檢測其細(xì)胞表面CD38 陽性率。將兩種靶細(xì)胞用AIM-Ⅴ完全培養(yǎng)基（含IL-2）分別稀釋至密度4×104個(gè)/100 μL，取100 μL 接種于96 孔板實(shí)驗(yàn)孔。取CAR-T 細(xì)胞，采用CFSE（用AIM-Ⅴ培養(yǎng)基稀釋成10 μmol/mL）37 ℃避光染色30 min 后，調(diào)整細(xì)胞密度為1×104個(gè)/100μL；取100 μL加在鋪有靶細(xì)胞的孔中，即效靶比為1∶4。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，CD3-APC染色標(biāo)記T細(xì)胞，以單獨(dú)培養(yǎng)的T細(xì)胞為對照。通過CFSE信號強(qiáng)弱比較共培養(yǎng)后的細(xì)胞增殖情況，CFSE信號越弱（左移越明顯）表明其增殖能力越強(qiáng)。

1.9 熒光素酶化學(xué)發(fā)光法檢測CAR-T 細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷能力

將Raji-luc 和RPMI-8226-luc 細(xì)胞制備細(xì)胞懸液，參照1.8 的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)鋪板，CAR-T 細(xì)胞分別與Raji-luc和RPMI-8226-luc細(xì)胞以不同效靶比（1∶1、1∶2、1∶4、1∶8，4×104個(gè)/100μL靶細(xì)胞為1∶1）共培養(yǎng)，以僅有Raji-luc 細(xì)胞或RPMI-8226-luc 細(xì)胞的孔作為最大釋放孔，以只有培養(yǎng)基的孔作為空白孔。12 h后每孔加入100μL 配置好的熒光素酶底物，室溫避光培養(yǎng)3 min。設(shè)置化學(xué)發(fā)光模式（LUM），全白酶標(biāo)板，震板5 s，PMT=500。計(jì)算殺傷效率，殺傷效率=1-（實(shí)驗(yàn)孔細(xì)胞死亡率-空白孔細(xì)胞死亡率）/（最大釋放孔細(xì)胞死亡率-空白孔細(xì)胞死亡率）×100%。

1.10 ELISA 法檢測CAR-T 細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞時(shí)上清中IFN-γ水平

將CAR-T細(xì)胞與Raji-luc或RPMI-8226-luc細(xì)胞共培養(yǎng)12 h，效靶比為1∶1 和1∶4（4×104個(gè)/100μL 靶細(xì)胞為1∶1）。收集細(xì)胞后400×g離心5 min，吸取細(xì)胞上清，采用ELISA法檢測上清IFN-γ水平。

1.11 FCM檢測CAR-T細(xì)胞PD-1表達(dá)水平

取CAR-T 細(xì)胞懸液，400×g離心5 min，收集細(xì)胞。PBS 沖洗1 遍，CD3-APC、PD-1-PE 室溫避光染色60 min，PBS 沖洗后重懸在PBS 中，F(xiàn)CM檢測PD-1水平。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

以上主要實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次。采用GraphPad Prism 8統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05或P<0.01表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建shRNA-CD38 CAR-T細(xì)胞

病毒滴度檢測結(jié)果（圖2A）顯示，shR-NC-CD38 CAR、shRNA1-CD38 CAR 和shRNA2-CD38 CAR 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的滴度均有1×107拷貝/mL，滴度較高，可以進(jìn)行T細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。

FCM 檢 測 結(jié)果（圖2B）顯 示，shR-NC-CD38 CAR-T、shRNA1-CD38 CAR-T 和 shRNA2-CD38 CAR-T 三組和未轉(zhuǎn)導(dǎo)T 細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率分別為60.3%、67.0%、57.4%和0.1%。結(jié)果表明，CAR 分子在T細(xì)胞表面成功表達(dá)。

qPCR 法檢測結(jié)果（圖2C）顯示，shRNA2-CD38 CAR-T 組細(xì)胞中CD38 mRNA 的表達(dá)水平顯著低于shR-NC-CD38 CAR-T 組（P<0.01），shRNA1-CD38 CAR-T 組細(xì)胞中CD38 mRNA 的表達(dá)水平與shR-NC-CD38 CAR-T 組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果表明，shRNA2 序列設(shè)計(jì)成功，RNA干擾效果較好。

圖2 成功構(gòu)建shRNA-CD38 CAR-T細(xì)胞

2.2 Raji-luc和RPMI-8226-luc細(xì)胞表面高表達(dá)CD38

FCM檢測結(jié)果（圖3）顯示，Raji-luc或RPMI-8226-luc 細(xì)胞表面的CD38 陽性表達(dá)率分別為94.6%和92.0%。結(jié)果表明，此兩種血液腫瘤細(xì)胞株表達(dá)CD38的比例高，可以作為抗CD38 CAR-T細(xì)胞的靶細(xì)胞。

圖3 靶細(xì)胞表面CD38的表達(dá)水平

2.3 shRNA2-CD38 CAR-T細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng)

顯微鏡計(jì)數(shù)法實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖4A）發(fā)現(xiàn)，與shRNC-CD38 CAR-T 組比較，shRNA2-CD38 CAR-T 組細(xì)胞增殖倍數(shù)顯著升高（P<0.05），而shRNA1-CD38 CAR-T 組細(xì)胞增殖倍數(shù)差異比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

CFSE增殖實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果（圖4B）顯示，CAR-T細(xì)胞分別與Raji-luc 或RPMI-8226-luc 細(xì)胞共培養(yǎng)組與未進(jìn)行共培養(yǎng)處理組相比，共培養(yǎng)組細(xì)胞FITC 信號明顯左移。shRNA-CD38 CAR-T 細(xì)胞在靶細(xì)胞的刺激下增殖更快，說明它們均可以被靶細(xì)胞激活。

圖4 shRNA-CD38 CAR-T細(xì)胞的增殖情況

2.4 shRNA2-CD38 CAR-T細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞能力增強(qiáng)

熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖5A、B）顯示，靶細(xì)胞是Raji-luc或RPMI-8226-luc時(shí)，與shR-NC-CD38 CAR-T組比較，shRNA2-CD38 CAR-T 組細(xì)胞的殺傷效率明顯增強(qiáng)（P<0.01或P<0.05），而shRNA1-CD38 CAR-T組細(xì)胞的殺傷效率差異比較無明顯增強(qiáng)（P>0.05）。結(jié)果表明，shRNA2-CD38 CAR-T 組細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷能力更強(qiáng)。

2.5 shRNA2-CD38 CAR-T 細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞時(shí)上清中IFN-γ水平更高

ELISA 法檢測結(jié)果（圖5C、D）顯示，靶細(xì)胞是Raji-luc 或 者RPMI-8226-luc 時(shí)，與shR-NC-CD38 CAR-T 組比較，shRNA2-CD38 CAR-T 組細(xì)胞IFN-γ釋放量顯著升高（P<0.01），而shRNA1-CD38 CAR-T組差異比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果表明，shRNA2-CD38 CAR-T組細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞時(shí)IFN-γ的釋放水平更高。

圖5 shRNA-CD38 CAR-T細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的效率及IFN-γ釋放量

2.6 shRNA2-CD38 CAR-T細(xì)胞表面PD-1 表達(dá)水平顯著下降

FCM 檢測結(jié)果（圖6）顯示，與shR-NC-CD38 CAR-T 組比較，shRNA2-CD38 CAR-T 組細(xì)胞PD-1表達(dá)水平顯著下降（P<0.05），與未轉(zhuǎn)導(dǎo)的普通T細(xì)胞表達(dá)水平相近（P>0.05），而shRNA1-CD38 CAR-T組PD-1 表達(dá)水平無明顯變化（P>0.05）。結(jié)果表明，shRNA2-CD38 CAR-T 組比shRNA1-CD38 CAR-T 組細(xì)胞耗竭的水平更低。

圖6 shRNA-CD38 CAR-T細(xì)胞表面PD-1表達(dá)水平

3 討論

近年來，B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、復(fù)發(fā)性急性淋巴細(xì)胞白血病等各種類型的血液腫瘤病死率不斷攀升，盡管開發(fā)了許多治療方法，包括放化療、蛋白酶體抑制劑、免疫調(diào)節(jié)劑、耗竭性抗體和自體干細(xì)胞移植等，但是仍很難治愈這些疾病，大多數(shù)患者最終都會復(fù)發(fā)。2021 年6 月中國國家藥品監(jiān)督管理局（NMPA）最新公示，復(fù)星凱特CD19 CAR-T細(xì)胞治療產(chǎn)品益基利侖賽注射液（又稱阿基侖賽，代號：FKC876）已正式獲得批準(zhǔn)。這款細(xì)胞治療產(chǎn)品將用于治療二線或以上系統(tǒng)性治療后復(fù)發(fā)或難治性大B細(xì)胞淋巴瘤成人患者，包括彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）非特指型、原發(fā)性縱隔B細(xì)胞淋巴瘤、高級別B細(xì)胞淋巴瘤和濾泡淋巴瘤轉(zhuǎn)化的DLBCL。早在2018 年8 月，該產(chǎn)品就已在歐洲獲批準(zhǔn)上市。隨著抗CD19 CAR-T 細(xì)胞療法在B 細(xì)胞異常引起的惡性血液腫瘤治療中獲得成功，其他血液腫瘤的治療研究也陸續(xù)展開。多項(xiàng)研究表明，抗CD38 CAR-T細(xì)胞對各種血液系統(tǒng)惡性腫瘤有顯著的細(xì)胞毒性[12-13]；但因?yàn)門 細(xì)胞自身表達(dá)CD38，這在一定程度上影響了靶向CD38 的CAR-T細(xì)胞的抗腫瘤效能[14-15]。有研究結(jié)果[5，16]顯示，采用抗體封閉預(yù)處理CD38 CAR-T 細(xì)胞后，CAR-T 細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)，而耗竭因子PD-1 表達(dá)下降。腫瘤中耗竭性T 細(xì)胞常見的高表達(dá)的胰島素受體底物包括PD-1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3 和T 細(xì)胞免疫球蛋白和TIM結(jié)構(gòu)域（TIGIT）等，這些在免疫反應(yīng)中具有抑制性免疫調(diào)節(jié)作用的位點(diǎn)，也被稱為免疫檢查點(diǎn)。PD-1 及其配體（PD-L1）是T 細(xì)胞耗竭中最主要的抑制性受體，兩者的相互作用可以抑制下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和T 細(xì)胞的生物學(xué)功能，包括細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性，這種相互作用導(dǎo)致腫瘤特異性T細(xì)胞耗竭和凋亡，從而限制其抗腫瘤作用[17]，故而通過檢測T細(xì)胞表面的PD-1的表達(dá)水平可以評估細(xì)胞的耗竭狀態(tài)。

本研究在前期實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的抗CD38 CAR-T 細(xì)胞的基礎(chǔ)上，通過RNA 干擾技術(shù)，構(gòu)建了shRNA 靶向抑制CD38的抗CD38 CAR分子，通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體進(jìn)行包裝并成功轉(zhuǎn)導(dǎo)人原代T 細(xì)胞，成功構(gòu)建shRNA-CD38 CAR-T細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，shRNA2-CD38 CAR-T 組細(xì)胞CD38 mRNA 的表達(dá)水平顯著低于shR-NC-CD38 CAR-T 組細(xì)胞，而shRNA1-CD38 CAR-T組與shR-NC-CD38 CAR-T組細(xì)胞CD38 mRNA表達(dá)水平差異比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果表明shRNA2 序列靶向性更強(qiáng)，RNA 干擾成功，shRNA2-CD38 CAR-T組細(xì)胞CD38表達(dá)被抑制。同時(shí)在體外培養(yǎng)的條件下，shRNA2-CD38 CAR-T 細(xì)胞的增殖明顯優(yōu)于shR-NC-CD38 CAR-T 細(xì)胞，且在CD38 陽性的靶細(xì)胞共培養(yǎng)的刺激下增殖增快。為了驗(yàn)證shRNA-CD38 CAR-T 細(xì)胞殺傷CD38 陽性腫瘤細(xì)胞的能力，本研究選用了2 種CD38 陽性表達(dá)的細(xì)胞模型，即Raji-luc 和RPMI-8226-luc 細(xì)胞。研究結(jié)果顯示，shRNA2-CD38 CAR-T 細(xì)胞對2 種腫瘤細(xì)胞的殺傷效率均強(qiáng)于shR-NC-CD38 CAR-T 組，此結(jié)果也可以在IFN-γ 水平檢測實(shí)驗(yàn)中得到驗(yàn)證。結(jié)合shRNA2-CD38 CAR-T 組 比shR-NC-CD38 CAR-T 組的PD-1表達(dá)水平有所下降，提示抑制CAR-T細(xì)胞自身CD38 表達(dá)可以提高其增殖和殺傷腫瘤細(xì)胞的能力，可能是通過減少T細(xì)胞“自殺”及減緩耗竭起作用的，這與此前的通過抗體封閉的一項(xiàng)研究[16]得出的結(jié)果相一致。但本研究構(gòu)建的CAR-T細(xì)胞無需進(jìn)行預(yù)處理，過程更加簡便，且未來無需在人體實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行抗體封閉濃度和時(shí)間的摸索。

CD38作為近年來CAR-T細(xì)胞研究的熱門靶點(diǎn)，其抗腫瘤作用已經(jīng)得到驗(yàn)證，目前的研究重點(diǎn)在于減少T 細(xì)胞被“自殺”的方法[18]。本研究通過shRNA技術(shù)，成功構(gòu)建一種shRNA 靶向抑制CD38 的抗CD38 CAR-T 細(xì) 胞，為 抗CD38 CAR-T 細(xì) 胞 走 出“CAR-T 細(xì)胞-自噬和自我刺激”循環(huán)提供一種新的方法，有助于在后續(xù)的研究中進(jìn)一步增強(qiáng)抗CD38 CAR-T細(xì)胞的擴(kuò)增、持久性和抗癌功能。