柯超，周紅見，蔣斌，謝興旺，張超（武漢市第三醫(yī)院 胃腸腹壁與疝外科，湖北 武漢 430061）

結(jié)直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤之一。關(guān)于結(jié)直腸癌的治療方法以外科手術(shù)、放療等為主，雖然提高了患者5 年生存率，但是其遠處轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等仍影響患者的治療效果[1-2]。腫瘤干細胞具有自我更新、多向分化、耐藥、高度致瘤等特性，被認為是腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的種子細胞[3]。目前，眾多學者致力于研究腫瘤干細胞和miRNA 調(diào)控作用，包括如何有效地抑制腫瘤干細胞的發(fā)展，以達到治療腫瘤的目的[4-5]。研究結(jié)果[6]顯示，miRNA（如miR-19、miR-501-5p和miR-744）與腫瘤干細胞發(fā)展有關(guān)。miR-502-3p在胃癌、肺癌等腫瘤中表達失調(diào)，與腫瘤細胞增殖、凋亡等有關(guān)[7-8]，但是對結(jié)直腸癌干細胞（colorectal cancer stem cell，CCSC）的研究報道尚不清楚。GTP結(jié)合蛋白2（GTP-binding protein 2，GTPBP2）是蛋白質(zhì)合成GTP酶超家族成員，廣泛存在于人體的胰腺、胃、小腸等，且表達水平較高[9]，關(guān)于GTPBP2 對CCSC的作用機制尚不明確。鑒于此，本課題用免疫磁珠實驗從結(jié)直腸癌HCT116 細胞中分選出CCSC，探討miR-502-3p 是否通過調(diào)控GTPBP2 基因影響CCSC 增殖、周期和凋亡的分子機制，旨在為結(jié)直腸癌診斷和治療提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞和主要試劑

結(jié)直腸癌細胞HCT116購于中科院上海細胞庫。胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基購于上海聯(lián)碩生物科技有限公司，表皮生長因子（bFGF）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）購于美國Pepro Tech公司，小鼠抗人CD133和CD44 抗體購于德國Miltenyi 公司，Lipofectamine 2000 試劑盒購于上海研卉生物科技有限公司，miR-NC、miR-502-3p、si-miR-NC、si-miR-502-3p、空載體vector、GTPBP2 過表達載體和引物由上海生工公司設(shè)計合成，TRIzol試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR（qPCR）試劑盒購于日本TaKaRa 公司，MTT試劑盒、BCA試劑盒、電化學發(fā)光液購于北京索萊寶公司，細胞凋亡檢測試劑盒和細胞周期檢測試劑盒購于江蘇凱基生物公司，Ki67抗體、CDK1抗體、Bcl2抗體、BAX 抗體、GTPBP2 抗體、GAPDH 抗體購于美國Abcam 公司，辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG、熒光素酶報告基因檢測試劑盒購于艾美捷科技有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)和分選

結(jié)直腸癌HCT116 細胞在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞生長匯合度達85%時，加入胰酶進行消化并制備細胞懸液。將結(jié)直腸癌細胞接種于含有2%B27、20 μg/L EGF、20 μg/L bFGF、不含血清的完全培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，觀察細胞成球情況，用第3代細胞與小鼠抗人CD133 和CD44 抗體包被的磁珠進行培養(yǎng)，采用流式細胞術(shù)分選出雙陽性細胞（CD133+CD44+）和雙陰性細胞（CD133-CD44-）。并檢測CD133+CD44+細胞的表達率。

1.3 細胞轉(zhuǎn)染及分組

將CD133+CD44+細胞接種至6 孔板中（2×105個/孔），參照Lipofectamine 2000試劑盒說明書的方法將miR-NC、miR-502-3p、si-miR-NC、si-miR-502-3p、miR-502-3p+vector 和miR-502-3p+GTPBP2 轉(zhuǎn) 染 至CD133+CD44+細胞中，分別記為miR-NC組、miR-502-3p組、si-miR-NC 組、si-miR-502-3p 組、miR-502-3p+vector組和miR-502-3p+GTPBP2組。轉(zhuǎn)染6 h后更換細胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h后進行后續(xù)實驗。

1.4 qPCR法檢測CCSC 中miR-502-3p 和GTPBP2 mRNA的表達

取CD133-CD44-細胞和CD133+CD44+細胞，以及轉(zhuǎn)染成功的各組細胞按照TRIzol法提取細胞中總RNA，檢測濃度和純度后，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，將cDNA 根據(jù)qPCR 試劑盒說明書步驟進行PCR 擴增反應(yīng)。引物序列：miR-502-3p 上游為5′-ACACTC CAGCTGGGAATGCACCTGGGCAAGG-3′，下游為5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′；U6上游為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游為5′-AACGCT TCACGAATTTGCGT-3′ ；GTPBP2上游為5′-CTG GCTGAGGAGGAAATG-3′，下游為5′-CACACG GAGGTCTAGGAAC-3′；GAPDH上游為5′-GAA GGTGAAGGTCGGAGT-3′，下游為5′-GAAGAT GGTGATGGGATTTC-3′。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃30 s；95 ℃5 s，60 ℃30 s，共循環(huán)35次。以U6、GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計算miR-502-3p和GTPBP2 mRNA的相對表達量。

1.5 MTT法檢測CCSC的增殖率

將各組CD133+CD44+細胞接種至96孔板中（5×103個/孔），繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每孔加入10 μL MTT試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，清除培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO試劑。酶標儀檢測波長490 nm處每孔光密度（D）值，計算細胞增殖率（實驗組D值/對照組D值×100%）。

1.6 流式細胞術(shù)檢測CCSC細胞周期和凋亡水平

細胞周期實驗：將miR-NC 組、miR-502-3p 組、miR-502-3p+vector 組、miR-502-3p+GTPBP2 組CD133+CD44+細胞接種至6孔板中（5×105個/孔），PBS清洗后，1 200×g離心5 min后收集上清液，加入乙醇溶液，固定過夜。棄去乙醇溶液，加入PI和RNA酶，避光反應(yīng)15～30 min，上流式細胞儀檢測細胞周期變化。

細胞凋亡實驗：取各組CD133+CD44+細胞（同細胞周期實驗），離心后棄去上清液，采用預(yù)冷PBS 進行清洗，加入PBS重懸細胞，然后與各5 μL的Annexin Ⅴ-FITC和PI染液混勻，避光反應(yīng)15～30 min，置于流式細胞儀檢測細胞凋亡水平。

1.7 WB 法檢測CCSC 中Ki67、CDK1、Bcl2、BAX 和GTPBP2蛋白的表達

取各組CD133+CD44+細胞用蛋白裂解液提取細胞中總蛋白，BCA 法檢測蛋白濃度，水浴煮沸反應(yīng)5 min，以每孔35 μg蛋白上樣，行SDS-PAGE，用半干法轉(zhuǎn)移分離的蛋白質(zhì)至PVDF 膜上，在含5%脫脂奶粉溶液中封閉2 h，在均以1∶1 000 稀釋的Ki67、CDK1、Bcl2、BAX、GTPBP2和GAPDH一抗中4 ℃過夜。次日在1∶2 500稀釋的HRP標記的山羊抗兔IgG二抗室溫下處理2 h，加入電化學發(fā)光液顯色，曝光。以GAPDH 作為內(nèi)參，應(yīng)用凝膠成像軟件掃描，分析蛋白條帶的灰度值。

1.8 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-502-3p 與GTPBP2的靶向關(guān)系

通過TargetScan 軟件預(yù)測miR-502-3p 和GTPBP2 之間是否存在互補核苷酸序列。將含有miR-502-3p 結(jié)合位點的GTPBP2 3′UTR 序列克隆至熒光素酶報告基因質(zhì)粒中，構(gòu)建GTPBP2 野生型（GTPBP2 3′UTR WT）和GTPBP2 突變型（GTPBP2 3′UTR MUT）載體。按照Lipofectamine 2000試劑盒說明書步驟與miR-NC 或miR-502-3p 共轉(zhuǎn)染至CD133+CD44+細胞中，6 h后更換細胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，按照熒光素酶試劑盒說明書步驟檢測轉(zhuǎn)染細胞的熒光素酶活性。

1.9 統(tǒng)計學處理

以上主要實驗均重復(fù)3次。采用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件分析實驗數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)以表示，兩組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，以P<0.05 或P<0.01 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-502-3p在CCSC中低表達

利用免疫磁珠分選技術(shù)，成功從結(jié)直腸癌HCT116細胞中獲得CD133-CD44-和CD133+CD44+細胞，CD133+CD44+細胞陽性率為94.35%。qPCR 法檢測結(jié)果顯示，CD133+CD44+細胞中miR-502-3p表達水平顯著低于CD133-CD44-細胞（0.36±0.05vs0.99±0.09，t=18.357，P<0.01），因此，后續(xù)實驗選擇CD133+CD44+細胞。

2.2 轉(zhuǎn)染miR-502-3p對CCSC增殖、周期、凋亡及相關(guān)蛋白表達的影響

轉(zhuǎn)染miR-502-3p 后，qPCR 法檢測結(jié)果顯示，miR-502-3p 組CD133+CD44+細胞中miR-502-3p 表達水平顯著高于miR-NC 組細胞（2.87±0.30vs1.00±0.07，t=18.211，P<0.01），表明成功建立miR-502-3p過表達細胞，可以進行后續(xù)實驗。

MTT 法、流式細胞術(shù)和WB 法檢測結(jié)果（表1、圖1）顯示，與miR-NC 組比較，miR-502-3p 組細胞增殖率、S 期細胞比例均顯著降低（均P<0.01），Ki67、CDK1 蛋白表達顯著降低（均P<0.01）；細胞凋亡率、G0/G1期細胞比例均顯著升高（均P<0.01），Bcl2蛋白表達顯著降低（P<0.01），BAX 蛋白表達顯著升高（P<0.01）。結(jié)果表明，上調(diào)miR-502-3p 可顯著抑制CCSC增殖、周期進展并誘導(dǎo)細胞凋亡。

表1 上調(diào)miR-502-3p對CCSC增殖、周期和凋亡的影響

圖1 上調(diào)miR-502-3p對CCSC細胞周期及Ki67、CDK1、Bcl2和BAX蛋白表達的影響

2.3 miR-502-3p靶向負調(diào)控GTPBP2表達

TargetScan軟件預(yù)測結(jié)果顯示，miR-502-3p 和GTPBP2 mRNA之間存在互補結(jié)合位點（圖2A）。雙熒光素酶實驗報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，與miR-NC組相比，miR-502-3p 與GTPBP2 3′UTR WT 載體共轉(zhuǎn)染細胞的熒光素酶活性顯著降低（0.41±0.06vs0.99±0.07，t=18.873，P<0.01），而與GTPBP2 3′UTR MUT載體共轉(zhuǎn)染細胞的熒光素酶活性無顯著改變（1.01±0.05vs0.98±0.06，t=1.152，P>0.05）。qPCR 和WB 實驗檢測結(jié)果（圖2B、C）顯示，與miR-NC 組比較，miR-502-3p 組細胞中GTPBP2 mRNA 和蛋白表達水平均顯著降低（t=25.378、17.819，均P<0.01）；與si-miR-NC 組比較，si-miR-502-3p 組細胞中GTPBP2 mRNA 和蛋白表達水平均顯著升高（t=29.601、12.348，均P<0.01）。結(jié)果表明，miR-502-3p靶向負調(diào)控GTPBP2表達。

圖2 miR-502-3p靶向負調(diào)控GTPBP2的表達

2.4 過表達GTPBP2可逆轉(zhuǎn)上調(diào)miR-502-3p對CCSC增殖、周期和凋亡的作用

轉(zhuǎn)染GTPBP2 后，qPCR、MTT、WB 和流式細胞術(shù)實驗結(jié)果（圖3、表2）顯示，與miR-502-3p+vector組比較，miR-502-3p+GTPBP2組細胞中GTPBP2 mRNA和蛋白的表達水平均顯著升高（均P<0.01），細胞增殖率、S 期細胞比例均顯著升高（均P<0.01），細胞凋亡率、G0/G1期細胞比例均顯著降低（均P<0.01），細胞中Ki67、CDK1、Bcl2蛋白表達均顯著升高（均P<0.01）、BAX 蛋白表達顯著降低（P<0.01）。實驗結(jié)果表明，過表達GTPBP2 可逆轉(zhuǎn)上調(diào)miR-502-3p 對CCSC 增殖、細胞周期和凋亡的作用。

表2 過表達GTPBP2可逆轉(zhuǎn)上調(diào)miR-502-3p對CCSC增殖、周期和凋亡的影響

圖3 過表達GTPBP2可逆轉(zhuǎn)上調(diào)miR-502-3p對CCSC的作用

3 討論

腫瘤干細胞是一群獨特的細胞亞群，因其具有高度致瘤性而參與腫瘤的發(fā)展，對腫瘤細胞分化、增殖、轉(zhuǎn)移等有重要的作用[10-12]。有研究結(jié)果[13]顯示，miRNA 與CCSC 發(fā)展有關(guān)，如miR-451a 在結(jié)直腸癌細胞中表達水平較低，過表達miR-451a降低了CCSC中Ki-67、cyclin D1的表達，抑制CCSC增殖。VILLANOVA 等[14]通過對CCSC 的功能研究發(fā)現(xiàn)，miR-1285 通過靶向調(diào)控細胞凋亡相關(guān)蛋白酶2 表達抑制細胞增殖和阻滯周期，誘導(dǎo)細胞凋亡。閻立昆等[15]研究發(fā)現(xiàn)，miR-1231 在CCSC 中表達水平降低，過表達miR-1231抑制結(jié)直腸癌細胞增殖、遷移，并促進細胞凋亡。關(guān)于miR-502-3p的研究主要集中在胃癌，如miR-502-3p 在胃癌細胞中低表達，過表達miR-502-3p 能抑制胃癌細胞增殖、遷移和侵襲并誘導(dǎo)細胞凋亡[16]，但是對CCSC的作用尚不清楚。本研究利用免疫磁珠分選技術(shù)，從結(jié)直腸癌HCT116細胞中分選出雙陰性細胞（CD133-CD44-）和雙陽性細胞（CD133+CD44+），qPCR法檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-502-3p在CD133+CD44+細胞中表達水平顯著低于CD133-CD44-細胞，說明miR-502-3p 與CCSC發(fā)展有關(guān)。將miR-502-3p 過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CD133+CD44+細胞后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細胞增殖率、S期細胞比例顯著降低，細胞凋亡率、G0/G1 期細胞比例顯著升高，細胞中Ki67、CDK1、Bcl2 蛋白表達下調(diào)、BAX 蛋白表達上調(diào)，說明上調(diào)miR-502-3p 抑制CCSC 增殖、阻滯細胞周期并誘導(dǎo)細胞凋亡，這與上述研究結(jié)果相似。

GTPBP2 是GTPase 家族四個家族成員之一，其存在于所有真核細胞中，位于人類染色體6p21-12區(qū)域，與蛋白合成、細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、骨架調(diào)節(jié)等密切相關(guān)，在人體卵巢、腦、胰腺、骨骼肌等組織中均有表達[10,17-18]。關(guān)于GTPBP2與腫瘤的研究相對較少，主要在人類遺傳學中研究較多[19]。最近的研究結(jié)果[20]顯示，GTPBP2 在非小細胞肺癌組織和細胞中表達上調(diào)，其高表達與患者TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)；敲低GTPBP2抑制非小細胞癌肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲。但是GTPBP2 在結(jié)直腸癌中的作用尚不清楚。本研究通過在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測發(fā)現(xiàn)，GTPBP2是miR-502-3p 靶基因，通過雙熒光素報告基因?qū)嶒灪蛁PCR實驗驗證二者的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-502-3p調(diào)控GTPBP2 的表達。上調(diào)miR-502-3p 降低CCSC中GTPBP2 mRNA和蛋白表達水平，下調(diào)miR-502-3p則上調(diào)GTPBP2 mRNA 和蛋白表達水平，結(jié)果表明miR-502-3p 靶向負調(diào)控GTPBP2 的表達。進一步實驗的結(jié)果顯示，過表達GTPBP2 可以部分逆轉(zhuǎn)上調(diào)miR-502-3p對CCSC增殖、細胞周期和凋亡的作用。

綜上所述，miR-502-3p 在CCSC 中表達下調(diào)，miR-502-3p 靶向負調(diào)控GTPBP2 的表達，從而抑制CCSC 的增殖和阻滯細胞周期并促進細胞凋亡。關(guān)于GTPBP2對CCSC作用的具體機制有待深入研究。