馬月,陳蕾蕾,謝俊霞

(青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系,山東 青島 266071)

帕金森病(PD)是發(fā)病率較高的神經(jīng)退行性疾病之一，其確切病因尚未完全闡明。研究證實(shí)，腦鐵代謝異常與α-突觸核蛋白的異常聚集在PD發(fā)病及進(jìn)程中起著重要作用，而溶酶體是細(xì)胞內(nèi)重要的儲(chǔ)鐵細(xì)胞器以及降解α-突觸核蛋白的主要場(chǎng)所，因此，溶酶體及自噬功能與PD發(fā)病密切相關(guān)[1-4]。轉(zhuǎn)錄因子EB(TFEB)是維持細(xì)胞自噬穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄因子[5]。大量PD細(xì)胞與動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)均證實(shí)TFEB在神經(jīng)退行性疾病中具有保護(hù)作用，提示TFEB可成為治療或改善PD并提供神經(jīng)保護(hù)作用的有效靶點(diǎn)[6-8]。雖然TFEB在神經(jīng)退行性疾病中的保護(hù)作用研究由來(lái)已久，但是以往研究主要側(cè)重于TFEB增強(qiáng)或改善自噬功能、清除α-突觸核蛋白等方面，對(duì)于TFEB在PD鐵死亡中的作用研究目前少見(jiàn)。本實(shí)驗(yàn)在PC12細(xì)胞上高表達(dá)TFEB，并給予鐵死亡誘導(dǎo)劑Erastin進(jìn)行處理，觀察光鏡下細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)并檢測(cè)鐵死亡重要調(diào)節(jié)因子谷胱甘肽過(guò)氧化酶4(GPX4)及鐵蛋白輕鏈(FTL)的表達(dá)水平，從鐵代謝的角度探究TFEB在對(duì)抗鐵死亡、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞中的可能作用，從而為PD治療提供新思路。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

所用PC12細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；DMEM培養(yǎng)液、胰蛋白酶購(gòu)自Hyclone公司；opti-MEM培養(yǎng)液、胎牛血清、馬血清、瞬時(shí)過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM3000購(gòu)自Thermo Fisher公司；PBS緩沖液、青霉素-鏈霉素混合液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；Erastin購(gòu)自Sigma公司；ECL發(fā)光液購(gòu)自Millipore公司；GPX4抗體和FTL抗體購(gòu)自abcam公司；TFEB抗體購(gòu)自Proteintech公司；β-actin抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；羊抗兔二抗購(gòu)自愛(ài)必信(上海)生物科技有限公司；空載體質(zhì)粒與過(guò)表達(dá)TFEB質(zhì)粒購(gòu)自廣州銳博生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組及處理 ①預(yù)實(shí)驗(yàn)：PC12細(xì)胞鋪板24 h后分別采用空載體質(zhì)粒和1、3、5、7 nmol/L濃度的過(guò)表達(dá)TFEB質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，并在光鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。繼續(xù)培養(yǎng)24 h(即轉(zhuǎn)染48 h)后收集細(xì)胞并提取蛋白，采用免疫印跡法檢測(cè)TFEB蛋白表達(dá)水平，以確定最適轉(zhuǎn)染條件。當(dāng)采用濃度為5 nmol/L的過(guò)表達(dá)TFEB質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)，TFEB蛋白表達(dá)水平上調(diào)最為明顯，且光鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)較好，因此選取該濃度作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中過(guò)表達(dá)TFEB質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞的轉(zhuǎn)染濃度。②細(xì)胞轉(zhuǎn)染及藥物處理：實(shí)驗(yàn)分為空載體組、高表達(dá)TFEB組、空載體+Erastin組、高表達(dá)TFEB+Erastin組。PC12細(xì)胞鋪板培養(yǎng)24 h后采用空載體質(zhì)?；蛘? nmol/L的過(guò)表達(dá)TFEB質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h后，給予或者不給予鐵死亡誘導(dǎo)劑Erastin(10 μmol/L)繼續(xù)處理24 h。

1.2.2光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征 細(xì)胞經(jīng)藥物處理后，在倒置顯微鏡(OLYMPUS IX73)明場(chǎng)模式下，采用10×10倍的放大倍數(shù)觀察并獲取10個(gè)不同視野的圖像，隨機(jī)選取3個(gè)視野的圖像進(jìn)行分析，記錄細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征和該視野中具備細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞數(shù)目。

1.2.3免疫印跡法檢測(cè)FTL和GPX4蛋白表達(dá)將藥物處理后的細(xì)胞用預(yù)冷的PBS漂洗1次，去除PBS后按5×105個(gè)細(xì)胞加50 μL裂解液(RIPA)的比例加入細(xì)胞裂解液，使用細(xì)胞刮收集各組細(xì)胞，置于冰上裂解30 min，在4 ℃下以12 000 r/min離心30 min，收集上清液。用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，加入上樣緩沖液后100 ℃金屬浴5 min使蛋白變性。配制SDS-PAGE凝膠，進(jìn)行電泳(恒壓80 V)、轉(zhuǎn)膜(恒流300 mA，90 min)。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后將印有蛋白的PVDF膜置于50 g/L脫脂奶粉封閉液中，室溫孵育2 h。封閉完成以后洗去封閉液，加入FTL(1∶1 000)、GPX4(1∶10 000)、β-actin(1∶10 000)、TFEB(1∶1 000)一抗，放至4 ℃恒溫?fù)u床孵育過(guò)夜。去除一抗后用TBST洗膜3次，每次10 min。加山羊抗兔(1∶10 000)的HRP-IgG二抗室溫孵育1 h，用TBST洗膜3次，每次10 min。將膜用發(fā)光液避光孵育1 min，采用美國(guó)UVP凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。用Image J軟件分析條帶灰度值，結(jié)果以目的蛋白(GPX4、FTL)與內(nèi)參照蛋白(β-actin)灰度值的比值表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 高表達(dá)TFEB對(duì)Erastin誘導(dǎo)鐵死亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征的影響

空載體組、高表達(dá)TFEB組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，呈多角形和梭形，細(xì)胞伸展，可見(jiàn)粗大的突起，折光性好?？蛰d體+Erastin組出現(xiàn)輕微細(xì)胞毒性與生長(zhǎng)抑制現(xiàn)象，細(xì)胞數(shù)目較少，小部分細(xì)胞折光性變差，細(xì)胞變圓，突起回縮，表面可見(jiàn)泡狀小體，細(xì)胞輪廓界限模糊。與空載體+Erastin組細(xì)胞相比較，高表達(dá)TFEB+Erastin組細(xì)胞較為伸展，突起輕微回縮，細(xì)胞出現(xiàn)輕微生長(zhǎng)抑制現(xiàn)象。

空載體組、高表達(dá)TFEB組、空載體+Erastin組、高表達(dá)TFEB+Erastin組的細(xì)胞數(shù)目分別為288.00±29.48、229.30±19.64、89.00±5.00、175.30±2.91(n=3)。與空載體組相比較，空載體+Erastin組細(xì)胞損傷明顯，存活的細(xì)胞數(shù)目少；與空載體+Erastin組相比，高表達(dá)TFEB+Erastin組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)較好，存活的細(xì)胞數(shù)目多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=22.2，P<0.05)。

2.2 高表達(dá)TFEB對(duì)細(xì)胞內(nèi)GPX4及FTL蛋白表達(dá)的影響

空載體組與高表達(dá)TFEB組細(xì)胞內(nèi)的GPX4蛋白表達(dá)水平分別為1.200±0.217、1.667±0.165(n=7)，與空載體組相比，高表達(dá)TFEB組細(xì)胞內(nèi)GPX4蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.194，P<0.05)?？蛰d體組與高表達(dá)TFEB組細(xì)胞內(nèi)FTL蛋白表達(dá)水平分別為0.872±0.106、1.631±0.150(n=3)，與空載體組相比較，高表達(dá)TFEB組細(xì)胞內(nèi)FTL蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.127，P<0.05)。

3 討 論

近年來(lái)，在對(duì)PD病因及機(jī)制的探索中逐漸證實(shí)，除蛋白質(zhì)異常聚集、線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等因素與PD發(fā)病密切相關(guān)外，黑質(zhì)區(qū)鐵異常沉積這一病理改變也參與PD的發(fā)生發(fā)展[9-13]。鐵是維持生物體基本生理功能的重要元素，隨著年齡增加，鐵會(huì)在腦中聚集，而這種聚集會(huì)在神經(jīng)退行性疾病尤其是PD中加劇[14-15]。在PD中，過(guò)量的鐵會(huì)形成羥自由基，進(jìn)而誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，增強(qiáng)多巴胺衍生的代謝毒性，并通過(guò)促進(jìn)α-突觸核蛋白表達(dá)和聚集而加劇多巴胺能神經(jīng)元退變[16-18]。鐵死亡是一種依賴于鐵的非凋亡性的細(xì)胞死亡方式，在1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)誘導(dǎo)的PD小鼠模型和過(guò)表達(dá)α-突觸核蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠模型中均發(fā)現(xiàn)了鐵死亡現(xiàn)象，而且鐵死亡抑制劑ferrostatin-1可以顯著抑制魚(yú)藤酮對(duì)多巴胺能神經(jīng)元的毒性[19-20]。這些研究均提示，鐵死亡參與了PD多巴胺能神經(jīng)元退變過(guò)程，抑制鐵死亡很有可能成為保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元、干預(yù)PD的有效策略之一。

雖然TFEB在PD中的保護(hù)作用已被大量研究證實(shí)，但是以往的研究主要側(cè)重于TFEB激活或改善自噬功能、清除α-突觸核蛋白方面，對(duì)于TFEB在PD鐵死亡中的作用研究較少。最近有文獻(xiàn)報(bào)道，羧基修飾的聚苯乙烯納米顆粒可以通過(guò)促進(jìn)TFEB核轉(zhuǎn)位、增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶表達(dá)、降低活性氧水平、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化來(lái)抑制鐵死亡[21]。然而，TFEB是否還可以通過(guò)其他途徑抑制鐵死亡，以及其與PD中鐵死亡發(fā)生的關(guān)系目前尚不清楚。

鐵死亡的標(biāo)志蛋白GPX4是一種內(nèi)源性的膜脂修復(fù)酶，在其催化下，谷胱甘肽可將具有潛在毒性的過(guò)氧化脂類還原為無(wú)毒的脂醇，從而阻止鐵死亡的發(fā)生，而當(dāng)鐵死亡發(fā)生時(shí)GPX4的表達(dá)降低[22]。PC12細(xì)胞來(lái)源于大鼠腎上腺髓質(zhì)的嗜鉻細(xì)胞瘤，當(dāng)神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)存在時(shí)，可以分化為交感神經(jīng)元[23-24]。PC12細(xì)胞可以合成和儲(chǔ)存多巴胺，因此也被廣泛用作神經(jīng)退行性疾病的細(xì)胞模型[25]。本實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)在PC12細(xì)胞上高表達(dá)TFEB時(shí)，GPX4蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)，從功能的角度直接驗(yàn)證了TFEB對(duì)抗鐵死亡、保護(hù)細(xì)胞的作用。Erastin是一種常用的鐵死亡誘導(dǎo)劑[26]，本實(shí)驗(yàn)中給予Erastin(10 μmol/L)處理細(xì)胞24 h，并通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察各組細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。本文研究結(jié)果表明，高表達(dá)TFEB可降低Erastin誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性，保護(hù)細(xì)胞免受鐵死亡的影響。另一方面，鐵死亡發(fā)生時(shí)會(huì)誘導(dǎo)鐵自噬，即鐵蛋白的降解，從而釋放鐵、增加細(xì)胞內(nèi)不穩(wěn)定鐵池，進(jìn)而增加細(xì)胞氧化水平[27]。鐵蛋白是機(jī)體用來(lái)儲(chǔ)存鐵的主要蛋白質(zhì)。鐵蛋白由FTL和鐵蛋白重鏈(FTH)組成，其中，F(xiàn)TH具有亞鐵氧化酶的活性，負(fù)責(zé)鐵的吸收，而FTL負(fù)責(zé)鐵的儲(chǔ)存。鐵蛋白的降解會(huì)導(dǎo)致鐵的釋放從而導(dǎo)致氧化損傷[28]，抑制鐵蛋白降解可以抑制Erastin誘導(dǎo)的鐵沉積、脂質(zhì)過(guò)氧化以及鐵死亡發(fā)生[29]。本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PC12細(xì)胞高表達(dá)TFEB后，F(xiàn)TL水平明顯升高，提示高表達(dá)TFEB可以增強(qiáng)細(xì)胞儲(chǔ)鐵能力，從而降低胞漿內(nèi)游離的氧化還原活性鐵，減少氧化應(yīng)激，從這一角度也可證實(shí)TFEB對(duì)鐵死亡的抑制作用。

綜上所述，在PC12細(xì)胞上高表達(dá)TFEB，可降低鐵死亡誘導(dǎo)劑Erastin的毒性作用。同時(shí)，高表達(dá)TFEB可上調(diào)FTL與GPX4蛋白表達(dá)水平，提示TFEB可能通過(guò)增加細(xì)胞鐵儲(chǔ)存、降低細(xì)胞內(nèi)游離鐵水平，抑制鐵死亡，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)初步從鐵代謝的角度探討了TFEB的神經(jīng)保護(hù)作用，為防治PD提供了新思路。然而，TFEB是通過(guò)何種途徑調(diào)節(jié)鐵代謝，以及通過(guò)何種途徑抑制鐵死亡、保護(hù)神經(jīng)元目前尚未可知，仍需進(jìn)一步研究探討其具體作用機(jī)制。