孫梅好， 劉 杰， 袁 熹， 蒲首丞， 鞏菊芳

(浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江 金華 321004)

從古細菌到哺乳動物，乙酰輔酶A(acetyl coenzyme A，Ac-CoA)在多種細胞過程中具有重要功能[1]，作為一種中樞代謝中間體和第二信使，可調(diào)節(jié)細胞分解和合成代謝之間的平衡[2].乙酸是由單甲基和一個末端羧基組成的短鏈脂肪酸[3]，屬于一元羧酸[4].乙酰輔酶A合成酶(acetyl-CoA synthetase，ACS)是具有一定底物特異性的大型酶超家族的成員，催化輔酶A與羧酸之間形成硫酯鍵，同時將ATP水解為AMP和焦磷酸鹽[5-6].ACS活性測定包括2種反應(yīng)終止法：PPi[7]或14C標(biāo)記Ac-CoA[8-10]的定量分析法，以及基于肌激酶、丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶3種偶聯(lián)酶的AMP連續(xù)測定體系[7,11].目前尚缺乏直接連續(xù)測定Ac-CoA的反應(yīng)體系.

醛醇脫氫酶(aldehyde/alcohol dehydrogenase，AdhE)是一種參與革蘭氏陰性細菌無氧代謝的雙功能酶[12].在許多乙醇發(fā)酵微生物中，乙醇生產(chǎn)的最后兩步是醛脫氫酶催化的Ac-CoA生成乙醛和醇脫氫酶催化乙醛生成乙醇.雖然許多醇脫氫酶可以催化醇脫氫反應(yīng)，但能夠催化醛脫氫反應(yīng)的唯一已知酶是AdhE，且該酶具有醛脫氫酶和醇脫氫酶雙結(jié)構(gòu)域[13].AdhE氨基端的結(jié)構(gòu)域與醛脫氫酶高度同源，而羧基端的結(jié)構(gòu)域與Fe2+依賴的醇脫氫酶家族同源，其分別催化Ac-CoA生成乙醛、乙醛生成乙醇[14].該反應(yīng)在發(fā)酵細菌的厭氧氧化還原平衡中具有關(guān)鍵性作用[15]，對于細菌在厭氧狀態(tài)下生產(chǎn)乙醇極為重要[16].

AdhE直接催化Ac-CoA生成乙醇，且在此過程中消耗NADH(ε339=6.22 L·mmol-1·cm-1)，使得以AdhE為偶聯(lián)酶直接連續(xù)測定Ac-CoA成為可能[17].本研究表達、純化了大腸桿菌AdhE，分析了其酶學(xué)動力學(xué)常數(shù)，并以AdhE為偶聯(lián)酶，對ACS酶活進行分析.結(jié)果表明，AdhE可以作為偶聯(lián)酶測定ACS酶活，并建立了直接連續(xù)測定Ac-CoA的反應(yīng)體系.

1 材料與方法

1.1 菌株與載體

大腸桿菌DH5α及BL21(DE3)，原核表達載體His9(源自pGEX-6P-1雙標(biāo)簽表達載體，在PreScission Protease編碼區(qū)和BamH I識別位點之間加入NdeI識別位點，且融合蛋白GST的N端具有6×Histine)等，均保存于浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能實驗室.

1.2 酶與生化試劑

ATP、輔酶A、還原型輔酶I(NADH)購自上海生工生物工程股份有限公司；鎳柱親和層析樹脂購自伯樂生命醫(yī)學(xué)公司；rTaq聚合酶、XhoI、BamH I、ScaI等購自寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；無機焦磷酸酶(PPase)來自大腸桿菌的原核表達、純化[18]；乙酰輔酶A合成酶購自湖北新德晟材料科技有限公司；其他常規(guī)生化試劑為國產(chǎn)分析純.

1.3 方 法

1.3.1AdhE基因克隆、表達與蛋白純化

參照細菌基因組提取試劑盒的使用說明，提取大腸桿菌DH5α基因組DNA.以所提取的基因組DNA為模板，利用PCR技術(shù)(AdhE-F：GGATCCATGGCTGTTACTAATGTCGCTGAAC；AdhE-R：CTCGAGTTAAGCGGATTTTTTCGCTTTTTTC)擴增AdhE基因.在AdhE基因的5′端和3′端分別添加限制性酶切位點BamH I和XhoI.所得PCR產(chǎn)物連接入表達載體His9，獲得載體His9-AdhE，經(jīng)雙酶切驗證和測序驗證序列正確，通過熱激法轉(zhuǎn)化His9-AdhE載體入E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞，獲得AdhE的表達菌株.將表達菌株接種到LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至指數(shù)生長期(OD600=0.6)，加0.5 mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(37 ℃，220 r/min，3 h)；離心收集菌體，加入裂解液裂解45 min后，超聲波破碎菌體至澄清，高速離心后收集上清液.原核表達的AdhE氨基端有多聚組氨酸標(biāo)簽，采用鎳柱親和層析法進行AdhE的分離純化[19].經(jīng)咪唑梯度(25，50，100，150，250 mmol·L-1)洗脫得到AdhE，進一步透析并經(jīng)Bradford法測定蛋白濃度后，存于-80 ℃保存?zhèn)溆?

1.3.2 醛醇脫氫酶(AdhE)活性測定

利用分光光度法(瓦里安UV 4000，安捷倫)測定AdhE酶活.因AdhE催化的2步反應(yīng)中均有NADH參與，通過測定反應(yīng)體系中NADH(ε339=6.22 L·mmol-1·cm-1)在適當(dāng)條件下(pH、溫度)[20-21]光吸度的變化速率[22]，可計算NADH的氧化速率，從而計算出AdhE的活性.AdhE的酶活測定體系為：1 μmol·L-1AdhE，1 mmol·L-1DTT，20 μmol·L-1FeSO4，100 mmol·L-1Tris-HCl(pH7.6)，反應(yīng)溫度為25 ℃.在測定酶的動力學(xué)常數(shù)時，改變其中一個底物濃度，固定另一個底物濃度為10倍Km[23].利用230 μmol·L-1Ac-CoA，分別以不同濃度的NADH(25，75，125，175，225，275，325，375和425 μmol·L-1)起始反應(yīng)并測定NADH的氧化速率.利用0.4 mmol·L-1NADH，分別以不同濃度的Ac-CoA(5，20，40，80，120，160，200和230 μmol·L-1)起始反應(yīng)并測定NADH的氧化速率.利用米氏方程進行數(shù)據(jù)擬合，分別獲得NADH和Ac-CoA的Km及Vmax.

1.3.3 乙酰輔酶A合成酶(ACS)活性測定

ACS催化乙酸與輔酶A合成Ac-CoA，Ac-CoA經(jīng)由足量AdhE催化產(chǎn)生乙醇，同時氧化NADH.通過直接測量OD339隨時間的變化速率，可反映Ac-CoA合成速率，進而反映ACS的催化活性.ACS的酶活測定體系為：20 μmol·L-1AdhE，0.02 mmol·L-1ACS，5 μmol·L-1PPase，1 mmol·L-1DTT，20 μmol·L-1FeSO4，0.32 mmol·L-1CoA，0.4 mmol·L-1NADH，100 mmol·L-1Tris-HCl(pH7.6)，反應(yīng)溫度為35 ℃.根據(jù)前期預(yù)實驗得到的數(shù)據(jù)，利用1 mmol·L-1ATP與0.4 mmol·L-1MgCl2，分別以不同濃度的乙酸(0.2，0.5，0.8，1.0，1.5，2.0，2.5，3.5，4.5，5.3和7.0 mmol·L-1)起始反應(yīng)并測定反應(yīng)體系中NADH的氧化速率.利用7.0 mmol·L-1乙酸與適當(dāng)濃度的MgCl2，分別以不同濃度的ATP(0.04，0.08，0.14，0.21，0.28，0.35，0.42，0.48，0.66，0.84，0.91和1.11 mmol·L-1)起始反應(yīng)并測定NADH的氧化速率.利用米氏方程進行數(shù)據(jù)擬合，分別獲得乙酸和ATP的Km及Vmax.

2 結(jié) 果

2.1 大腸桿菌AdhE基因的克隆以及蛋白質(zhì)的表達純化

AdhE基因的PCR擴增產(chǎn)物連接入載體His9(BamH I和XhoI)，構(gòu)建原核表達載體His9-AdhE.經(jīng)雙酶切和瓊脂糖凝膠電泳驗證，各DNA片段大小與預(yù)期結(jié)果一致(AdhE基因為2 676 bp，His9載體為4 200 bp)(見圖1).AdhE基因序列進一步經(jīng)過測序驗證，經(jīng)大腸桿菌BL21(DE3)表達、親和層析純化獲得分子量為96 kD的AdhE(見圖2).

M：DNA分子量標(biāo)準(kb)；1：未經(jīng)酶切的His 9-AdhE質(zhì)粒； M：蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準；1：誘導(dǎo)前菌體；2：誘導(dǎo)后菌體；2：雙酶切驗證各條帶 3：裂解后上清；4：純化后目的蛋白

2.2 AdhE的動力學(xué)常數(shù)測定

為了分析AdhE的酶學(xué)動力學(xué)常數(shù)，分別測定在不同NADH和Ac-CoA濃度條件下的反應(yīng)速率，利用米氏方程進行擬合(見圖3)，獲得由AdhE催化的依賴NADH的Ac-CoA還原反應(yīng)kcat為13.8 min-1，NADH和Ac-CoA的Km值分別為(73.4±6.5)和(52.8±6.0) μmol·L-1(見表1).

a：不同NADH底物濃度對反應(yīng)速率的影響；b：不同Ac-CoA底物濃度對反應(yīng)速率的影響

表1 AdhE的動力學(xué)常數(shù)

2.3 ACS的動力學(xué)常數(shù)測定

為了分析ACS的酶學(xué)動力學(xué)常數(shù)，以AdhE為偶聯(lián)酶，分別測定在不同乙酸和ATP濃度條件下的反應(yīng)速率，利用米氏方程進行擬合(見圖4)，獲得由ACS催化的Ac-CoA合成反應(yīng)kcat為10.5 min-1，乙酸和ATP的Km值分別為(1.31±0.17) mmol·L-1和(150.1±14.70) μmol·L-1(見表2).

a：不同乙酸底物濃度對反應(yīng)速率的影響；b：不同ATP底物濃度對反應(yīng)速率的影響

3 討 論

AdhE具有醛脫氫酶和醇脫氫酶雙功能域，其醛脫氫酶結(jié)構(gòu)域催化Ac-CoA還原生成乙醛，而醇脫氫酶結(jié)構(gòu)域催化乙醛還原生成乙醇.本工作成功表達、純化了大腸桿菌AdhE，并分析了該酶在有氧狀態(tài)下的酶學(xué)活性為0.15 U/mg，此結(jié)果與文獻[14]等報道的大腸桿菌AdhE(0.08 U/mg)、Peng等[24]報道的嗜熱乙醇桿菌(Thermoanaerobacterethanolicus)AdhE(0.17 U/mg)及Chen等[25]報道的痢疾阿米巴(Entamoebahistolytica)AdhE(0.15 U/mg)的酶學(xué)活性一致.Membrillo-Hernandez等[14]報道大腸桿菌AdhE在無氧狀態(tài)下的酶活為有氧狀態(tài)下的10倍，而醛脫氫酶結(jié)構(gòu)域內(nèi)2個氨基酸殘基突變(A267T，E568K)顯著提高有氧狀態(tài)下的AdhE酶活.在氧氣存在條件下，醛脫氫酶結(jié)構(gòu)域的酶活性降低成為限速步驟，致使整個AdhE的活性在有氧狀態(tài)下降低.此結(jié)果與Extance等[26]報道的嗜熱葡糖苷酶芽孢桿菌(Geobacillusthermoglucosidasius)AdhE的活性測定結(jié)果一致.醛醇脫氫酶在許多發(fā)酵細菌的厭氧氧化還原平衡中起關(guān)鍵作用，不同的發(fā)酵細菌由于不同的生命活動需要，其AdhE活性具有較大差別，并且同一種AdhE的活性在有氧與無氧狀態(tài)下也有較大差距，科學(xué)家們認為這是由細菌的代謝需求和長期進化所決定的[14,22,24-28].

表2 ACS的動力學(xué)常數(shù)

ACS活性的測定方法有2種終止法和1種連續(xù)測定法.基于偶聯(lián)酶的連續(xù)測定法作為酶活的測定方法被廣泛運用[29]，ACS的連續(xù)測定需要肌激酶、丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶3種偶聯(lián)酶測定AMP的產(chǎn)生速率，具有較大的延遲時間.基于AdhE的酶學(xué)特性，本研究通過偶聯(lián)酶法與分光光度法聯(lián)用成功連續(xù)測定ACS產(chǎn)物Ac-CoA的合成速率.

由于有氧條件下AdhE活性受到一定程度的抑制[30]，導(dǎo)致酶活性較低，所以篩選、純化氧氣耐受AdhE，進一步優(yōu)化基于大腸桿菌AdhE偶聯(lián)酶測定體系，將為產(chǎn)Ac-CoA的丙酮酸脫氫酶、脂肪酸β氧化酶系、硫解酶等多種酶活測定奠定基礎(chǔ).